Inget kan dofta ur inget

Restaurang- och hotellhögskolan,
Örebro Universitet
Inget kan dofta ur inget
Identifiering av Enterobacteriaceae-arter isolerade från
fyra opastöriserade franska mögel- och kittostar
Datum: 15 oktober 2014
Författare: Magnus Westling
Kurs: Självständigt arbete, avancerad nivå
Handledare: Wilhelm Tham
Kursnummer: MÅ4003
Examinator: Marianne Pipping Ekström
Provkod: 0100
Betygsbedömd den:
Betyg:
Örebro Universitet
Restaurang- och hotellhögskolan
15 oktober 2014
Kursnamn: Självständigt arbete, avancerad nivå
Kursnummer: MÅ4003
Provkod: 0100
Författare: Magnus Westling
Handledare: Wilhelm Tham
Examinator: Marianne Pipping Ekström
Sammanfattning
Syftet med denna magisteruppsats är att gå vidare med resultat från en kandidatuppsats (Westling,
2013) gällande opastöriserade franska mögel- och kittostar genom att undersöka vilka
Enterobacteriaceae-arter som ett urval av de analyserade ostarna innehöll. API 20E används som
identifieringssystem. Tre Enterobacteriaceae-arter gav acceptabel till utmärkt identifiering av 40
analyserade isolat från de fyra ostarna, nämligen Hafnia alvei, Escherichia coli och Klebsiella
pneumoniae. Inga skillnader mellan de identifierade arterna vad gäller inverkan på smak- och
doftupplevelser hos opastöriserade franska mögel- och kittostar gick att urskilja med tillgänglig
sensorisk data från kandidatuppsatsen (Westling, 2013). Utifrån denna magisteruppsats räcker det
inte med att dofta på ostarna för att säkerställa hygienisk kvalitet, ytterligare undersökningar behövs
för att kunna identifiera vilka Enterobacteriaceae-arter de innehåller. Däremot skulle en förstudie i
form av en sensorisk bedömning av opastöriserade mögel- och kittostar kunna påvisa om ett högt
antal Enterobacteriaceae föreligger, vilka vid konsumtion kan vara sjukdomsframkallande.
Nyckelord: Livsmedelshygien, sensorik, Hafnia alvei, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae.
Innehållsförteckning
Innehållsförteckning
3
Introduktion
8
Ämnesrelevans i relation till måltidskunskap och värdskap
8
Livsmedelshygien
8
Tvärvetenskap
9
Reflektioner avseende ämnesrelevans
9
Teoretisk bakgrund
Hantverksmässig osttillverkning
Bakteriefamiljen Enterobacteriaceae i opastöriserade mögel- och kittostar
9
9
10
Kortfattat om bakterier
10
Bakteriefamiljen Enterobacteriaceae
10
Koliforma bakterier
11
Smak- och doftupplevelser producerade i ostar av Enterobacteriaceae
12
Bildning av nya aromatiska föreningar
12
Enterobacteriaceae och biogena aminer
13
Enterobacteriaceae som hygienindikator i opastöriserade mögel- och kittostar
Syfte och frågeställningar
Frågeställningar
14
14
15
Metod och material
15
Litteratursökning
15
Metodval
15
Material
16
Metod för analys av datan
16
Forskningsetisk planering
17
Resultat
17
Identifiering av Enterobacteriaceae 37°C och 44°C
Kvantifiering av de identifierade arterna
De identifierade arterna kopplade till sensoriska resultat
Diskussion
Diskussion av resultatet
Arternas förmåga att påverka smak- och doftupplevelser i ostar
18
19
20
21
21
22
Kadaverin och putrescin
24
Tyramin och histamin
24
Svavelföreningar och alkoholer
25
Arternas eventuella sjukdomsframkallande egenskaper
26
Escherichia coli
26
Klebsiella pneumoniae
27
Hafnia alvei
28
Värdering av det sammanfattade materialet
28
Metod- och materialdiskussion
29
Forskningsetisk uppföljning
30
Slutsatser
30
Praktisk användning och vidare forskning
30
Vidare forskning
31
Tillkännagivande
32
Referenslista
33
Bilaga 1. Artikeldatabassökning
Bilaga 2. Informationsblad om uppsatsprojektet
Förord
Tack Wilhelm och Marie-Louise för utan er hade denna uppsats inte varit möjlig.
Definitioner
Adhesiner: Komponenter på bakteriecellers ytor som underlättar vidhäftning till värdceller
(Madigan, Martinko, Stahl & Clark, 2011).
API 20E: Ett standardiserat system som identifierar Enterobacteriacae-arter samt andra ickejäsande gramnegativa bakteriearter genom 20 stycken olika konventionella biokemiska tester.
Biofilmer: Mikrobiella kolonier inneslutna i ett lim och fästa vid en yta (Madigan et al., 2011).
Citrulin: En aminosyra som spelar en roll i ureacykeln.
Cytolytiska toxin: Mikrobiellt ämne som förstör celler genom att generera porer i cellmembran.
Dekarboxylering: Avlägsnande av en karboxylgrupp från en kemisk förening.
Enterobacteriaceae: Bakteriefamilj som finns i den normala tarmfloran hos människor och
djur och även i bakteriefloran i opastöriserad mjölk och produkter därav.
Fagocytos: Förmågan hos en cell att ta upp större molekyler och bryta ned dessa till mindre.
Flageller: Ett fintrådigt organ som ger bakterier rörlighet genom att rotera (Madigan et al., 2011).
Hemolysiner: Bakteriella toxiner med förmåga att lysera röda blodkroppar.
HG: Förkortning för engelskans hybridization group (fritt översatt: hybridiseringsgrupp).
Hybridisering innebär basparning av DNA eller RNA från två olika (men relaterade) källor. En
bakterieart kan definieras som en hybridiseringsgrupp.
In vitro: Term inom biomedicinsk vetenskap som anger att experiment eller iakttagelser är gjorda i
en konstgjord miljö och inte i en levande kropp (Nationalencyklopedin, 2014b).
Kapsel: En tät polysackarid eller ett proteinskikt som tätt omger en cell (Madigan et al., 2011).
Lipopolysackarider: Komplexa fettstrukturer innehållande sockerarter och fettsyror som finns i
de flesta gramnegativa bakterier och utgör den kemiska strukturen hos det yttre membranet
(Madigan et al., 2011).
Lysin: En essentiell aminosyra hos människor.
Ornitin: En aminosyra som spelar en roll i ureacykeln.
Pastörisering: Uppvärmning av livsmedel till en viss temperatur under en viss tid som dödar
sjukdomsalstrande och produktförstörande mikroorganismer (Nationalencyklopedin, 2014c).
P-pili: Tunna, trådliknande utskott som fungerar som kontaktorgan och deltar i DNA-överföring
under konjugering (Madigan et al., 2011).
Quorum sensing: Ett regelverk som övervakar populationsstorlek och styr genuttrycket baserad
på celltäthet (ibid.).
Sideroforer: Kan binda järn i mycket låga koncentrationer (Madigan et al., 2011).
Verotoxiner: Mikrobiellt ämne som kan ge njursvikt och det livshotande tillståndet hemolytiskturemiskt syndrom.
Virulensfaktorer: Förmågor hos bakterier att framkalla sjukdom (Madigan et al., 2011).
Zoonos: En sjukdom, främst hos djur, som ibland överförs till människor (ibid.).
Introduktion
I en tidigare kandidatuppsats (Westling, 2013) visades att antalet bakterier tillhörande familjen
Enterobacteriaceae korrelerade positivt och signifikant med intensiteten av smak- och
doftupplevelserna gödsel, bitter, stickande, metallisk och ammoniak från opastöriserade franska
mögel- och kittostar. Då uppstod frågeställningen om det är möjligt att använda människan som
mätinstrument för att urskilja höga halter av eventuella sjukdomsframkallande bakterier i mögeloch kittostar som är tillverkade på opastöriserad mjölk. Om det vore möjligt skulle tillverkare av
traditionella ostar kunna kontrollera hygienisk kvalitet på ett kostnadseffektivt sätt. Men detta
resonemang behöver vidare studier för att utröna om metoden kan vara pålitligt eller inte. Därför
sparades bakterie-isolat från kandidatuppsatsen (Westling, 2013) i kylskåp för framtida
undersökningar.
I denna magisteruppsats artbestämdes de sparade isolaten av Enterobacteriaceae med hjälp av API
20E. Syftet var att undersöka vilka Enterobacteriaceae-arter ett urval av ostarna innehöll. I
uppsatsen diskuteras de egna fynden i relation till litteraturuppgifter vad gäller olika
Enterobacteriaceae-arters förmåga att påverka smak- och doftupplevelser i opastöriserade mögeloch kittostar samt bakteriernas eventuella sjukdomsframkallande egenskaper. Denna
magisteruppsats blir därmed en fördjupning av kandidatuppsatsen. Magisteruppsatsen bidrar till nya
frågeställningar om metoden att använda människan som mätinstrument för att kontrollera
hygienisk kvalitet på opastöriserade mögel- och kittostar kan vara pålitlig eller inte.
Ämnesrelevans i relation till måltidskunskap och värdskap
Livsmedelshygien
Vid Restaurang- och hotellhögskolan (RHS) har undervisning i livsmedelshygien bedrivits sedan
1987 och funnits som egen disciplin sedan 2006 (Danielsson-Tham, 2008). En av de tre
forskningscirklarna vid RHS är hälsosam, säker och hållbar måltid (Örebro universitet, 2012).
Utifrån ett samhälleligt perspektiv blir livsmedelshygien allt viktigare med en åldrande befolkning
som ställer högre krav på hygieniska måltider för att förhindra åldersrelaterade sjukdomar. Det är
därutöver oförsvarbart och åtminstone samhällsekonomiskt ineffektivt att servera mat som
människor blir sjuka av. Med bakgrund av dessa resonemang utgör livsmedelshygien en viktig del
vid diskussioner kring hälsosam, säker och hållbar måltid. Livsmedelshygien handlar om att
förhindra livsmedelsburna sjukdomar från jord till bord. Detta omfattade område inkluderar
!8
kunskaper om patogena eller produktförstörande mikroorganismer, tillsatser, redlighet i
livsmedelskedjan, egenkontroll, HACCP, certifieringssystem samt bestämmelser kring import och
export av livsmedel. Sammanfattningsvis så handlar livsmedelshygien om att våra livsmedel skall
vara säkra för konsumenterna. I denna magisteruppsats ligger fokus på livsmedel som ofta finns i
gårdsbutiker, d.v.s. traditionellt tillverkade ostar som kan utgöra hälsorisker (läs mer i
Hantverksmässig osttillverkning nedan).
Tvärvetenskap
Gustafsson (2004), Sveriges första professor i måltidskunskap, beskriver ämnet “Måltidskunskap
och värdskap” som tvärvetenskapligt. Tvärvetenskap handlar om att förstå olika typer av kunskap
och att integrera dessa (Miljökommittén, 2009). I denna magisteruppsats är utgångspunkten att
bakteriefamiljen Enterobacteriaceae påverkar smak- och doftupplevelser av opastöriserade mögeloch kittostar (Westling, 2013), ett tvärvetenskapligt perspektiv där livsmedelshygien, vid
problemformuleringen, integrerar med sensorik och sinnesupplevelser.
