fulltext

Betydelsen av Neuropeptid S i regleringen
av duodenums barriärfunktion
Evelina Rosenqvist
Handledare: Markus Sjöblom
Uppsala universitet
Institutionen för neurovetenskap
Enheten för fysiologi
Självständigt arbete, 30 hp, Läkarprogrammet
Innehållsförteckning
Introduktion/Sammanfattning ............................................................................................................. 3
Bakgrund ............................................................................................................................................. 4
Gastrointestinalkanalen ................................................................................................................... 4
Patologiska tillstånd i gastrointestinalkanalen................................................................................. 5
Duodenalväggens uppbyggnad........................................................................................................ 7
Duodenalmukosans permeabilitet ................................................................................................... 7
Det enteriska nervsystemet .............................................................................................................. 8
Duodenums motorik ........................................................................................................................ 9
Duodenums bikarbonatsekretion ................................................................................................... 10
Duodenums nettovätskeflöde ........................................................................................................ 11
Neuropeptid S ................................................................................................................................ 11
Syfte .............................................................................................................................................. 13
Material och metod............................................................................................................................ 14
Försöksdjur .................................................................................................................................... 14
Kirurgiskt ingrepp ......................................................................................................................... 14
Analyser......................................................................................................................................... 15
Inklusionskriterier ......................................................................................................................... 16
Statistiska analyser ........................................................................................................................ 17
Försöksprotokoll ............................................................................................................................ 17
Kontroller ...................................................................................................................................... 19
NPS-behandling............................................................................................................................. 19
Diskussion ......................................................................................................................................... 20
Referenser.......................................................................................................................................... 23
2
Introduktion/Sammanfattning
Människans fysiologi har fascinerat läkare och forskare i över två millennier, men trots
intensiv forskning är området fortfarande långt ifrån helt klarlagt. Under senare år har
uppmärksamhet riktats mot samverkan mellan olika system, som tidigare setts som
funktionellt skiljda åt.
I flera sjukdomar är det svårt att hitta en enskild utlösande faktor. Istället kan det röra
sig om en förändrad funktion i och/eller förändrat samspel mellan flera olika system. Ett
typiskt exempel är inflammatorisk tarmsjukdom (IBD). I tarmens vägg ligger nervceller nära
immunceller och endokrina celler som samverkar både i den friska och i den sjuka människan.
Systemen kan ha vissa signalmolekyler gemensamma, och därigenom kunna kommunicera
med varandra.
Neuropeptid S (NPS) är en relativt nyupptäckt signalmolekyl som binder till
neuropeptid S-receptorn (NPSR1). Receptorn finns uttryckt i specifika delar av det centrala
nervsystemet, men även i epitel i perifera organ. Djurförsök har visat att administrering av
NPS dels ökar vakenhetsgraden men också haft ångest- och aptitdämpande effekt. NPS har
gett förlängd passagetid i distala tjocktarmen, men i övrigt är effekterna av NPS i magtarmkanalen till största del okända. NPSR1 är överuttryckt vid inflammatoriska tillstånd, och
polymorfismer i NPSR1-genen är associerade med IBD. Lite är dock känt om vilka funktioner
i mag-tarmkanalen NPS faktiskt är involverad i.
I denna studie har vi studerat effekterna av NPS på proximala duodenums reglering av
motorik, bikarbonatsekretion, mukosapermeabilitet, transepitelialt nettovätskeflux och
medelartärblodtryck hos sövda råttor. Resultaten visar att NPS har en tydlig inhibitorisk effekt
på motoriken i tunntarmen, men de övriga parametrarna påverkades inte.
3
Bakgrund
Gastrointestinalkanalen
Människokroppen behöver kontinuerlig tillförsel av näringsämnen och vätska för att överleva.
I normala fall tillförs all föda till gastro-intestinalkanalen, där den stegvis omvandlas för att
kroppen ska kunna tillgodogöra sig beståndsdelarna och använda dem i sin egen metabolism.
Mag-tarmkanalens sammanhängande håliga organ har med evolutionen utvecklats till att
hantera olika uppgifter i födohanteringen. I munhålan tuggas maten till mindre bitar och
smörjs med saliv, och där frisätts även enzymerna amylas och lipas som börjar spjälka
kolhydrater och fett.
