Caroline Harlos Reglering av protein A Den gula stafylokocken (Staphylococcus aureus) orsakar allt från vanliga hudinfektioner till hjärnhinne‐ och hjärtsäcksinflammationer samt blodförgiftning. Bakterien kommer under en infektion att möta många nya miljöer, vilket kräver en bred repertoar av försvars‐ och överlevnadsmekanismer. Då bakterien ska infektera en vävnad behöver den på sin yta ha proteiner, som kan binda bakterien till den utsatta vävnaden. Under en infektion behöver bakterien även kunna skydda sig mot värdens immunförsvar, bakterien kan t ex producera protein A, ett protein som binder till värdens antikroppar. De proteiner som är involverade i en infektionsprocess kallas även för virulensfaktorer. Då det på senare tid uppkommit stafylokocker som är motståndskraftiga mot antibiotika, är det av stor vikt att studera de mekanismer som bidrar till bakteriens förmåga att orsaka sjukdom. För att inte slösa på energi och material i onödan samt för att producera de proteiner som behövs vid respektive infektionsfas regleras produktionen av proteiner i bakterien efter vad som krävs i den aktuella miljön. Regleringen av de flesta virulensfaktorer i S. aureus medieras av antingen agr‐locuset eller någon av Sar‐
homologerna (ett antal proteiner t ex SarA, SarR och SarT). Den molekyl från agr‐
locuset som styr regleringen av virulensfaktorerna kallas RNAIII. Det är en RNA‐
molekyl som via en ännu okänd mekanism stänger av och på olika gener. RNAIII‐
produktionen i bakterien ökar med bakteriemängden vid en viss vävnad, via en mekanism som kallas quorum sensing. Jag har i min studie tittat närmare på regleringen av protein A syntesen i S. aureus. Man har vid tidigare studier kunnat se att närvaro av SarS (en av Sar‐homologerna), ökar mängden protein A i bakterien. Jag har undersökt om det krävs att SarS är närvarande i bakterien för att protein A ska finnas i större mängder, eller om man kan få en ökad mängd protein A med andra Sar‐homologer (Rot, SarT och TcaR) även utan SarS. Jag kom i min studie fram till att Rot men inte SarT eller TcaR har förmågan att öka halten av protein A i bakterien utan att SarS är närvarande. För att hitta andra regulatorer av protein A samt dess regulator SarS, syntetiserades små bitar av DNA från protein A/SarS genens promotor, dessa bitar bands sedan fast på magnetkulor. När extrakt från olika mutanter fick inkubera med dessa DNA‐
försedda kulor kunde de proteiner med affinitet för protein A/SarS promotorn binda in. Jag kunde med denna metod isolera flera olika Sar‐homologer, som möjligtvis kan vara inblandade i detta komplexa nätverk. Handledare: Staffan Arvidson och Lars Hederstedt Examensarbete 20 p i Biologi Ht 2003 Mikrobiologiskt och tumörbiologiskt centrum, Karolinska Institutet. Institutionen för cell‐ och organismbiologi, Lunds universitet Abstract Protein A, encoded by the spa gene, is a well‐known virulence factor produced by Staphylococcus aureus. It binds the human IgG in a non immune fashion, which will inhibit the immune clearance in the organism as well as mediate adherence to tissue in the host. The expression of virulence factors, such as spa, is regulated by several homologous proteins (the Sar family of DNA binding proteins) as well as by the agr‐operon and its effector molecule RNAIII. This master thesis study was focused on the regulation of spa expression in S. aureus. The Sar homologues SarS, SarT and Rot have previously been shown to activate the expression of spa, while sarA is known to repress the expression of spa. In order to find other potential regulators of spa an affinity purification system was set up using the spa promoter as a target DNA. This was also done with the promoters of sarS and rot. Proteins with affinity for the different promoters were characterized with MALDI‐TOF mass spectrometry. Several different Sar homologues could be isolated with this method. The regulators SarA, SarR and MgrA were all shown to have affinity for both the spa and sarS promoters. SarS could be detected as it bound to the promoter of spa as well as to its own promoter, when overexpressed from a plasmid. The binding of SarS to the promoters seemed to compete with the binding of SarA. In addition, Western immunoblotting was used, in order to investigate some of the proposed pathways of spa regulation in S. aureus. It was found that Rot, but not SarT could activate the expression of spa in a sarS knockout strain, suggesting that Rot could have a direct effect on spa. Western immunoblot detection of protein A and serine protease (sspA) was used in order to investigate a possible interaction between RNAIII and Rot. Rot has been shown to activate spa and repress sspA. When inducing rot from a xylose driven promoter on a plasmid, one could detect the regulatory effect of Rot on its target genes. This was done both in an agr knockout and in a wild type strain. The effect of Rot seemed to require less induction of rot from the xylose driven promoter in an agr mutant compared to the wild type strain, which suggests that the Rot/RNAIII interaction hypothesis may be true.