Reflektioner avseende ämnesrelevans
Kandidatuppsatsens resultat (Westling, 2013) fördjupas i denna magisteruppsats genom
användningen av API 20E som identifieringssystem för att artbestämma Enterobacteriaceae-isolat
från ett urval av opastöriserade franska mögel- och kittostar. Liknande studier finns som behandlar
doft- och smakkomponenter producerade av Enterobacteriaceae i opastöriserade ostar men de
använder oftast kemiska analysinstrument såsom gaskromatografi-masspektrometri (Bos, Sterk &
Schultz, 2013). Denna magisteruppsats baseras på kvantitativa beskrivande sensoriska resultat i
form av smakupplevelser där människan användes som analysinstrument.
Teoretisk bakgrund
Nedan följer först en sammanfattande presentation av hantverksmässig osttillverkning kopplat till
livsmedelshygien och sensorik. Därefter följer mer detaljerade presentationer om
Enterobacteriaceae i opastöriserade mögel, och kittostar samt smak- och doftupplevelser
producerade i ostar av Enterobacteriaceae. Avsnittet avslutas med Enterobacteriaceae som
hygienindikator i opastöriserade mögel- och kittostar.
Hantverksmässig osttillverkning
Praktisk kunskap om osttillverkning går att spåra åtminstone två tusen år tillbaka i tiden i
Columellas avhandling om lantbruk (2009). I avhandlingen (ibid.) går det att läsa om hur den råa
!9
mjölken innan koagulering skulle hållas i ett kärl vid en eld och därefter skulle vasslen separeras
från ostmassan så fort som möjligt samt att ostmassan skulle förvaras på de renaste hyllorna så
osten inte blev förstörd (Fox, McSweeney, Cogan & Guinee, 2004). Det står även att ostar med en
mjuk konsistens måste säljas så snabbt som möjligt medan ostar med en hård konsistens kan lagras
en längre period (ibid.). Idag anses mognadslagrade ostar (minst 60 dagar) tillverkade på
opastöriserad mjölk vara mindre farliga utifrån matförgiftningssynpunkt (Knoll, 2005), genom att
en kombination av stressfaktorer (såsom vattenaktivitet och pH-värde) påverkar
tillväxtmöjligheterna för mikroorganismer negativt (Maifreni et al., 2013). Men mögel- och kittostar
tenderar att ha en hög vattenaktivitet som istället gynnar bakterietillväxten, vilket har visats vid
flera livsmedelsburna infektionsutbrott (De Buyser, Dufour, Barbara, Murielle & Lafarge, 2001;
Danielsson-Tham et al., 2004; Oliver, Boor, Murphy, & Murinda, 2009; Langer et al., 2012)
Mognadslagringen av ostar tillverkade på opastöriserad mjölk bidrar även med karaktär när
bakteriefamiljen Enterobacteriaceae tillväxer och producerar nya smaker (Morales, Feliu,
Fernández-García & Nuñez, 2004; Chavez-López et al., 2006), något som av konsumenten kan
upplevas positivt (Chambers, Esteve & Retiveau, 2010; Colonna, Durham & Meunier-Goddik,
2011) och associera till hantverksmässig tillverkning (Carpino, 2004a; Carpino 2004b; Licitra,
2010).
Bakteriefamiljen Enterobacteriaceae i opastöriserade mögel- och kittostar
Kortfattat om bakterier
Bakterier är så små (ungefär 0,01 mm stora) att de inte går att urskilja med det mänskliga ögat
(Madigan et al., 2011). Men om de förstoras med t.ex. ett mikroskop så går det att se dem. Man kan
odla bakterier på fast medium, t.ex. blodagar eller selektiv agar vid 37°C. Efter 1–2 dygn kan man
urskilja kolonier som är ungefär 2 mm i diameter (ibid.). Genom att räkna antalet kolonier (colonyforming units) får man ett mått på antalet livsdugliga bakterier i livsmedlet (Madigan et al., 2011).
Varje koloni består av 1–10 miljoner bakterier som är kopior av den bakteriecell som de utgick från
(ibid.).
Bakteriefamiljen Enterobacteriaceae
Bakteriefamiljen Enterobacteriaceae (Rahn, 1937) består av gram-negativa bakterier och utgörs av
ett femtiotal släkten med ännu fler arter, varav ett flertal ingår i den normala tarmfloran hos
människor och djur (Baylis, Uyttendaele, Joosten & Davies, 2011). Det finns stora skillnader mellan
!10
de ingående arterna men gemensamt för alla Enterobacteriaceae-arter är att de inte bildar sporer
samt att de kan växa i både närvaro och frånvaro av syre (ibid.). Många arter kan orsaka förruttnelse
av en mängd olika livsmedel, inklusive frukt och grönsaker, kött, fågel, ägg, mjölk och
mejeriprodukter samt fisk och andra skaldjur (Baylis et al., 2011). Denna allmänna utbredning av
bakteriefamiljen innebär att det är oundvikligt att Enterobacteriaceae-arter kommer in i
livsmedelskedjan och av och till blir ansvariga för livsmedelsburna sjukdomar och att mat förstörs
och därmed bidrar till betydande ekonomiska förluster och svinn (ibid.). Förekomsten av
Enterobacteriaceae i opastöriserad mjölk är oundviklig på grund av kontaminering under
mjölkningsprocessen (Kousta, Mataragas, Skandamis & Drosinos, 2010; Maifreni et al., 2013).
Men vid ordentlig rengöring och desinfektion under mjölkning i kombination med kortare tider
mellan mjölkning, leverans och lämplig kylning, kan antalet minskas markant (ibid.). Däremot
anses Enterobacteriaceae vara en del av den naturliga bakteriefloran i många ostar, särskilt vad
gäller hantverksmässiga ostar tillverkade av opastöriserad mjölk (Parente & Cogan, 2004). Men ett
högt antal av Enterobacteriaceae är vanligtvis ett tecken på dålig hygienisk hantering (Tham &
Danielsson-Tham, 2014).
Koliforma bakterier
Koliforma bakterier är en vanligt förekommande indikatorbakterie som används som ett mått på den
hygieniska kvaliteten på livsmedel och vatten (Madigan et al., 2011). Koliforma bakterier definieras
enligt Nationalencyklopedin (2014a) som “alla aeroba och fakultativt anaeroba, gramnegativa, icke
sporbildande, stavformiga bakterier som förjäser laktos med gasbildning inom 48 timmar vid
37 °C”. De släkten som normalt betraktas som koliforma bakterier inkluderar Enterobacter,
Klebsiella, Citrobacter och Escherichia, speciellt arten E. coli (Baylis et al., 2011). Dock kan andra
arter som Hafnia alvei – vilken visar fördröjd eller variabel laktosjäsning – och stammar tillhörande
släkten såsom Buttiauxella, Leclercia, Pantoea, Serratia, Yersinia ingå bland de koliforma
bakterierna (se Figur 1).
!11
Figur 1. Enterobacteriaceae-släkten uppdelade utifrån deras förmåga att fermentera laktos: (a) de
flesta arter fermenterar inte laktos, men vissa undantag finns; (b) vissa arter fermenterar laktos, de
är inte typiska koliforma bakterier men en del betraktas som koliforma bakterier (beroende på
vilken definition som används); (c) hög andel fermenterar laktos, de betraktas traditionellt som
typiska koliforma bakterier (Baylis et al., 2011). De streckade cirklarna visar släkten som inkluderar
arter eller stammar som ofta pendlar mellan två kategorier (ibid.).
Smak- och doftupplevelser producerade i ostar av Enterobacteriaceae
Bildning av nya aromatiska föreningar
När det gäller smak- och doftupplevelser i opastöriserade ostar menar Montel et al. (2014) att dessa
i allmänhet har större mängder aromatiska föreningar såsom syror, aldehyder, alkoholer, estrar och
svavelföreningar med undantag för vissa ketoner, än pastöriserade. De aromatiska föreningarna
härrör från olika metaboliska reaktioner såsom såsom citrat-, laktat-, fettsyra-, aminosyrakatabolism, lipolys och nedbrytning av kasein (se Figur 2) samt oxidativ metabolism som sker på
ytan av ostarna medan fermentativ metabolism sker inuti ostarna (Montel et al., 2014). För att
komplicera det ytterligare kan flera bakteriearter samarbeta i metaboliska vägar (Arfi et al., 2002;
Smit et al., 2005), däremot finns det inga sammanställda uppgifter som förklarar hur ostarnas
ekosystem fungerar, vilka är särskilt komplexa i ostar tillverkade på opastöriserad mjölk på grund
av den varierande sammansättningen av mikroorganismer (Montel et al., 2014).
!12
Figur 2. Biokemiska reaktioner som sker under ostmognad och leder till bildning av nya aromatiska
föreningar (Marilley & Casey, 2004).
Ostar tillverkade på pastöriserad mjölk har lägre halter av mjölkens naturliga mikroflora och
tillhörande enzymer såsom proteser och lipaser (Hayes et al., 2001; Hickey et al., 2007), vilka alla
är involverade i bildandet av de speciella smak- och doftupplevelser hos opastöriserad mjölk och
produkter tillverkade därav (Montel et al., 2014). Pastörisering påverkar även bitterheten, men på
olika sätt beroende på ostsort, genom att ändra balansen mellan produktion och nedbrytning av
bittra peptider (Bouvier et al., 1997).
Enterobacteriaceae och biogena aminer
Trots de traditionellt tillverkade ostarnas komplexa ekosystem har ett högt antal Enterobacteriaceae
kunnat korrelerats med höga koncentrationer av kadaverin i ostar (Marino, Maifreni, Moret &
Rondinini, 2000). Kadaverin är en biogen amin som bildas genom bakteriell dekarboxylering av
aminosyrorna ornitin och lysin och avger en doft som kan associeras till död (Hussain et al., 2013).
Även putrescin är en biogen amin men som bildas genom bakteriell dekarboxylering av ornitin och
avger en illaluktande doft (ibid.), som först upptäcktes i ruttnande kött (NE, 2014). De flesta
Enterobacteriaceae-arter har förmågan att dekarboxylera både lysin och ornitin, med följd att
kadaverin och putrescin bildas (Chaves-López et al., 2006; Pircher, Bauer, Paulsen, 2007). Med
andra ord, höga halter av kadaverin och/eller putrescin i ostar kan kopplas till förekomsten av ett
högt antal Enterobacteriaceae (Marino et al., 2000). Användning av extremt högkvalitativ
opastöriserad mjölk och god hygienpraxis under tillverkning garanterar inte en ost utan biogena
!13
aminer eller med lägre halter (Roig-Sagués, Molina & Hernández-Herrero, 2002), även om halterna
minskar (Maifreni et al., 2013). Användning av lämpliga startkulturer som konkurrerar med
aminbildande vilda mikroorganismer, eller som har förmåga att metabolisera de bildade biogena
aminer, kan vara ett bra alternativ (Roig-Sagués, Molina & Hernández-Herrero, 2002). Men för att
förhindra ett högt innehåll av dessa biogena aminer liksom ett högt antal av de bakterier som
producerar dessa föreningar under mognaden av ostar tillverkade på opastöriserad mjölk, såsom
enterokocker och Enterobacteriaceae (ibid.), behöver övervakning ske (Özoğul, 2004).