Med hjälp av mag-tarmkanalens motoriska aktivitet, peristaltiken, transporteras maten
distalt i organsystemet. Genom matstrupen förs den vidare till magsäcken där den tillfälligt
lagras samtidigt som den blandas och finfördelas ytterligare, dels genom mekanisk knådning
av starka motoriska kontraktioner och dels genom blandning med saltsyra, slem och enzymer.
Det låga pH som uppstår i magsäcken är inte bara nödvändigt för att det proteinspjälkande
enzymet pepsin ska aktiveras och verka optimalt, utan är också ett skydd mot patogener som
intagits tillsammans med födan. Men det kemiska skyddet är inte det enda, tarmen är också
kroppens största immunologiska organ4 och innehåller majoriteten av kroppens
immunoglobulinproducerande celler. Immunförsvaret i gastro-intestinalkanalen bekämpar
vissa antigener från omvärlden, men har också en viktig funktion i att tillåta tolerans mot
andra antigener, och mot de bakterier som finns i framför allt tjocktarmens normalflora.
Segmenten i mag-tarmkanalen separeras på vissa ställen av sfinktrar, ringar av glatt
muskulatur. Mellan ventrikeln och tunntarmen finns pylorussfinktern. Kontraktionerna i
ventrikelns vägg för maten distalt samtidigt som pylorus kontraheras med varje peristaltisk
våg, vilket leder till att en del av födan trycks tillbaka in i magsäcken. Hur mycket som tillåts
lämna magsäcken beror inte bara på kontraktionernas styrka, utan även på pylorusmuskelns
öppenhetsgrad, som regleras av flera faktorer. När ventrikeln fylls med föda utlöses reflexer i
dess vägg som minskar motståndet i sfinktern. Andra signaler leder till högre tonus i
sfinktern, t.ex. ökat tryck i duodenallumen, lågt pH eller hög koncentration av näringsämnen.
Dessa tyder på att tunntarmen redan innehåller den mängd magsäcksinnehåll den klarar av att
bearbeta, och att mindre föda ska tillåtas passera från magsäcken.
4
Efter att ha passerat pylorus fortsätter födomassan ut i tunntarmen, som består av tre
delar - duodenum, jejunum och ileum. I tunntarmen sker större delen av den kemiska
spjälkningen och nästan all absorption av näringsämnen. Från levern utsöndras galla, som är
nödvändig för spjälkning och absorption av fett genom att den finfördelar fettdropparna i
tarminnehållet, så att enzymet lipas, som ej är fettlösligt, kan spjälka fettet. Lipas produceras
av pankreas, som även producerar bl.a. amylas och prekursorer till proteinspjälkande
enzymer, som trypsin. Bukspottet från pankreas innehåller även mycket bikarbonatjoner, som
neutraliserar det sura pH som maginnehållet fått av ventrikelns HCl-sekretion. Dels behöver
pankreasenzymerna det högre pH-värdet för att vara verksamma, dels riskerar
tunntarmväggen annars att skadas av syran.
När tarminnehållet kommit halvvägs genom tunntarmen är större delen av alla
nutrienter absorberade. Absorptionen i tarmen sker i de flesta fall oberoende av individens
nutritionsstatus. Kroppen lagrar alltså in så mycket som möjligt av näringsämnena från den
intagna födan. Undantag är kalcium och järn, som har ett reglerat upptag. Upptaget av vatten
samt natrium- och kloridjoner sker delvis i tunntarmen, men en stor del passerar vidare till
tjocktarmen. Där fullbordas absorptionen, innan den färdigprocessade avföringen töms ut ur
kroppen.5, 6
Patologiska tillstånd i gastrointestinalkanalen
Liksom alla övriga organsystem i människokroppen kan gastrointestinalkanalen utveckla
sjukdomstillstånd. Den utsätts dagligen för en stor mängd patogener som följer med födan
från miljön utanför kroppen, och ibland lyckas ta sig förbi tarmens immunförsvar. Även
sjukdomar i mag-tarmsystemets egna komponenter, t.ex. autoinflammatoriska sjukdomar eller
neurologisk dysfunktion, kan förvärvas eller ha en medfödd risk i form av predisponerande
genetiska varianter. Till och med psykiatriska sjukdomar kan påverka tarmens funktion.
Diagnostiken av gastro-intestinala (GI)sjukdomar är inte alltid helt enkel då olika sjukdomar
kan ge väldigt liknande symptom – t.ex. kan ett ventrikelulcus ge i princip identiska besvär
som funktionell dyspepsi, och blod i avföringen kan vara ett tecken på bl.a. inflammatorisk
tarmfunktion och tjocktarmscancer. Olika sjukdomar påverkar olika parametrar i tarmen. I
denna studie undersöks sekretionen av bikarbonat från tunntarmsslemhinnan, motoriken i
proximala tolvfingertarmen, samt permeabilitet och vätskeflux över slemhinnan.
5
När vätskeflödet över tarmmukosan ut i tarmlumen ökar till den grad att kroppen inte
hinner återabsorbera tillräckligt stor mängd förlorar kroppen vätska. Kolera (bakterien Vibrio
cholerae) orsakar varje år 100 000-130 000 dödsfall per år världen över, framför allt i fattiga
länder med dålig tillgång till sjukvård.7 Kolerabakterien orsakar det ökade vätskefluxet genom
att dess toxiner påverkar sekretionen av elektrolyter ut i tarmen. Toxinet ökar produktionen av
cAMP genom att påverka G-proteiner i mukosacellerna, vilket leder till ökad utsöndring av
H2O, Na+, K+, Cl-, and HCO3-. Den höga salthalten i lumen drar ut vätska från tarmen genom
osmos. Det är i de flesta fall inte brist på antibiotika som orsakar dödsfallen, utan brist på
vätskeersättning för att kompensera hypovolemin. Även lindrigare bakteriella och virala
infektioner kan ge ett ökat vätskeflöde ut i tarmlumen och lösare avföring.
Motoriken i tarmväggen initieras och styrs av det enteriska nervsystemet (ENS).
Nervcellerna som utgör ENS migrerar under vecka fyra till sju av fosteranläggningen kaudalt
från neurallisten tills de innerverar hela mag-tarmkanalen. Vid Hirschsprungs sjukdom ger en
störd migration upphov till en otillräcklig innervation av hela eller en del av den distala
tjocktarmen. Ganglierna i tarmväggen medierar normalt peristaltisk relaxation genom
frisättning av NO till de glatta muskelcellerna runt omkring. Vid Hirschsprungs sjukdom
förblir det aganglionära tarmsegmentet kontraherat utan peristaltik, och det uppstår en slags
ileus med påföljande dilatation av den normalt innerverade proximala tarmen. Sjukdomen
upptäcks vanligtvis under de första levnadsdagarna, och behandlas genom resektion av det
drabbade tarmsegmentet.8
Irritabel tarm (IBS) är ett tillstånd som påverkar så mycket som 5-20% av alla
människor.9 På svenska kallas sjukdomen ofta för funktionella tarmbesvär, eftersom ingen
organisk orsak har hittats och diagnosen inte kan ställas genom biokemiska, histopatologiska
eller radiologiska undersökningar. Typiska besvär för personer med IBS är magsmärtor, gaser
och förstoppning/diarré (eller en blandform som växlar mellan båda). En hypotes om hur IBS
uppkommer är förändringar i ENS, möjligtvis orsakade av infektiösa organismer och/eller
låggradig inflammation. Neuronen i ENS kommunicerar genom neurotransmittorer, bl.a. en
stor mängd olika neuropeptider. Förekomsten av neuropeptiduttryckande celler i tunntarmen
är förändrad hos IBS-patienter, bl.a. finns minskad densitet av GIP- (gastric inhibitory
polypeptide) och somatostatin-, samt sekretin- och kolecystokininuttryckande celler. Man har
också hittat vissa genetiska förändringar hos IBS-patienter jämfört med friska kontroller i
gener som kontrollerar serotinerg signalering. Alla dessa transmittorer medverkar i
regleringen av sekretion och tarmmotilitet.10 Störningar i tarmmotiliteten hos IBS-patienter
6
har även visats ha att göra med obalans mellan de sympatiska och parasympatiska autonoma
nervsystemen.11
Tarmmukosan utgör en barriär som hindrar patogener i tarmlumen från att ta sig in i
kroppen. En ökad permeabilitet av denna barriär har setts i flera tarmsjukdomar, bl.a. IBS och
inflammatorisk tarmsjukdom (IBD).12 Det är inte helt klarlagt om den ökade permeabiliteten
orsakas av någon annan del i sjukdomsförloppet, t.ex. inflammatorisk aktivitet, eller om en
ökad genomsläpplighet finns sedan tidigare och faciliterar händelser (t.ex. bakterieupptag i
tarmen) som startar patogenesen.