Enterobacteriaceae som hygienindikator i opastöriserade mögel- och kittostar
Enligt Giammanco et al. (2011) kan kvaliteten på ystmjölken såväl som den hygieniska statusen
under tillverkning, paketering och hantering av ost, bedömas genom att analysera antalet
Enterobacteriaceae i ostprover. Även Chaves-López et al. (2006) menar att Enterobacteriaceae är
en indikator för mikrobiologisk kvalitet hos ostar. Eftersom flera bakteriearter av icke-fekalt
ursprung ingår i bakteriefamiljen Enterobacteriaceae, lämpar sig Enterobacteriaceae 37°C främst
som en hygienindikator och i mindre mån som indikator på fekal förorening. Eftersom
Enterobacteriaceae 37°C är ett relativt trubbigt och oprecist begrepp kan det i vissa fall vara svårt
att dra några slutsatser om livsmedlets beskaffenhet utifrån denna parameter. Flera arter inom denna
familj förekommer naturligt på många råvaror och därmed även i flera livsmedel.
Trots detta står det i förordning (EG) nr 2073/2005 om mikrobiologiska kriterier för livsmedel att
Enterobacteriaceae skulle kunna användas som riskindikator vid rutinövervakning i såväl
tillverkningsmiljön som i slutprodukten. I samma förordning står det att livsmedelsföretagarna bör
ha möjlighet att använda andra analysmetoder än referensmetoderna, särskilt snabbmetoder,
förutsatt att användningen av dessa alternativa metoder ger jämförbara resultat (ibid.). Trots att
bedömarna i kandidatuppsatsen (Westling, 2013) inte var några experter på ostar eller fick någon
annan träning än en testomgång, visar resultaten att panelen kunde uppleva olika intensitet av smakoch doftupplevelserna gödsel, bitter, stickande, metallisk och ammoniak som korrelerade med
antalet Enterobacteriaceae 37°C.
Syfte och frågeställningar
Syftet med denna magisteruppsats är att gå vidare med resultat från en kandidatuppsats gällande
opastöriserade franska mögel- och kittostar (Westling, 2013) genom att undersöka vilka
Enterobacteriaceae-arter som ett urval av de analyserade ostarna innehöll.
!14
Frågeställningar
• Vilka arter av familjen Enterobacteriaceae kan påvisas i ostarna?
• Hur är de olika Enterobacteriaceae-arternas förmåga att påverka smak- och doftupplevelser
i opastöriserade mögel- och kittostar?
• Vilka är dessa bakteriers eventuella sjukdomsframkallande egenskaper?
Metod och material
I denna magisteruppsats artbestäms Enterobacteriaceae-isolat från tidigare undersökta
opastöriserade franska mögel- och kittostar (Westling, 2013) med API 20E-remsor.
Litteratursökning
En systematisk litteraturgenomgång (Bryman, 2011) genomfördes med inklusions- och
exkluskionskriterier samt med olika sökord, som därutöver förekom i olika kombinationer, för att
filtrera urvalet (Bilaga 1). Sökningen gjordes framförallt genom Summon som finns tillgänglig på
Örebro universitets hemsida (http://oru.summon.serialssolutions.com), vilket gav ett brett
träffspektrum av tvärvetenskapliga studier genom att denna söktjänst innehåller en samling av olika
databaser. Två inklusionskriterier valdes vid artikelsök, nämligen att de ska vara publicerade i en
vetenskaplig tidskrift samt finnas i fulltext (med vissa undantag). Tre exklusionskriterier valdes vid
artikelsök, nämligen de artiklar som inte har en engelsk sammanfattning, som inte är relevanta för
uppsatsens syfte samt de artiklar som inte innehåller något av sökorden. Artiklar som författaren har
tillgång till sedan tidigare samt artiklar eller andra dokument som har hittats på andra sätt än genom
den systematiska litteraturgenomgången, t.ex. andra studiers referenser, användes också. I de fall då,
intressanta studier inte fanns tillgängliga i fulltext genom Summon, söktes dessa genom Google
eller Google Scholar (https://www.google.se/; http://scholar.google.se). Eventuella böcker och
avhandlingar söktes genom den nationella bibliotekskatalogen Libris.
Metodval
API 20E är ett standardiserat system som identifierar Enterobacteriacae-arter och andra
gramnegativa bakteriearter inom 18-24 timmars inkubationstid genom 20 stycken olika
konventionella biokemiska tester (bioMérieux, 2013). API 20E-systemet består av en testremsa med
!15
mikrorör som innehåller torkade substrat (ibid.). I varje rör tillsätts den aktuella bakterien i form av
en suspension. Det fins tre olika API-kits för identifiering av Enterobacteriaceae; ett kontrollpaket
med 10 tester (10S), ett baspaket med 20 tester (20E) och ett paket för vidare identifiering av en
organism med 50 tester (50E) (Holmes, Willcox & Lapage, 1978). De tjugo tester som ingår i API
20E är grupperade om tre förutom de två sista testerna. Svaret från testerna blir antingen positivt
eller negativt, beroende på om reaktionen sker och om den gör det i tillräcklig utsträckning.
Reaktionerna omvandlas till poäng beroende på hur mönstret av positiva och negativa resultat blir
för respektive grupp, vilket slutligen ger en sifferkombination av nio olika siffror (remsan består av
nio grupper). För att få en unik poäng för varje testmönster, används ett positionsbaserat talsystem
där en positiv reaktion ger ett poäng i det första röret i varje grupp, två poäng i det andra röret och
fyra poäng i det tredje röret. Poängen kan därmed variera från 0 till 7 i varje grupp.
Anledningen till att just detta identifieringssystem valdes är dels utifrån ett ekonomiskt perspektiv,
dels utifrån möjligheten att kunna skicka in isolaten till ett utomstående laboratorium som gör en
fullständig analys men detta går långt utanför magisteruppsatsens ekonomi. API 20E har funnits i
flera decennier och används än idag som analysinstrument, mycket tack vare dess snabba resultat
och tillförlitlighet samt dess elektroniska databas med ett uppdaterat utbud olika
Enterobacteriaceae-arter.
Material
Utifrån ett livsmedelshygieniskt perspektiv är isolat av Enterobacteriaceae 44°C intressantast då
dessa utgör en större risk för att utgöra sjukdomsframkallande arter än Enterobacteriaceae 37°C.
Eftersom det var önskvärt att artbestämma fem olika isolat per ost utifrån ett bakteriologiskt
perspektiv (för att ge ett godtagbart resultat), valdes de ostar där minst fem kolonier av
Enterobacteriaceae 44°C hade isolerats. Både Enterobacteriaceae 37°C och 44°C artbestämdes,
vilket gav totalt tio isolat per ost. Isolat från fyra ostar ingick i denna magisteruppsats, vilket krävde
totalt 40 stycken API 20E-remsor. P.g.a. begränsad ekonomi för denna magisteruppsats kunde inte
fler API 20E-remsor användas.
Metod för analys av datan
Enterobacteriaceae-isolaten förvarades i kyl (4°C) i form av stickinokulationer i rör med
näringsagar. Vid studiens början ströks isolaten på blodagarplatta och inkuberades i 30°C under 24
(±2) timmar. En koloni från respektive isolat överfördes med en steril plastögla till 9 ml fysiologisk
!16
saltlösning som sedan blandades med hjälp av Vortex-Genie 2 under fem sekunder. Direkt efter
denna blandning användes en ny steril 1 ml-pipett för att överföra bakteriesuspensionen till varje rör
på API 20E-remsan. Detta förfarande följdes för samtliga isolat. API 20E-remsorna med
utspädningar och mineralolja enligt instruktioner, inkuberades i 37°C under 24-48 timmar. Efter
inkubation tillsattes järnklorid, kaliumhydroxid 40% och alfa-Naftol 6% samt Kovacs reagens enligt
anvisningar. Färger och former för respektive rör jämfördes med den skriftliga beskrivningen som
medföljde API 20E-paketet samt med en färgkontroll (se Figur 3) från tillverkarens hemsida
(https://apiweb.biomerieux.com). Resultatet skrevs in på samma hemsida där programmet API 20 E
V4.1 användes, vilket gav en profil och ett mått på hur acceptabel profilen var. Resultaten skrevs ut
på papper och sparades på författarens kontor. Ordnings- och skyddsföreskrifter vid arbete på
Livsmedelsmikrobiologiska laboratoriet, Restaurang- och hotellhögskolan (rum K1131 och 1135),
följdes.
Figur 3. API 20 E-remsan, färgkontroll som visar på negativa resultat i samtliga rör.
Forskningsetisk planering
För magisteruppsatsen har både ett livsmedelshygieniskt och ett sensoriskt laboratorium stått till
förfogande. Uppsatsens handledare som är professor i livsmedelsmikrobiologi finns tillgänglig för
handledning under den tid som uppsatsen planeras att skrivas. Inga människor eller djur används i
denna magisteruppsats. Hälsan hos Restaurang- och hotellhögskolans personal och studenter
äventyras ej för denna magisteruppsats eftersom API 20E-remsor används som materialinsamling i
ett livsmedelshygieniskt laboratorium där ordnings- och skyddsföreskrifter följs (se ovan).
Resultat
Tre Enterobacteriaceae-arter gav acceptabel till utmärkt identifiering av 40 analyserade isolat från
de fyra ostarna (Tabell 1 och 2). De tre arterna var Hafnia alvei, Escherichia coli och Klebsiella
pneumoniae (ibid.). Inga skillnader mellan de identifierade arterna vad gäller inverkan på smak- och
doftupplevelser hos opastöriserade franska mögel- och kittostar gick att urskilja (se Figur 4) med
!17
tillgänglig sensorisk data från kandidatuppsatsen (Westling, 2013). Tre av ostarna innehöll H. alvei i
ett antal över 107 log10 CFU/g (Tabell 3). En av ostarna innehöll E. coli i ett antal av 103 log10 CFU/
g, vilket är otillfredsställande enligt förordning (EG) nr 2073/2005 om mikrobiologiska
kvalitetskriterier för ostar tillverkade av mjölk eller vassle som har genomgått värmebehandling1
(Tabell 4).
Identifiering av Enterobacteriaceae 37°C och 44°C
Samtliga Enterobacteriaceae 37°C-isolat från de fyra utvalda ostarna identifierades som H. alvei
(Tabell 1). Samtliga Enterobacteriaceae 44°C-isolat från tre av de utvalda ostarna identifierades
som E. coli, medan i den fjärde osten utgjordes tre av fem isolat av K. pneumoniae subspecies
ozaenae (Tabell 2). De övriga två isolaten från samma ost identifierades med låg diskriminering
(ibid.).
Tabell 1. Identifiering (API 20E) av 20 stycken isolat av Enterobacteriaceae 37°C från fyra ostar.
Ost
Signifikanta
taxa
Antalet (st) isolat (I-V) med % identifiering (ID):
God identifiering
97,1%
Mycket god identifiering
99,3%
Utmärkt identifiering
99,9%
820
Hafnia alvei 1
4/5* (II-V)
685
Hafnia alvei 1
5/5 (I-V)
139
Hafnia alvei 1
5/5 (I-V)
8
Hafnia alvei 1
3/5 (I, II, IV)
2/5 (III, V)
* = Fyra isolat identifierades med API 20E, en av de fem isolaten tillväxte ej.
1
Gränsvärden för E. coli i ostar framställda av obehandlad mjölk saknas (Europakommissionen,
2005) då införandet av kriterier inte anses öka livsmedelssäkerheten eftersom bakterien
förekommer sporadiskt (Livsmedelsverket, 2007).
!18
Tabell 2. Identifiering (API 20E) av 20 stycken isolat av Enterobacteriaceae 44°C från fyra ostar.
Ost
Signifikanta taxa
Antalet (st) isolat (I-V) med % identifiering (ID):
Låg diskriminering
20,6%-22,6%
820
Escherichia coli 1
685
Escherichia coli 1
139
Escherichia coli 1
8
Klebsiella
pneumoniae ssp
ozaenae
31%-76,8%
Acceptabel ID
God ID
89,8%
95,6-98,9%
5/5 (I-V)
5/5 (I-V)
5/5 (I-V)
1/5 (V)
Escherichia coli 1
1/5 (V)
Escherichia vulneris
1/5 (V)
Salmonella
choleraesuis ssp
arizonae
2/5 (IV, V)
3/5 (I-III)
1/5 (IV)
Kvantifiering av de identifierade arterna
Antalet Enterobacteriaceae 37°C och 44°C samt pH-värde för respektive ost är tagna från
kandidatuppsatsens resultat (Westling, 2013) för att möjliggöra en kvantifiering av de identifierade
Enterobacteriaceae-arterna (Tabell 3). Antalet E. coli presenteras även genom förordning (EG) nr
2073/2005 om mikrobiologiska kvalitetskriterier för ostar tillverkade av mjölk eller vassle som har
genomgått värmebehandling (Europakommissionen, 2005; Tabell 4).
Tabell 3. Antalet (log10 CFU/g) H. alvei, E. coli, K. pneumoniae samt pH-värde i respektive ost.
Ost
Enterobacteriaceae 37°C
Enterobacteriaceae 44°C
pHvärde
Hafnia alvei
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
ssp ozaenae
820
7,4
2,3
NI*
7,1
685
7,5
1,9
NI*
6,8
139
7,2
3,0
NI*
6,2
8
4,5
NI*
1,3
6,9
* = Not identified (se Tabell 2 för identifieringar med låga diskrimineringar).
!19
Tabell 4. Antalet (log10 CFU/g) E.coli genom förordning (EG) nr 2073/2005 om mikrobiologiska
kvalitetskriterier för ostar tillverkade av mjölk eller vassle som har genomgått värmebehandling2.
Ost
Gränser för E. coli
Tillfredsställande
<2
820
685
Godtagbart
2≤ x <3
Otillfredsställande
≥3
2,3
1,9
139
8
3,0
NI*
* = Not identified (se Tabell 2 för identifieringar med låga diskrimineringar).
De identifierade arterna kopplade till sensoriska resultat
Smak- och doftupplevelser för respektive ost är tagna från kandidatuppsatsen (Westling, 2013) för
att kunna jämföra dessa med denna magisteruppsats identifierade Enterobacteriaceae-arter.
Intensiteten av samtliga smak- och doftupplevelser nedan korrelerade positivt och signifikant med
antalet Enterobacteriaceae 37°C (ibid.). I magisteruppsatsen gick det inte att urskilja några
skillnader mellan de identifierade arterna vad gäller inverkan på smak- och doftupplevelser hos
opastöriserade franska mögel- och kittostar. Det gick inte heller att se något samband mellan smakoch doftupplevelser och de identifierade bakterierna (Figur 4). H. alvei var den enda
Enterobacteriaceae-arten som förekom i samtliga fyra ostar, medan E. coli identifierades i tre av
ostarna och K. pneumoniae i en av ostarna.
2
E. coli-gränser för ostar framställda av obehandlad mjölk saknas (Europakommissionen, 2005).
Införandet av kriterier för E. coli för ostar framställda på obehandlad mjölk anses inte öka
livsmedelssäkerheten eftersom bakterien förekommer sporadiskt (Livsmedelsverket, 2007).
!20
!
Figur 4. Antalet H. alvei i jämförelse med intensiteten av smak- och doftupplevelserna gödsel,
bitter, stickande, metallisk och ammoniak från fyra opastöriserade franska mögel- och kittostar.
Diskussion
Nedan presenteras en övergripande och sammanfattade diskussion av resultatet. Under de två
rubrikerna “Arternas förmåga att påverka smak- och doftupplevelser i ostar” och “Arternas
eventuella sjukdomsframkallande egenskaper” följer detaljerade diskussioner, därefter presenteras
en värdering av det sammanfattade materialet. Metod- och materialdiskussionen behandlar
magisteruppsatsens urval och genomförande. Diskussionsavsnittet avslutas med en forskningsetisk
uppföljning, slutsatser samt praktisk användning och vidare forskning.
Diskussion av resultatet
Resultatet (se Tabell 1 och 2) i denna magisteruppsats består av Enterobacteriaceae-arter vilka
betraktas som koliforma bakterier (se Figur 1). De identifierade Enterobacteriaceae-arterna är H.
alvei från grupp (b) samt E. coli och K. pneumoniae från grupp (c) (ibid.). En del
Enterobacteriaceae-arter i grupp (b) betraktas som koliforma bakterier och Enterobacteriaceaearter i grupp (c) betraktas traditionellt som typiska koliforma bakterier (Baylis et al., 2011). Att det
var just dessa arter kan bero på att E. coli följt av H. alvei är vanliga i ost i slutet av
mognadsperioden, förmodligen på grund av deras syra-toleranta karaktär (Tornadijo et al., 2001).
Både E. coli och H. alvei är särskilt syra-toleranta arter med stammar som kan växa i ett pH-värde
!21
omkring 5 (Madigan et al., 2011; Mounier et al., 2008). Både E. coli och K. pneumoniae kan orsaka
infektionssjukdomar medan H. alvei inte beskrivs som sjukdomsframkallande enligt Janda &
Abbott (2006) utan de menar att det krävs mer arbete och bevis för att stödja ett sådant påstående.
Det finns inga gränsvärden för E. coli, och inte heller för K. pneumoniae, när det gäller
opastöriserade ostar (Tabell 4) vilket gör det svårt att konkludera huruvida magisteruppsatsens ostar
är godtagbara för konsumtion eller inte.
Kandidatuppsatsens resultat (Westling, 2013) visar att bakteriefamiljen Enterobacteriaceae 37°C
korrelerar med intensiteten av smak- och doftupplevelserna gödsel, bitter, stickande, metallisk och
ammoniak från opastöriserade mögel- och kittostar. Inga skillnader mellan de identifierade arterna
från denna magisteruppsats vad gäller inverkan på smak- och doftupplevelser hos opastöriserade
franska mögel- och kittostar gick att urskilja och inte heller något samband mellan de identifierade
arterna och smak- och doftupplevelser (Figur 4). Det visades – logiskt nog – svårare att hitta studier
med människan som mätinstrument som berör samband mellan smak- och doftupplevelser när det
gäller specifika Enterobacteriaceae-arter. Däremot finns studier som använder kemiska
analysinstrument för att studera föreningar som produceras av en eller flera av arterna, vilka går att
relatera till tidigare nämnda smak- och doftupplevelser. Diskussion av resultat nedan delas in i
underrubriker utifrån vilka biogena aminer respektive flyktiga föreningar som undersöks, därefter
följer Enterobacteriaceae-arternas eventuella sjukdomsframkallande egenskaper och diskussionen
av resultatet avslutas med värdering av det sammanfattade materialet.
Arternas förmåga att påverka smak- och doftupplevelser i ostar
Biogena aminer som är aktuella att relateras till tidigare korrelerade smak- och doftupplevelser
(Westling, 2013) är kadaverin, putrescin, tyramin och histamin. Flyktiga föreningar som är aktuella
att relatera är olika svavelföreningar och eventuellt även alkoholer. Det har visat sig att flyktiga
föreningar i allmänhet förekommer i ett brett spektrum av bakterier vilket gör det svårt att korrelera
någon speciell typ av neutral förening med en viss släkte, art eller grupp av bakterier. Dock har
Enterobacteriaceae stor aromatisk potential eftersom de kan katabolisera citrat, lipider och
proteiner (Chaves-Lopez et al., 2006; Zago et al., 2007). Som det nämndes i den teoretiska
bakgrunden kan flera bakteriearter samarbeta i metaboliska vägar (Arfi et al., 2002; Smit et al.,
2005) men att det saknas sammanställda uppgifter som förklarar hur traditionella ostar med
tillhörande komplexa sammansättning av mikroorganismer fungerar (Montel et al., 2014). Dock har
ett högt antal Enterobacteriaceae korrelerats med höga koncentrationer av kadaverin i ostar
!22
(Marino, Maifreni, Moret & Rondinini, 2000), vilket eventuellt även skulle kunna gälla putrescin
(Chaves-López et al., 2006; Pircher, Bauer, Paulsen, 2007). Enligt Özoğul (2004) behöver
övervakning ske för att förhindra ett högt innehåll av dessa biogena aminer, med andra ord så är
användning av extremt högkvalitativ opastöriserad mjölk, god hygienpraxis eller användning av
lämpliga startkulturer inte tillräckligt (Roig-Sagués et al., 2002) även om risken för ett högt innehåll
minskar (Maifreni et al., 2013).
Med detta som bakgrund blir det intressant att se möjligheter att använda människan som
mätinstrument för att identifiera höga halter av Enterobacteriaceae-arter i ostar. Men är denna
metod tillförlitlig? I kandidatuppsatsen (Westling, 2013) påvisades positiva och signifikanta
korrelationer mellan antalet Enterobacteriaceae och intensiteten av smak- och doftupplevelserna
gödsel, bitter, stickande, metallisk och ammoniak. I denna magisteruppsats visade ett urval av
ostarna innehålla Enterobacteriaceae-arterna H. alvei, E. coli och K. pneumonieae. För att kunna
svara på om metoden att använda människan som mätinstrument för att kunna kontrollera hygienisk
kvalitet på traditionellt tillverkade ostar behövs åtminstone ett större urval av ostar och bakterier
undersökas, vilket inte kunde göras i denna magisteruppsats p.g.a. ekonomiska begränsningar.
Däremot blir det intressant att undersöka om det finns skillnader vad gäller olika
Enterobacteriaceae-arters förmåga att påverka smak- och doftupplevelser i ostar. Därför behandlas
de tidigare nämnda biogena aminerna och flyktiga föreningar relaterat till H. alvei, E. coli och K.
pneumoniae samt andra bakteriearter som analyserades i samma studier.
När det gäller biogena aminer så avger kadaverin och putrescin en illaluktande doft för människor
som härrör från bakteriell dekarboxylering av aminosyrorna ornitin och lysin (Hussain et al., 2013).
Dessa doftupplevelser kan liknas med gödsel, stickande och ammoniak som korrelerades med
antalet Enterobacteriaceae i kandidatuppsatsen (Westling, 2013). Enligt Kubícková & Grosch
(1998) bidrar kadaverin, ornitin och citrulin sannolikt till den bittra smaken i Camembertost.
Smaken bitter korrelerades också med antalet Enterobacteriaceae i kandidatuppsaten (ibid.).
Tyramin och histamin bidrar till specifika ostkaraktärer i Emmentalerost (Warmke, Belitz &
Grosch, 1996) och histamin ger en metallisk smak (Lorenz, Doenicke Schöning, Ohmann, Grote &
Neugebauer, 1982), vilket är en av de smakupplevelser som korrelerades med antalet
Enterobacteriaceae i kandidatuppsatsen (Westling, 2013). Föreningar med svavel har oftast en
starkare lukt än svavel och anses påminna om “ruttna ägg” som kan relateras till smak- och
doftupplevelserna bitter, ammoniak och stickande från kandidatuppsatsen (Westling, 2013).