IBD-patienter lider ofta av störningar i tarmmotoriken i form av minskad frekvens och
styrka på tarmkontraktionerna under inflammatoriska episoder och av typiska IBSsymptom.13 Det finns en stor komorbiditet mellan IBS och IBD, även om IBD till skillnad
från funktionella besvär kan påvisas genom labprover och mikro-/makroskopisk
vävnadsanalys. Vid inflammationstillstånd i tjocktarmen och hos IBD-patienter har man sett
minskat uttryck av vattenkanaler, aquaporiner, i mukosan, och därmed förändringar i
vätskeflux.14 Sekretoriska störningar brukar också föreligga i diarrésjukdomar.
Det är viktigt att komma ihåg att en sjukdom sällan påverkar enbart en funktion i
tarmen. När flera system är involverade i styrningen av olika funktioner och dessutom
kommunicerar med varandra blir sjukdomsförlopp som påverkar hela miljön i tarmen
svåröverskådliga. Även i normaltillståndet är de studerade parametrarna inte frikopplade från
varandra. Bikarbonatsekretionen har t.ex. visats höra samman med en fungerande
tarmmotorik.15 Trots det får man genom att studera enskilda faktorer en bättre förståelse för
hur olika sjukdomar påverkar tarmen, och nya infallsvinklar för att hitta botemedel.
Duodenalväggens uppbyggnad
Tunntarmens vägg består av fyra lager; mukosa, submukosa, muskularis och serosa. Mukosan
är belägen närmast tarmlumen och består av ett epitellager, lamina propria och muskularis
mukosae. Det yttersta lagret består främst av enskiktat cylinderepitel vars huvudsakliga
uppgift är att absorbera ämnen från lumen, men också av slemproducerande bägarceller,
enteroendokrina celler och Panethceller, vilkas funktion är att utsöndra antimikrobiella
ämnen. Lamina propria innehåller små blodkärl, nerv- och immunceller. Muskularis mukosae
är ett tunt lager glatt muskulatur. Submukosan består av lucker bindväv med större blodkärl
7
och körtlar. Muskularis externa har två lager glatt muskulatur, ett inre cirkulärt och ett yttre
longitudinellt. Serosan (som på vissa ställen i GI-kanalen kallas adventitia) är ett
bindvävslager täckt med skivepitel som omsluter organet.
För att öka absorptionsytan är tunntarmsväggen veckad i små fingerliknande utskott,
villi. Villiutskotten har vid sin bas körtelliknande strukturer som kallas Lieberkühnska
kryptor. Kryptcellerna har främst en sekretorisk funktion, medan epitelet på villi främst är
absorberande. Epitelcellerna fogas samman av proteinkomplex på de angränsande
lateralsidorna.5
Figur 1. Duodenalväggens uppbyggnad hos råtta.
Duodenalmukosans permeabilitet
Med en effektiv area på ca 200 m² utgör tunntarmens mukosa kroppens största kontaktyta mot
omvärlden. Transport över mukosan kan ske transcellulärt och paracellulärt. Den
transcellulära transporten är en aktiv process och går via proteiner i de apikala och
basolaterala cellmembranen. Transporten av vatten och elektrolyter mellan cellerna anses
dock till största del vara passiv, och begränsas av proteinkomplex som skapar förbindelser
8
mellan intilliggande epitelcellers
membran (Fig. 2). Främst
begränsas ämnens passage av
tight junctions, som sitter mest
apikalt. Tight junctions består av
ett flertal proteiner, men främst
claudin och occludin. Claudin
Figur 2. Tarmväggens epitelskikt.
bildar jonselektiva porer, medan occludin har kontakt med de närliggande cellernas
cytoskelett och kan ha en adhesiv eller signalförmedlande funktion. Vad som kan passera
genom tight junctions begränsas av ämnenas och jonernas molekylvikt och elektriska
laddning.16, 17 Andra proteinkomplex som fogar samman epitelceller är adherens junctions och
desmosomer.