!23
Kadaverin och putrescin
De flesta Enterobacteriaceae-arter har förmågan att dekarboxylera både lysin och ornitin, med följd
att kadaverin och putrescin bildas (Pircher, Bauer, Paulsen, 2007). Marino et al. (2000) har funnit en
positiv korrelation mellan antalet Enterobacteriaceae3 och koncentrationen av kadaverin i ostar.
Inga korrelationer hittades för det totala antalet bakterier, streptokocker eller laktobaciller och inte
heller för andra biogena aminer4 (ibid.). I deras studie producerades kadaverin, putrescin, tyramin
och histamin av Enterobacteriaceae (däribland arterna H. alvei och E. coli) men inte spermin,
spermedin, 2-fenyletylamin eller tryptamin (ibid.). Författarna menar att kadaverin skulle kunna
användas som kvalitetsindikator för hygienisk osttillverkning (Marino et al., 2000). I en äldre studie
av Schwarz & Thomasow (1950) konkluderar de att kadaverin och putrescin kan påverka smaken
av den halvhårda osten Tilsiter men är förmodligen mindre viktiga för aromen. Om detta påstående
stämmer skulle de smak- och doftupplevelser som associeras till kadaverin och putrescin framförallt
identifieras genom att smaka på ostarna, snarare än att dofta. Att smaka på ostarna kan bli
problematiskt utifrån ett livsmedelshygieniskt perspektiv då detta medför vissa risker.
I en studie av Delbès-Paus et al. (2012) inokulerades elva gramnegativa bakterie-arter varav sex
stycken tillhör Enterobacteriaceae (Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca, H. alvei, Pantoea
agglomerans, Morganella morganii och Proteus vulgaris). De valdes bland annat utifrån deras
förmåga att producera biogena aminer i halvhårda ostar som innehåller en komplex sammansättning
av mikroorganismer. Ostar inokulerade med H. alvei var de enda där putrescin påvisades. Kadaverin
påvisades endast i ostar inokulerade med arterna H. alvei, K. oxytoca, Halomonas venusta och M.
morganii (Delbès-Paus et al., 2012).
Tyramin och histamin
Enterobacteriaceae har histaminbildande aktivitet i spanska traditionella ostar (Roig-Sagués,
Molina & Hernández-Herrero, 2002) och tidigare studier har visat att just H. alvei, E. coli, K.
pneumoniae och Serratia spp. har en histaminbildande förmåga (Roig-Sagués, Hernández Herrero,
Rodríguez, López Sabater & Mora Ventura, 1996; López Sabater, Rodríguez Jerez, Hernández
3
I undersökningen testades 104 Enterobactreriaceae-isolat varav 58 Enterobacter, 18 Serratia,
åtta Escherichia, sju Hafnia, sex Arizona, fyra Citrobacter och tre Klebsiella (Marino et al., 2000).
4
I undersökningen testades kadaverin, putrescin, histamin, tyramin, tryptamin, spermidin, spermin
och 2-fenyletylamin (Marino et al., 2000).
!24
Herrero & Mora Ventura, 1994). Den högsta histaminproduktionen i histidin-berikad buljong
erhölls genom M. morganii följt av K. pneumoniae och lägst med en H. alvei-stam (Özoğul, 2004).
Även bakteriell ammoniakproduktion påvisades, vilket är en av de doftupplevelser som korrelerades
med antalet Enterobacteriaceae i kandidatuppsatsen (Westling, 2013), hos samtliga tre stammar
genom nedbrytning av histidin (ibid.). I en annan studie med stammar av K. pneumoniae och K.
oxytoca producerades inget histamin i tryptisk sojabuljong (Kanki, Yoda & Tsukamoto, 2002).
Däremot går det att läsa i ännu tidigare studier av Taylor Guthertz & Lieber (1979) och Niven
Jeffrey & Corlett (1981) om en grupp histamin-producerande stammar vilka klassificerades som K.
pneumoniae. Efteråt har denna identifikation ändrats från K. pneumoniae och K. oxytoca till K.
planticola och K. ornithinolytica, när K. planticola och K. ornithinolytica skiljdes från K.
pneumoniae och K. oxytoca som nya arter. Dessa två Klebsiella-arter har sedan dess klassificerats i
släktet Raoultella (Kanki, Yoda & Tsukamoto, 2002). Vad gäller tyramin så har H.-alvei-stammar
visats vara potentiella producenter (Maifreni et al., 2013). H. alvei har även visats kunna
dekarboxylisera de tre aminosyrorna tyrosin, lysin och ornitin (ibid.).
Delbès-Paus et al. (2012) visar att endast obetydliga mängder av skadliga histamin och tyramin
samt isopentylamin, tryptamin och fenyletylamin, producerades i ostar med någon av de
inokulerade gramnegativa stammarna (Citrobacter freundii, K. oxytoca, H. alvei, Pantoea
agglomerans, Morganella morganii och Proteus vulgaris). Däremot producerades dessa biogena
aminer i höga nivåer in vitro (ibid.).
Svavelföreningar och alkoholer
Vad gäller produktion av flyktiga aromatiska föreningar, visar Irlinger et al. (2012) att H. alvei kan
tillsättas och tillväxa i en ost med som redan har en varierande bakteriekultur och i betydande
utsträckning bidra till de aromatiska egenskaperna hos osten, med flyktiga svavelföreningar som de
mest förekommande. I en annan studie med flera typer av grampositiva och gramnegativa bakterier
som odlats i buljong där neutrala flyktiga organiska föreningar undersöktes visade resultaten att
gramnegativa tarmbakterier som E. coli och medlemmar av släktena Salmonella, Klebsiella och
Enterobacter producerade de långkedjiga alkoholerna 1-oktanol, 1-dekanol, och 1-dodekanol
(Elgaali, Hamilton-Kemp, Newman, Collins, Yu & Archbold, 2002). Alkoholen 1-oktanol doftar
fruktigt till blommigt, söt tvål, apelsin, vax och sött, 1-dekanol söt och mirabell samt 1-dodekanol
doftar blommigt (Jong & Birmingham, 1993). Dessa smak- och doftupplevelser korrelerades inte
med antalet Enterobacteriaceae i kandidatuppsatsen (Westling, 2013). Andra gramnegativa, inte
!25
tarmbakterier, däribland medlemmar av släktena Pseudomonas, Acinetobacter, och Shewanella
producerade inte detekterbara mängder av dessa långkedjiga alkoholer (Elgaali et al., 2002).
Grampositiva kulturer, däribland medlemmar av släktena Bacillus, Enterococcus, Lactococcus,
Listeria, Leuconostoc, Staphylococcus och Streptococcus producerade inte heller detekterbara
mängder av långkedjiga alkoholer med undantag av mycket små mängder (<1 ng ml) 1) av dekanol
från stammar av Lactococcus och Leuconostoc (ibid.). Samma författare utvärderade i en senare
studie 10 stammar av E. coli vad gäller produktion av långkedjiga alkoholer och deras resultat visar
att oktanol, dekanol och dodekanol produceras av samtliga analyserade stammar (Hamilton-Kemp,
Newman, Collins, Elgaali, Yu & Archbold, 2005). Hos varje stam var dekanol den dominerande
föreningen som producerades (ibid.). Sammanfattningsvis visar studien att E. coli i tryptisk
sojabuljong avger en grupp av långkedjade alkoholer och att dessa kan användas som flyktiga
indikatorer för identifiering av vissa typer av bakterier, särskilt gramnegativa tarmbakterier
(Hamilton-Kemp et al., 2005).
Arternas eventuella sjukdomsframkallande egenskaper
Som nämndes tidigare kan både E. coli och K. pneumoniae orsaka infektionssjukdomar medan H.
alvei inte beskrivs som sjukdomsframkallande enligt Janda & Abbott (2006) utan de menar att det
krävs mer arbete och bevis för att stödja ett sådant påstående. Relaterat till magisteruppsatsens ostar
är det svårt att konkludera huruvida de är godtagbara för konsumtion eller inte eftersom
gränsvärden för E. coli och K. pneumoniae saknas. Däremot finns det gränsvärden för E. coli när
det gäller pastöriserade ostar och utifrån dessa gränsvärden var en av magisteruppsatsens ostar
tillfredsställande för konsumtion, en godtagbar och en av ostarna var otillfredsställande för
konsumtion (Tabell 4). Nedan följer mer detaljerade sjukdomsframkallande egenskaper för
respektive Enterobacteriaceae-art som identifierades i denna magisteruppsats.
Escherichia coli
E. coli är en normal tarmbakterie hos både människor (Escherich, 1885) och djur och har använts
länge som indikatorbakterie för att påvisa fekalt förorenat vatten (Edberg, Rice, Karlin & Allen,
2000; Tallon, Magajna, Lofranco & Leun, 2005). E. coli kan orsaka en rad infektionssjukdomar och
är den organism som oftast är ansvarig för urinvägsinfektioner och som oftast orsakar diarré hos
människor som reser utomlands (Gould, 2011). E. coli har tre viktiga karaktärer med O- (cellhölje),
H- (flagella-) och K- (polysackaridkapsel-) antigener vilket ger upphov till 700 serotyper. De flesta
stammar inte ger upphov till sjukdom (Livsmedelsverket, 2007).
!26
Virulenta faktorer hos E. coli inkluderar p-pili, koloniseringsfaktorer (CFA), fimbrier och andra icke
fimbrieadhesiner, sideroforer, kapsel, lipopolysackarider, flageller, hemolysiner samt värmestabila
toxiner som t.ex. verotoxiner (Gould, 2011). Shiga toxin-producerande E. coli är en zoonos som
bärs av många inhemska och vilda djur och har isolerats från deras avföring (ibid.). Den
huvudsakliga reservoaren i Storbritannien verkar vara nötkreatur, får och getter (Coia et al., 2001).
Den serotyp som oftast förknippas med infektionssjukdomar är E. coli O157, även känd som
verocytotoxin-producerande E. coli (Gould, 2011). Serotypen har blivit ökänd för att orsaka
livsmedelsburna infektioner som kan få allvarliga konsekvenser för hälsan, hos människor fäster sig
bakterierna till tarmslemhinnan med fimbrier och invaderar värdcellerna (ibid.). Symtomen
utvecklas när bakterierna producerar ett enterotoxin som kallas verocytotoxin som fäster vid
tarmväggen (ibid.). Infektionsdosen för E. coli O157:H7 är 10–100 organismer, eller ännu lägre när
det gäller känsliga grupper (Armstrong, Hollingsworth, & Morris, 1996). E. coli O157:H7 orsakar
ett brett spektrum av kliniska symptom, inkluderat icke-blodig diarré, hemorragisk kolit, tillståndet
hemolytiskt uremiskt syndrom och – i värsta fall – död (Meng, Doyle, Zhao, & Zhao, 2001).
Klebsiella pneumoniae
Som namnet hos arten K. pneumoniae antyder, kan dessa bakterier bidra till lunginflammation,
pneumoni (Friedlaender, 1882). K. pneumoniae är en opportunistisk patogen som huvudsakligen
orsakar urinvägsinfektioner, luftvägsinfektioner och bakteriemi (Podschun & Ullmann, 1998; Yu et
al., 2007). Höga halter av K. pneumoniae har påvisats i färskosten Mozzarella (Massa, Gardini,
Sinigaglia & Guerzoni, 1992).
K. pneumoniae är, till skillnad från H. alvei och E. coli, inte rörlig. Virulensfaktorer hos K.
pneumonieae inkluderar förmåga att effektivt förvärva järn, tjock kapsel, lipopolysackarider,
adhesiner, ökad resistens mot serum samt förmågan att bilda biofilmer (Podschun & Ullmann, 1998;
Barreto, Zambrano & Araque, 2009; El Fertas-Aissani, Messai, Alouache & Bakour, 2013). Andra
symptom inkluderar hypersekretion av slem (Kawai, 2006; Wiskur, Hunt & Callegan, 2008) och
leverbölder (Tsai, Huang, Chang & Wang, 2008). Därutöver har bakterien stor potential för
spridning och förmåga att snabbt bli resistent mot antibiotika (Lee, Kotapati, Kuti, Nightingale &
Nicolau, 2006).
!27
Hafnia alvei
H. alvei är vanliga kontaminanter i mejeri-, kött- och fiskprodukter (Skandamis & Nychas, 2012).
En studie poängterar att felaktig kylförvaring av opastöriserad mjölk bidrar till en snabb tillväxt av
psykrotrofa koliforma bakterier och att H. alvei var den mest förekommande i deras studie bland
koliforma bakterierna i lagrad ostmassa (Macedo, Malcata & Hogg, 1995). En senare studie
identifierade H. alvei i 34% av köttfärsprover, 14% av mejeriprover och 12% av sötvattensfiskprover; antalet var så höga som 7,5 till 8 log10 CFU/g (Gamage, Luchansky & Ingram, 1998).
Tidigare bestod släktet Hafnia av en enda art: H. alvei, men sedan 2010 har “H. alvei HG 2”
kategoriserats som arten Hafnia paralvei (Huys et al., 2010; Abbott et al., 2011). Escherichia
albertii är en art som tidigare har benämnts H. alvei genom API 20 E, Vitek och MicroScan (Nimri,
2013) på grund av att de delar ett antal biokemiska egenskaper såsom oförmågan att fermentera
laktos eller D-sorbitol, brist på indolproduktion samt liknande resistensprofiler (Janda et al., 2002).
För att särskilja E. albertii och H. alvei krävs, enligt Janda & Abbott (2006), konventionella
biokemiska tester.
H. alvei har förmågan att bilda biofilmer (Vivas et al., 2008), quorum sensing (Viana et al., 2009;
Tan, Yin & Chan, 2014) samt cytolytisk toxin (Abbott et al., 2011). Det finns även andra studier
som stödjer att H. alvei kan interagera med människor och däggdjursceller (Donato et al., 2008;.
Padilla et al., 2008.). En populationsbaserad studie visade att vid urinvägsinfektioner hos kvinnor
över 90 år isolerades H. alvei oftast som enda agens (Laupland et al., 2006). Delbès-Paus et al.
(2013) visar att H. alvei B16 verkar vara en lovande stam för att reducera tillväxten av E. coli
O26:H11 i ostar.
Värdering av det sammanfattade materialet
Smak- och doftupplevelserna gödsel, bitter, stickande, metallisk och ammoniak i opastöriserade
franska mögel- och kittostar har producerats under komplexa företeelser där flera bakteriearter
påverkar varandra i ett medium som består av bland annat citronsyra, mjölksyra, fettsyror,
aminosyror och kasein. Detta försvårar skapandet av en sammanfattande bild över hur dessa smakoch doftupplevelser har producerats. Däremot finns det studier som visar på samband mellan vissa
Enterobacteriaceae-arter och bildandet av biogena aminer samt flyktiga föreningar. Dessa studier
stärker teorin att Enterobacteriaceae är bidragande faktorer till de upplevda smak- och
doftupplevelserna i opastöriserade mögel- och kittostar. En intressant frågeställning när det gäller
Enterobacteriaceae-arternas förmåga att påverka smak- och doftupplevelser i ostar är om andra
!28
bakterier har undersökts i motsvarande syfte och vilka resultat dessa studier har fått. Med bakgrund
av att koliforma bakterier (Baylis et al., 2011) samt möjligtvis syratoleranta bakterier har potentiella
egenskaper för att kunna förekomma oftare i opastöriserade mögel- och kittostar, ibland
mognadslagrade sådana, än andra bakterier så skulle ett första steg kunna vara att undersöka
Enterobacter och Serratia utifrån vilka smak- och doftupplevelser de kan producera i
opastöriserade mögel- och kittostar. Därutöver skulle sensoriska skillnadstester mellan de
identifierade Enterobacteriaceae-arterna i denna magisteruppsats kunna bidra med ledtrådar
huruvida det finns skillnader mellan dessa bakteriearter vad gäller deras inverkan på smak- och
doftupplevelser i mögel- och kittostar.
Metod- och materialdiskussion
I denna magisteruppsats användes API 20E för att artbestämma 40 Enterobacteriaceae-isolat från
fyra opastöriserade franska mögel- och kittostar. API 20E är en vedertagen metod inom
livsmedelsmikrobiologin och används fortfarande tack vare de snabba resultat som erhålls genom
att kombinera olika tekniker, som tidigare var komplicerade att utföra och svåra att tolka. För att
säkerställa vilka Enterobacteriaceae-arter det är går det att skicka in dessa till ett specillaboratorium
som analyserar bakterierna in i minsta detalj. Att göra detta för varje isolat skulle bli väldigt dyrt.
Vad gäller urvalet kopplat till resultat, är det för få ostar i denna magisteruppsats för att kunna
urskilja eventuella korrelationer mellan de identifierade Enterobacteriaceae-arterna och smak- och
doftupplevelser. Antalet API 20E-remsor valdes utifrån ekonomiska begränsningar. Anledningen till
att fem isolat användes för Enterobacteriaceae 37°C respektive 44°C i varje ost är att få ett
bakteriologiskt godtagbart resultat. Genom att därefter diskutera de identifierade
Enterobacteriaceae-arterna utifrån deras eventuella sjukdomsframkallande egenskaper och deras
förmåga att påverka smak- och doftupplevelser i mögel- och kittostar, fördjupas och värderas
resultat från kandidatuppsatsen (Westling, 2013).
Från början analyserades fem olika ostar, men den första osten som analyserades (vilket gjordes i en
separat omgång) gav inget giltigt resultat. En anledning kan ha varit att bakterierna förvarades för
länge i fysiologisk saltlösning. De resterande fyra ostarna analyserades under två omgångar (en för
Enterobacteriaceae 37°C och en för Enterobacteriaceae 44°C). Istället för att förbereda samtliga
isolat innan de tillsattes i respektive rör på API 20E-remsorna, förbereddes ett isolat åt gången.
Detta bidrog till att isolaten inte var i den fysiologiska saltlösningen lika länge vilket minskade
stressfaktorer hos bakterierna.
!29
Forskningsetisk uppföljning
Magisteruppsatsens syfte följdes under hela arbetet. Vad gäller insamling och lagring av data har
detta gjorts enligt de anvisningar som finns för API20 E samt varit oåtkomligt för obehöriga.
Magisteruppsatsens resultat presenteras i rådata och anses därmed vara korrekt och ärlig. Som
nämndes i avsnittet Forskningsetisk planering användes inga människor eller djur i denna
magisteruppsats samt att varken Restaurang- och hotellhögskolans eller anknutna människors hälsa
äventyrades för denna magisteruppsats eftersom vanliga API 20E-remsor användes som
materialinsamling i ett livsmedelshygieniskt laboratorium där ordnings- och skyddsföreskrifter
följdes.
Slutsatser
Utifrån denna magisteruppsats går det att anta att någon eller flera av bakterierna H. alvei, E. coli
och K. pneumoniae påverkar smak- och doftupplevelsen av opastöriserade franska mögel- och
kittostar (Tabell 1). Dessa smak- och doftupplevelser beskrevs i kandidatuppsatsen som gödsel,
bitter, stickande, metallisk och ammoniak. Samtliga av dessa smak- och doftupplevelser går att
förklara genom tidigare studier som visar hur en eller flera av studiens identifierade bakteriearter
kan producera biogena aminer och flyktiga föreningar som ger upphov till dessa smak- och
doftupplevelser. Huruvida det är en skillnad mellan magisteruppsatsens identifierade bakteriearter
vad gäller dess påverkan av smak- och doftupplevelser i ostar gick inte att urskilja med
kandidatuppsatsens resultat och svar hittades inte heller i de artiklar som används i denna
magisteruppsats.
Praktisk användning och vidare forskning
Utifrån denna magisteruppsats räcker det inte med att dofta på ostarna för att säkerställa hygienisk
kvalitet, ytterligare undersökningar behövs för att kunna identifiera vilka Enterobacteriaceae-arter
de innehåller. Däremot skulle en förstudie i form av en sensorisk bedömning av opastöriserade
mögel- och kittostar kunna påvisa om ett högt antal Enterobacteriaceae föreligger, vilka vid
konsumtion kan vara sjukdomsframkallande.
Eftersom samtliga identifierade Enterobacteriaceae-arter har sjukdomframkallande egenskaper
avråds användning av denna bakteriefamilj för att producera vissa smak- och doftupplevelser i ostar
eller i några andra livsmedel.
!30
Vidare forskning
Finns det någon skillnad mellan H. alvei, E. coli och K. pneumoniae vad gäller deras förmåga att
påverka smak- och doftupplevelser i ostar? Utifrån denna frågeställning kommer framtida
undersökningar att ske där rena bakteriekulturer inokuleras i ystmjölk som sedan används för att
tillverka färskostar. Med bakgrund av att dessa bakteriearter har potential att framkalla sjukdomar
hos människor, får de sensoriska undersökningarna begränsas till doftupplevelser alternativt att en
elektronisk näsa används som mätinstrument.
!31
Tillkännagivande
Denna studie stöddes ekonomiskt av Stadsveterinär Billströms stipendiefond, som vi uttrycker vår
tacksamhet till.
!32
Referenslista
Abbott, S.L.; Moler, S.; Green, N.; Tran, R.K.; Wainwright, K. & Janda, J.M. (2011). Clinical and
laboratory diagnostic characteristics and cytotoxigenic potential of Hafnia alvei and Hafnia
paralvei strains. Journal of Clinical Microbiology, 49(9), 3122–3126.
Armstrong, G. L.; Hollingsworth, J. & Morris, J. G. Jr. (1996). Emerging foodborne pathogens:
Escherichia coli O157:H7 as a model of entry of a new pathogen into the food supply of the
developed world. Epidemiologic Reviews, 18(1), 29-51.
Barreto, S.; Zambrano, M. & Araque, M. (2009). Phenotypic variations of susceptibility in
Klebsiella pneumoniae strains of nosocomial origin and their association with biofilm
formation. Investigacion Clinica, 50(2), 221–229.
Baylis, Chris; Uyttendaele, Mieke; Joosten, Han & Davies, Andy (2011). The Enterobacteriaceae
and their significance to the food industry (Rapport på uppdrag av ILSI Europe - Emerging
Microbiological Issues Task Force). Hämtad 2014-02-08 från http://www.ilsi.org/Europe/
Documents/EP%20Enterobacteriaceae.pdf.