Fogarna som håller samman cellerna är dock inte helt rigida, utan regleras fysiologiskt
och kan ändra struktur, vilket påverkar den paracellulära permeabiliteten. Det har visats att
perfusion av råttduodenum med hypoton lösning, hyperton lösning, etanol och saltsyra ökar
mukosapermeabiliteten för 51Cr-EDTA. Ökningen av permeabiliteten förstärks ytterligare vid
samtidig hämning av det prostaglandinbildande enzymet cyklooxygenas-2, och försvagas av
både den nikotinerga acetylkolinreceptorantagonisten hexamethonium och av nervblockeraren
tetrodotoxin, vilket tyder på att såväl endogena prostaglandiner som det enteriska
nervsystemet är inblandade i regleringen av permeabilitetsökningen.18 Även intraepiteliala
lymfocyter kan påverka den paracellulära tätheten via modulering av tight junctions, och
därmed begränsa mängden patogener som passerar över från lumen.19
Det enteriska nervsystemet
Det enteriska nervsystemet (ENS) är mag-tarmkanalens eget autonoma nervsystem. (Fig. 3)
ENS består av några 100 miljoner nervceller, vilket är lika många som i ryggmärgen eller i
resten av autonoma nervsystemet sammanlagt. I ENS används fler än 30
neurotransmittorsubstanser, de flesta likadana som de som används i centrala nervsystemet.
GI-kanalen innehåller mer än 90 % av kroppens totala mängd serotonin och ungefär hälften
av kroppens dopamin. Även peptider, hormoner och aminosyror används som transmittorer.
9
Neuronerna finns huvudsakligen
samlade i två strukturer i tarmväggen,
plexus submukosus (Meissners plexus) i
submukosan och plexus myenterikus
(Auerbachs plexus), som ligger mellan de
cirkulära och longitudinella muskellagren i
muskularis externa. Tarmens nervsystem är
ordnat som kompletta reflexkretsar i gastrointestinalkanalen. Sensoriska afferenta
neuron känner av förändringar i lumen, som
distension av tarmväggen, kemiska
förändringar i tarminnehållet eller mekanisk
stimulering, och signalerar vidare via
interneuron till efferenta neuron som
påverkar motorik och sekretion. ENS kan
fungera helt oberoende av ryggmärgen eller
hjärnans inflytande, men för en normal
tarmfunktion krävs modulering från
parasympatikus och sympatikus. Den
Figur 3. ENS.2
parasympatiska aktiviteten i magtarmkanalen går främst genom grenar av
vagusnerven. Parasympatisk aktivitet leder till ökad sekretion och motorik, vilket är gynnsamt
för matsmältning. Sympatisk aktivitet förmedlas av t.ex. prevertebrala ganglier och är nästan
alltid hämmande.
Vissa sensoriska signaler leds vidare centralt, och tarmen kontrolleras till viss del av
autonoma centra i hjärnstammen, men även av högre delar av centrala nervsystemet. Åsynen
och smaken av mat stimulerar t.ex. sekretionen av magsaft, medan fight-or-flight-situationer
leder till minskat blodflöde till gastrointestinalkanalen. Kommunikationen mellan hjärnan och
tarmen går också åt andra hållet, t.ex. ger kolecystokinin från duodenalmukosan
mättnadskänsla i CNS. Immunsystemet deltar också i samma kommunikation bl.a. via
mastceller i lamina propria, som kan ta emot signaler från hjärnan och ENS och får sensorisk
information från tarmen genom att delta i immunsvaret mot främmande antigen i lumen.5
10
Duodenums motorik
Tunntarmens motorik består i stort av två typer av rörelser (Fig. 4). Segmentella kontraktioner
består av att närliggande delar av tarmväggen
omväxlande kontraheras och relaxeras. Dessa
har inte till uppgift att föra tarminnehållet
framåt, utan blandar istället massan så att nya
delar av den får kontakt med absorberande
epitelceller och spjälkande enzymer.
Framåtdrivande rörelser för istället
födomassan distalt i mag-tarmkanalen.
Efter födointag är motoriken en
blandning av dessa två rörelser. Vid fasta, när
Figur 4. Kontraktionstyper i duodenum.
tarmen inte har något material att jobba med, induceras dock ett annat mönster med
regelbundna koordinerade kontraktioner och vila däremellan. Dessa migrerande
motorkomplex (MMC) börjar oftast i magsäcken och migrerar sedan distalt. (Fig. 5) Hos
människa går det 90-120 minuter från starten av ett komplex till starten av nästa, hos råtta ca
10-15 minuter.20, 21. MMC har en städande funktion i och med att de när de vandrar längs med
tarmen för med sig bakterier och rester av tarminnehåll distalt. MMC består av fyra faser. Fas
1 är en förlängd tyst period utan starkare kontraktioner. I fas 2 ökar frekvensen av
aktionspotentialer och kontraktiliteten, för att ha sin peak i fas 3 och sedan avta i fas 4.
Hormonet motilin, som produceras i duodenalmukosan, förstärker MMC-komplexen, men
verkar inte spela någon roll för födomotoriken. Den induceras istället av vagal aktivitet och
närvaron av näringsämnen i födan.
Tarmmotoriken påverkas av både sympatikus och parasympatikus samt lokala
faktorer som hormoner, prostaglandiner, osmolalitet i lumen och distension av tarmen.5, 22
Figur 5. Migrerande motorkomplex hos råtta. Registrering från egna försök.
11
Duodenums bikarbonatsekretion
Sekretion av vätejoner från parietalceller kan sänka magsäcksinnehållets pH till så låga nivåer
som ett eller lägre. Om denna syra kommer i
direktkontakt med epitelet är det mycket stor
risk att epitelet skadas och sår uppstår. För att
skydda sig mot den intraluminala syran har
epitelet i ventrikeln och duodenum en
diffusionsbarriär, som består dels av
apikalmembranen och tight junctions mellan
cellerna, som ger dem en relativ
impermeabilitet, dels av utsöndring av
bikarbonat, och dels av ett skyddande slemskikt
på epitelet. Lågt pH i duodenum utlöser
Figur 6. Diffusion och transport i duodenalmukosan3
frisättning av hormonet sekretin från S-celler i
duodenalväggen. Sekretin stimulerar utsöndringen av vätska och bikarbonat från pankreas,
och hämmar även magsyrasekretionen. Utförsgångarna från levern och pankreas har dock sin
gemensamma mynning en bit distalt om pylorus. Den första biten av duodenum behöver alltså
själv producera bikarbonat för att inte skadas av syran, och gör detta i högre grad än mer
distala delar av magtarmkanalen. Vätejonerna från magsäcken reagerar med bikarbonatjoner
som redan finns i lumen, och bildar koldioxid och vatten. Den lilla CO2-molekylen
diffunderar lätt in i epitelcellen, där enzymet karbanhydras utför den omvända reaktionen.
Bikarbonatjonen utsöndras återigen till lumen, medan vätejonen transporteras bort ur cellen
till blodet. HCO3− utsöndras genom en apikal Cl−/HCO3−-utbytare och cystisk fibrostransmembranresistansregulatorn (CFTR).23, 24 Bikarbonatsekretionen i magsäcken stimuleras
av aktivitet i vagala nervtrådar och av intraluminal syra. Mekanismen för hur syra ger en
stimulering verkar medieras både av neurala reflexer och av lokal produktion av
prostaglandin. Även slemskiktets tjocklek25, och bikarbonatutsöndringen i duodenum
påverkas av prostaglandiner.
HCO3−-sekretionen i proximala duodenum betraktas idag som det viktigaste epiteliala
försvaret mot saltsyra från magsäcken. Bikarbonatsekretionen är signifikant lägre hos
patienter med duodenalulcus, men ökar igen efter att H. pylori-infektionen har behandlats
med antibiotika. Bikarbonatsekretionen sker från epitelcellerna in i slemlagret, vilket består av
12
glykoproteinet mucin, fosfolipider, elektrolyter och vatten. Slemskiktet har två lager, ett fast
närmast mukosaytan, och ett lösligare ovanpå det fasta.26 Diffusionsbarriären skyddar mot de
proteinspjälkande enzymerna, som har svårt att tränga igenom slemskiktet. Pepsins aktivitet
hämmas också av det alkaliska pH-värdet närmast cellerna. De negativa bikarbonatjonerna
skapar ett alkaliskt mikroklimat närmast cellytan, och diffunderar sedan mot lumen. På vägen
möter de vätejoner som diffunderar åt andra hållet, in emot mukosan, vilket skapar en pHgradient med pH 7 närmast epitelet och pH 5 närmast lumen.27
En annan faktor som påverkar bikarbonatsekretionen är motoriken. Studier har visat att
igångsättande av motoraktivitet i tarmen efter paralytisk ileus är associerat med en ökning av
utsöndringen av HCO3−, möjligen genom en motorikutlöst intramural reflex.28
Duodenums nettovätskeflöde
Varje dag passerar ca 9 liter vätska genom tunntarmen. Dels tillför vi vätska när vi dricker,
dels sker utsöndring av saliv, magsaft, bukspott, galla och sekretion från tunntarmens epitel.