BioMériux (2013). API® FEATURES & SPECS, 13 oktober. Hämtad 2013-10-13 från
http://www.biomerieux-usa.com/servlet/srt/bio/usa/dynPage?
doc=USA_PRD_LST_G_PRD_USA_5&pubparams.sform=0.
Bitner, Mary Jo (1992). Servicescapes: The impact of Physical Surroundings on Customers and
Employees. Journal of Marketing, 56, 57-58.
Bos, Lieuwe D. J..; Sterk, Peter J. & Schultz, Marcus J. (2013). Volatile metabolites of pathogens: a
systematic review. PLoS Pathogens, 9(5).
Bryman, Alan (2011). Samhällsvetenskapliga metoder. Malmö: Liber.
Carpino, S. (2004a). Contribution of Native Pasture to the Sensory Properties of Ragusano Cheese.
Journal of Dairy Science, 87(2), 308–315.
Carpino, S. (2004b). Composition and aroma compounds of Ragusano cheese: native pasture and
total mixed rations. Journal of Dairy Science, 87(4), 816-30.
Chambers, D.H.; Esteve, E. & Retiveau, A. (2010). Effect of milk pasteurization on flavor
properties of seven commercially available French cheese types. Journal of Sensory Studies,
25(4), 494–511.
Chaves-López, C.; De Angelis, M.; Martuscelli, M.; Serio, A.; Paparella, A. & Suzzi, G. (2006).
Characterization of the Enterobacteriaceae isolated from an artisanal Italian ewe’s cheese
(Pecorino Abruzzese). Journal of Applied Microbiology, 101, 2006, 353–360.
Coia, John E.; Johnston, Yvonne; Steers, Nicholas J. & Hanson, Mary F. (2001). A survey of the
prevalence of Escherichia coli O157 in raw meats, raw cow’s milk and raw-milk cheeses in
south-east Scotland. International Journal of Food Microbiology. 66(1-2), 63-69.
Colonna, A.; Durham, C. & Meunier-Goddik, L. (2011). Factors affecting consumers' preferences
for and purchasing decisions regarding pasteurized and raw milk specialty cheeses. Journal
of Dairy Science, 94(10), 5217–5226.
Columella, Lucius Junius Moderatus (2009). Tolv böcker om lantbruk: en tvåtusenårig romersk
lantbrukslära; Samt Liv, lantbruk och livsmedel i Columellas värld - Tolv artiklar av nutida
svenska forskare (Hedberg, Sten, övers.). Stockholm: Kungliga Skogs- och
lantbruksakademien.
Danielsson-Tham, Marie-Louise et al. (2004). Causes behind a human cheese-borne outbreak of
gastrointestinal listeriosis. Foodborne Pathogens and Disease, 1, 153-159.
Danielsson-Tham, Marie-Louise (2008). Livsmedelshygienen invaderar Campus Grythyttan.
Grytlappen – Föreningen studenternas hus tidskrift, 4.
!33
De Buyser, Marie-Laure; Dufour, Barbara; Maire, Murielle & Lafarge, Véronique (2001).
Implication of milk and milk products in food-borne diseases in France and in different
industrialised countries. International Journal of Food Microbiology, 67(1–2), 1–17.
Delbès-Paus, C. et al. (2012). Impact of Gram-negative bacteria in interaction with a complex
microbial consortium on biogenic amine content and sensory characteristics of an uncooked
pressed cheese. Food Microbiology, 30(1), 74–82.
Delbès-Paus, C. et al. (2013). Behavior of Escherichia coli O26:H11 in the presence of Hafnia alvei
in a model cheese ecosystem. The International Journal of Food Microbiology, 160(3),
212-8.
Edberg, SC.; Rice, EW.; Karlin, RJ. & Allen, MJ. (2000). Escherichia coli: the best biological
drinking water indicator for public health protection. Journal of Applied Microbiology, 88,
106-116.
Elgaali, Hesham; Hamilton-Kemp, Thomas; Newman, Melissa; Collins, Randall; Yu, Keshun &
Archbold, Douglas (2002). Comparison of long-chain alcohols and other volatile
compounds emitted from food-borne and related Grampositive and Gram-negative bacteria.
Journal of Basic Microbiology, 42, 373–380.
Escherich, T. (1885). "Die Darmbakterien des Neugeborenen und Säuglinge". Fortschr Med, 3,
515–522.
El Fertas-Aissani, R.; Messai, Y.; Alouache, S. & Bakour, R. (2013). Virulence profiles and
antibiotic susceptibility patterns of Klebsiella pneumoniae strains isolated from different
clinical specimens. Pathologie Biologie, 61(5), 209–216.
Fox, Patrick F.; McSweeney, Paul L. H.; Cogan, Timothy M. & Guinee, Timothy P. (2004). Cheese:
Chemistry, Physics and Microbiology, Volume 1, Third Edition: General Aspects. Waltham,
Massachusetts: Academic Press.
Friedlaender, Dr. C. (1882). Ueber die Schizomyceten bei der acuten fibrösen Pneumonie. Archiv
für pathologische Anatomie und Physiologie und für klinische Medicin, 87(2), 319-324.
Gamage, S. D.; Luchansky, J. B. & Ingham. S. C. (1998). Pulsed-field gel electrophoresis typing of
Hafnia alvei isolated from chub-packed and retail ground beef. Letters in Applied
Microbiology 26(2), 105-109.
Giammanco, Giovanni M.; Pepe, Arcangelo; Aleo, Aurora; D'Agostino, Valentina; Milone, Samuela
& Mammina, Caterina (2011). Microbiological quality of Pecorino Siciliano ”primosale”
cheese on retail sale in the street markets of Palermo, Italy. New Microbiologica, 34(2),
179-185.
Gould, Dinah (2011). Escherichia coli recognition and prevention. Primary Health Care, 21(8),
32-39.
Gustafsson, Inga-Britt (2004). Måltidskunskap – kunskap som förenar vetenskap, praktik och
estetik. Ingår i: Gustafsson, Inga-Britt & Strömberg, Ulla-Britt (Red.), Tid för
måltidskunskap. Örebro: Örebro universitet.
Hamilton-Kemp, Thomas; Newman, Melissa; Collins, Randall; Elgaali, Hesham; Yu, Keshun &
Archbold, Douglas (2005). Production of the Long-Chain Alcohols Octanol, Decanol, and
Dodecanol by Escherichia coli. Current Microbiology, 5(2), 82-86.
Hayes, M.; Hurley, M.J.; Larsen, L.B.; Heegaard, C.W.; Magboul, A.A.A.; Oliveira, J.C.;
McSweeney, P.L.H. & Kelly, A.L., (2001). Thermal inactivation kinetics of bovine cathepsin
D. Journal of Dairy Research, 68, 267–276.
Hickey, D.K.; Kilcawley, K.N.; Beresford, T.P. & Wilkinson, M.G. (2007). Lipolysis in Cheddar
cheese made from raw, thermized and pasteurized milks. Journal of Dairy Science, 90, 47–
56.
!34
Holmes, B.; Willcox, W. R. & Lapage, S. P. (1978). Identification of Enterobacteriaceae by the API
20E system. Journal of Clinical Pathology, 1978, 31, 22-30.
Hussain, Ashiq et al. (2013). High-affinity olfactory receptor for the death-associated odor
cadaverine. PNAS, 110(48), 19579-19584.
Husserl, Edmund (1970). The Crisis of European Sciences and Transcendental Phenomenology: An
Introduction to Phenomenological Philosophy [1936]. United States: Northwestern
University Press.
Huys, G.; Cnockaert, M.; Abbott, S.L.; Janda, J.M. & Vandamme, P. (2010). Hafnia paralvei sp.
nov., formerly known as Hafnia alvei hybridisation group 2. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology, 60, 1725–1728.
Irlinger, F. et al. (2012). Ecological and aromatic impact of two Gram-negative bacteria
(Psychrobacter celer and Hafnia alvei) inoculated as part of the whole microbial community
of an experimental smear soft cheese. International Journal of Food Microbiology, 153(3),
332-338.
Janda, Michael J. & Abbott, Sharon L. (2006). The genus Hafnia: from soup to nuts. Clinical
Microbiology Reviews, 19(1), 12–28.
Jong, S. C. & Birmingham, J. M. (1993). Mushrooms as a source of natural flavor and aroma
compounds. Ingår i: Chang, S. T.; Buswell, J. A. & Chiu, S. W. (Red.). Mushroom biology
and mushroom production. Pekin: Chinese University Press.
Kanki, M.; Yoda, T. & Tsukamoto, T. (2002). Klebsiella pneumoniae produces no histamine:
Raoultella planticola and Raoultella ornithinolytica strains are histamine producers. Applied
and Environmental Microbiology, 68(7), 3462-3466.
Kawai, Toshihisa (2006). Hypermucoviscosity: An Extremely Sticky Phenotype of Klebsiella
pneumoniae Associated with Emerging Destructive Tissue Abscess Syndrome. Clinical
Infectious Diseases, 42, 1359–1361.
Knoll, Laura P., (2005). Origins of the Regulation of Raw Milk Cheeses In the United States, april
26. Hämtad 2014-06-30 från http://dash.harvard.edu/bitstream/handle/1/8852188/
Knoll05.pdf?sequence=1.
Kousta, Maria; Mataragas, Marios; Skandamis, Panagiotis & Drosinos, Eleftherios H. (2010).
Prevalence and sources of cheese contamination with pathogens at farm and processing
levels. Food Control, 21(6), 805-815.
Kubícková, J. & Grosch, W. (1998). Quantification of potent odorants in camembert cheese and
calculation of their odour activity values. International Dairy Journal, 8(1), 17-23.
Langer, Adam J. et al. (2012). Nonpasteurized Dairy Products, Disease Outbreaks, and State Laws
— United States, 1993–2006. Emerging Infectious Diseases, 18, 385-391.
Laupland, Kevin B.; Deirdre, L. Church; Ross, Terry & Pitout, Johann DD. (2006). Populationbased laboratory surveillance of Hafnia alvei isolates in a large Canadian health region.
Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 5(12).
Lee, S.Y.; Kotapati, S.; Kuti, J.L.; Nightingale, C.H. & Nicolau, D.P. (2006). Impact of extendedspectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella species on clinical
outcomes and hospital costs: a matched cohort study. Infection Control and Hospital
Epidemiology, 27(11), 1226–1232.
Licitra, Giuseppe (2010). World wide traditional cheeses: Banned for business?. Dairy Science &
Technology, 90(4), 357-374.
Livsmedelsverket (2007). Livsmedelsprovtagning i offentlig kontroll och mikrobiologisk bedömning
av livsmedelsprov, 24 januari. Hämtad 2013-05-16 från
http://www.slv.se/upload/dokument/livsmedelsforetag/vagledningar/vagledning_om_
livsmedelsprovtagning_i_offentlig_kontroll_och_mikrobiologisk_bedomning_av_
!35
livsmedelsprov_del_1_2.pdf.
López Sabater, EI.; Rodríguez Jerez, JJ.; Hernández Herrero, MM. & Mora Ventura, MT. (1994).
Evaluation of histidine decarboxylase activity of bacteria isolated from sardine (Sardina
pilchardus) by an enzymic method. Letters in Applied Microbiology, 19(2), 70-75.
Lorenz, W.; Doenicke, A.; Schöning, B.; Ohmann, C. H.; Grote, B. & Neugebauer, E. (1982).
Definition and Classification of the Histamine-Release Response to Drugs in Anaesthesia
and Surgery: Studies in the Conscious Human Subject. Wiener klinische Wochenschrift,
60(17), 896-913.
Macedo, A. C.; Malcata, F. X. & Hogg, T. A. (1995). Microbiological profile in Serra ewes’ cheese
during ripening. Journal of Applied Bacteriology, 79(1), 1-11.
Madigan, Michael; Martinko, John; Stahl, David & Clark, David (2011). Brock Biology of
Microorganisms. San Fransisco, United States: Benjamin Cummings, Pearson Education.
Maifreni, Michela; Frigo, Francesca; Bartolomeoli, Ingrid; Innocente, Nadia; Biasutti, Marialuisa &
Marino, Marilena (2013). Identification of the Enterobacteriaceae in Montasio cheese and
assessment of their amino acid decarboxylase activity. Journal of Dairy Research, 2013, 80,
122–127.
Marilley, L. & Casey, M. G. (2004). g. International Journal of Food Microbiology,
90(2),
139-159.
Marino, M.; Maifreni, M.; Moret, S. & Rondinini, G. (2000). The capacity of Enterobacteriaceae
species to produce biogenic amines in cheese. Letters in Applied Microbiology, August 2000,
31(2), 169-73.
Massa, Salvatore; Gardini, Fausto; Sinigaglia, Milena; Guerzoni, Maria Elisabetta (1992).
Klebsiella pneumoniae as a Spoilage Organism in Mozzarella Cheese. Journal of Dairy
Science, 75(6), 1411–1414.
Meng, J.; Doyle, M.P.; Zhao, T. & Zhao, S. (2001). Enterohemorrhagic Escherichia coli. Ingår i:
M.P. Doyle, L.R. Beuchat and T.J. Montville (Red.), Food Microbiology - Fundamentals
and Frontiers. Washington, D.C.: American Society for Microbiology.
Montel, Marie-Christine et al. (2014). Traditional cheeses: Rich and diverse microbiota with
associated benefits. International Journal of Food Microbiology, 117, 136-154.
Morales, P.; Feliu, I.; Fernández-García, E. & Nuñez, M. (2004). Volatile compounds produced in
cheese by Enterobacteriaceae strains of dairy origin. Journal of Food Protection, 67,
567-573.
Mounier, Jérôme (2008). Microbial Interactions within a Cheese Microbial Community. Applied
and Environmental Microbiology, 74(1), 172-181.
Nationalencyklopedin (2014a). Koliforma bakterier. Hämtad 2014-08-02 från http://www.ne.se/
koliforma-bakterier.
Nationalencyklopedin (2014b). In vitro. Hämtad 2014-08-22 från http://www.ne.se/in-vitro.
Nationalencyklopedin (2014c). Pastörisering. Hämtad 2014-09-28 från http://www.ne.se/
pastörisering.
Nimri, LF. (2013). Escherichia albertii, a newly emerging enteric pathogen with poorly defined
properties. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 77(2), 91-95.
Niven, C. F. Jr.; Jeffrey, M. B. & Corlett, D. A. Jr. (1981). Differential plating medium for
quantitative detection of histamine-producing bacteria. Applied and Environmental
Microbiology, 41(1), 321-322.
Oliver, Stephen P.; Boor, Kathryn J.; Murphy, Steven C. & Murinda, Shelton E. (2009). Food safety
hazards associated with consumption of raw milk. Foodborne Pathogens & Disease, 6,
793-806.
!36
Parente, E. & Cogan, T. M. (2004). General Aspects. Ingår i: Fox, PF (Red.), Cheese: Chemistry,
Physics and Microbiology. London, UK: Academic Press.
Pircher, Anita; Bauer, Friedrich & Paulsen, Peter (2007). Formation of cadaverine, histamine,
putrescine and tyramine by bacteria isolated from meat, fermented sausages and cheeses.
European Food Research and Technology, 226(1-2), 225–231.
Podschun, R. & Ullmann, U. (1998). Klebsiella spp. as nosocomial pathogens: epidemiology,
taxonomy, typing methods, and pathogenicity factors. Clinical Microbiology Reviews, 11,
589–603.
Rahn, O. (1937). New principles for the classification of bacteria. Zentralbl Bakteriol Parasitenkd
Infektionskr Hyg Abt. 2(96), 273-286.
Riksdagen 1991/92:Ub459. Högre restaurangutbildning vid högskolan i Örebro. Motion till
riksdagen 1991/92:Ub459 av Maud Björnemalm m.fl. (s, m, fp, c, kds, v).
Roig-Sagués, AX.; Hernández Herrero, MM.; Rodríguez Jerez, JJ.; López Sabater, EI. & Mora
Ventura, MT. (1996). Histidine Decarboxylase Activity of Bacteria Isolated from Raw and
Ripened Salchichón, a Spanish Cured Sausage. Journal of Food Protection, 5, 448-561.
Roig-Sagués, Artur X.; Molina, Angélica P. & Hernández-Herrero, M. (2002). Histamine and
tyramine-forming microorganisms in Spanish traditional cheeses. European Food Research
and Technology, 215(2), 96-100.
Schwarz, G. & Thomasow, J. (1950). Aroma constituents in Tilsit cheese. Milchwissenschaft, 5(11),
412-416.
Skandamis, Panagiotis N. & Nychas, George-John E. (2012). Quorum Sensing in the Context of
Food Microbiology. Applied and Environmental Microbiology, 78(16), 5473–5482.
Tallon, Pam; Magajna, Brenda; Lofranco, Cassandra & Leun, Kam Tin (2005). Microbial indicators
of faecal contamination in water: a current perspective. Water, Air and Soil Pollution, 166,
1-4.
Tan, Jia-Yi; Yin, Wai-Fong & Chan, Kok-Gan (2014). Quorum Sensing Activity of Hafnia alvei
Isolated from Packed Food. Sensors, 14(4), 6788-6796.
Taylor, S. L.; Guthertz, L. S.; Leatherwood, M. & Lieber, E. (1979). Histamine production by
Klebsiella pneumoniae and an incident of scombroid fish poisoning. Applied and
Environmental Microbiology, 37(2), 274-278.
Tham, Wilhelm & Danielsson-Tham, Marie-Louise (2014). Food Associated Pathogens. Boca
Raton, United States: CRC Press.
Tsai, F.C.; Huang, Y.T.; Chang, L.Y. & Wang, J.T. (2008). Phylogenic liver abscess as endemic
disease, Taiwan. Emerging Infectious Diseases, 14(10), 1592–1600.
Viana, Eliseth Souza; Campos, Maria Emilene; Ponce, Adriana Reis; Mantovani, Hilário Cuquetto
& Vanetti, Maria Cristina (2009). Biofilm formation and acyl homoserine lactone production
in Hafnia alvei isolated from raw milk. Biological Research, 42, 427-436.
Vivas, J.; Padilla, D.; Real, F.; Bravo, J.; Grasso, V. & Acosta, F. (2008). Influence of environmental
conditions on biofilm formation by Hafnia alvei strains. Veterinary Microbiology, 129(1-2),
150–155.
Warmke, Rainer; Belitz, Hans-Dieter & Grosch, Werner (1996). Evaluation of taste compounds of
Swiss cheese (Emmentaler). Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung,
203(3), 230-235.
Westling, Magnus (2013). Att äta eller inte äta: Mikrobiologisk och sensorisk analys av
opastöriserade franska dessertostar. Örebro universitet, Restaurang- och hotellhögskolan.
Grundnivå, examensarbete. Hämtad 2014-06-16 från
http://oru.diva-portal.org/smash/get/diva2:629150/FULLTEXT01.pdf.
!37
Wiskur, B.J.; Hunt, J.J. & Callegan, M.C. (2008). Hypermucoviscosity as a virulence factor in
experimental Klebsiella pneumoniae endophthalmitis. Investigative Ophthalmology &
Visual Science, 49(11), 4931–4938.
Yu, V.L. et al. (2007). Virulence characteristics of Klebsiella and clinical manifestations of
K. pneumoniae bloodstream infections. Emerging Infectious Diseases, 13(7), 986–993.
Zago, M.; Bonvini, B.; Platero, A. M. M.; Mucchetti, G.; Carminati, D. & Giraffa, G. (2007).
Characterisation of Escherichia coli isolated from raw milk cheeses. Annals of
Microbiology, 57(1), 49–54.
Örebro universitet (2012). Forskning, 28 november. Hämtad 2014-04-10 från
http://oru.se/Institutioner/Restaurang-och-hotellhogskolan/Forskning/.
Özoğul, F. (2004). Production of biogenic amines by Morganella morganii, Klebsiella pneumoniae
and Hafnia alvei using a rapid HPLC method. European Food Research and Technology,
219(5), 465-469.
!38
Bilaga 1. Artikeldatabassökning
Datum Databas
Sökord
2014- Summon
1. sensory
03-26
gram-negative
cheese
Antal Kombiref.
nation
Antal
referenser i
kombination
Antal
lästa
abstrakt
Antal
lästa
artiklar
Använda
artiklar
529
-
-
4
2
0
2014- Summon
03-26
2. hafnia alvei
-
1+2
18
2
1
1
2014- Summon
04-10
3. aged soft
cheese
3041
-
-
3
0
0
2014- Summon
04-10
4. escherichia
coli
-
1+4
289
2
2
1
2014- Summon
04-10
5. cheese
spoilage
4244
-
-
1
0
0
201406-15
Summon
6. klebsiella
pnemoniae
cheese
453
-
-
12
10
2
201406-19
Summon
7. pathogenic
-
2+7
425
3
1
1
201406-19
Summon
8. enterobacteriaceae
strains dairy
2316
-
-
8
6
2
201406-30
Summon
9. e. coli
virulence
factors
35223
-
-
4
1
1
Bilaga 2. Informationsblad om uppsatsprojektet
Inget kan dofta ur inget
Identifiering av Enterobacteriaceae isolerade från fyra opastöriserade franska
mögel- och kittostar
Hej!
Jag heter Magnus Westling och läser magisterprogrammet vid Restaurang- och hotellhögskolan i
Grythyttan, Örebro universitet. Under denna vårtermin gör jag en datainsamling till min uppsats
som ska gå upp för opponering under nästa termin. Syftet är att undersöka vilka
Enterobacteriaceae-arter som ett urval av opastöriserade franska mögel- och kittostar innehöll.
Dessa ostar användes i ett tidigare forskningsprojekt som visade på positiva och signifikanta
korrelationer mellan antalet Enterobacteriaceae 37°C och intensiteten av smak- och
doftupplevelserna gödsel, bitter, stickande, metallisk och ammoniak. Frågeställningar som tas upp
är:
• Vilka arter av familjen Enterobacteriaceae kan påvisas i ostarna?
• Hur är de olika Enterobacteriaceae-arternas förmåga att påverka smak- och doftupplevelser i
opastöriserade mögel- och kittostar?
• Vilka är dessa bakteriers eventuella sjukdomsframkallande egenskaper?
Det finns två personer som ni kan kontakta vid eventuella frågor. Professor Wilhelm Tham är min
handledare och går att nå på telefon 019-30 30 00 eller e-post [email protected]. Mig går det att nå
på mobil 076-054 27 35 eller på e-post [email protected].