Av dessa 9 liter absorberas ca 8,5 liter vätska i tunntarmen. Hur absorptionen av vatten
faktiskt går till är ännu inte helt klarlagt och det är t.ex. okänt huruvida större delen av
vattentransporten sker trans- eller paracellulärt. En form av passiv transport är osmos, att ett
lösningsmedel flödar från hypotona till hypertona områden för att uppnå högre entropi. Vatten
följer alltså flöden av elektrolyter, framför allt Na+.
Osmolaliteten i tarmen varierar beroende på vilken typ av föda som intagits, vilket
bildar en osmotisk gradient mellan lumen och epitelcellerna. Man tänker sig att osmolaliteten
i lumen anpassas genom att elektrolyter och vatten tillåts passera paracellulärt. Om innehållet
i lumen är hypotont utsöndras elektrolyter medan vatten tas upp, och om innehållet är
hypertont sker det omvända. Tight junctions och andra strukturer som begränsar den
paracellulära passagen är dock som tidigare nämnt inte oföränderliga, och det är inte känt till
hur stor del absorptionen av vatten är aktiv respektive passiv. Nyligen har det visats att
vätskesekretionen från tunntarmen som svar på hypertonicitet i lumen hos råtta är större vid
fungerande tarmmotorik än i paralytisk tarm, och att den kan hämmas av nikotinerga
receptorblockare, vilket tyder på att det finns fysiologisk reglering av vätskeflödet över
mukosan.29 Man vet även att vatten absorberas transcellulärt genom kotransport med glukos
och kan diffundera genom aquaporiner i epitelcellmembranen.5, 30-32
13
Neuropeptid S
En neuropeptid är en signalmolekyl bestående av korta kedjor av aminosyror som frisätts från
nervceller. Även andra celltyper kan producera neuropeptider. De verkar på receptorer i
många av kroppens vävnader, och är en länk mellan nerv-, immun- och endokrinsystemen.
Förändringar i immunsystemet är ett nyckelsteg i utvecklingen av inflammatorisk
tarmsjukdom (IBD). IBD är associerad med störd barriärfunktion i tarmen och ett dysreglerat
immunsvar mot antigen som lyckas ta sig över det förändrade epitelet.19 Det har observerats
att det centrala och det enteriska nervsystemet kan modulera inflammation i tarmen genom
utsöndring av neuropeptider. Det neuroendokrina systemet och immunsystemet har flera
gemensamma mediatorer och kan kommunicera genom frisättning av cytokiner och
neuropeptider till receptorer i målorganen.33 I tarmen ligger nervändar och inflammatoriska
celler anatomiskt nära varandra i lamina propria. Kommunikationen mellan de två systemen
spelar en viktig roll i IBDs patofysiologi. I inflammerad tarmvävnad har man sett skador på
nerver och förändrad innervation av mukosan, samt förändrat uttryck av neuropeptider.34
Relativt nyligen hittades neuropeptid S (NPS) (Fig.
7), som binder till neuropeptid S-receptor 1 (NPSR1),
tidigare benämnd GPR154. Peptiden består hos
människa av 22 aminosyror och har mw 2 187,5.
Receptorn tillhör den G-proteinkopplade
receptorsuperfamiljen av membranproteiner.35 Uttrycket
av NPS speglar receptorns, vilket indikerar en auto- eller
parakrin aktiveringsmekanism. Bindning till receptorn
Figur 7. Neuropeptid S. 1
stimulerar intracellulär ökning av [Ca+] och [cAMP].36 De
högsta nivåerna av NPSR-mRNA har uppmätts i områden i hjärnan37, men de två isoformerna
av NPSR1, A och B, finns i epitelet på ett flertal av kroppens organ. Central administrering av
NPS ökar rörelseaktivitet och har en ångestdämpande effekt, samt ökar vakenhetsgrad och
hämmar alla stadier av sömn i försök med mus och råtta.37 Central injektion hos råtta påverkar
även födointaget.38-40 I GI uttrycks NPSR1 i enteroendokrina celler i kryptorna och
mononukleära celler41, och även i submukosala neuron och glatt muskulatur.42, 43
Polymorfismer i NPSR1-genens lokus på kromosom 7 har visat sig vara associerade med
IBD44 och astma45, som även den är en inflammationsmedierad sjukdom i ett organ med
barriärepitel mot omvärlden. Hittills har man funnit över 100 genetiska loki som är
associerade med ökad känslighet för de två vanligaste inflammatoriska tarmsjukdomarna,
14
Crohns sjukdom och ulcerös kolit.46 De flesta generna har länkats till defekter i
immunsystemet och i epitelets barriärfunktion47, 48, men några även till minskad clearance av
bakterier.49, 50Stimulering med de proinflammatoriska cytokinerna TNFα och INFγ ökar
uttrycket av NPSR1 i monocyter. Just TNFα verkar ha en nyckelroll i uppkomsten av defekt
barriärfunktion i tarmepitel vid Crohns sjukdom.51 Gällande den neuroendokrina
kommunikationen har man sett att stimulering med NPS i celler med överuttryck av NPSR1A leder till en dosberoende uppreglering av gener som kodar för peptidhormoner som
utsöndras från enteroendokrina celler.41 I en nylig undersökning visades att administration av
neuropeptid S har en inhibitorisk effekt på motoriken i tunntarmen hos vakna råttor. Lägre
doser orsakade oregelbundna myoelektriska spikes medan högre doser förlängde
intervallängden mellan MMC-komplexen. I samma undersökning visas i preparat av mänsklig
tunntarmsvävnad hade NPS en inhibitorisk effekt på kontraktionsamplituden. Tillförsel av
NPS ökade i samma experiment också uttrycket av vissa inflammatoriska markörer. (Rudholm
Feldreich et al., opublicerat manuskript). Stimulering av NPSR1 inducerar också ökat
mRNA-uttryck för ämnen inblandade i den fysiologiska tarmmotoriken.43 Att NPS har en roll
i tarmens motoriska funktion belyses också i andra studier, där den vid central, men inte
peritoneal, injektion visat sig ha påverkan på fekal transittid i distala kolon.52, 53
Syfte
Neuropeptid S är en relativt nyupptäckt neuropeptid som har visats inblandad i flera
funktioner, både i det centrala nervsystemet och i perifera organ. Uttrycket av neuropeptid S
receptor är uppreglerat i inflammatoriska tillstånd, och polymorfismer i genen för receptorn är
associerade med inflammatorisk tarmsjukdom. Om NPS är involverad i regleringen av
funktionella mekanismer i tunntarmen i är dock okänt. Det övergripande syftet i denna studie
är att undersöka om NPS är en del i den fysiologiska regleringen av duodenums paracellulära
permeabilitet, motorik, bikarbonatsekretion och nettovätskeflöde.
15
Material och metod
Försöksdjur
I studien användes utavlade hanråttor av stammen Sprague-Dawley avlade av Scanbur AB i
Sollentuna. Efter ankomst hölls djuren under kontrollerade förhållanden (21-22°C temperatur
samt 12 h ljus och 12 timmar mörker varje dygn) vid Biomedicinskt centrums (BMC) djurhus
minst en vecka innan försöket. De förvarades i standardiserade burar med minst två råttor i
varje bur där de hade fri tillgång till vatten och pelletfoder. Djuren hölls fastande i cirka 16
timmar innan försöket, men hade fortsatt fri tillgång till dricksvatten. På försöksdagens
morgon sövdes djuren med en peritoneal injektion av Inactin (thiobutabarbital) i dosen 120
mg/kg kroppsvikt. Sövningen utfördes av samma person som tidigare hanterat djuren för att
minska den preoperativa stressen. Efter sövning transporterades djuret omedelbart till
forskningsavdelningen där experimenten utfördes. För att hålla djurets kroppstemperatur på
en jämn nivå (kring 37-38°C) placerades det på en värmeplatta och exponerades för ljus från
en värmelampa. Temperaturen monitorerades kontinuerligt med en rektaltermometer. Alla
experiment i studien är godkända av Uppsala djurförsöksetiska nämnd, Uppsala Tingsrätt,
Uppsala.
Kirurgiskt ingrepp
Råttorna trakeotomerades och en PE-200-kanyl (polyetylen) fördes in i luftstrupen för att
underlätta djurets spontanandning och hålla fria luftvägar. Arteria och vena femoralis
kateteriserades bilateralt med PE-50-katetrar. Artärkatetrarna var fyllda med fysiologisk
koksaltlösning (155 mM NaCl) med 20 IU heparin/ml och användes för kontinuerlig
registrering av medelartärtryck samt för blodprovstagning. Venkatetrarna var fyllda med
isoton NaCl och användes för kontinuerlig infusion av koksaltslösning och neuropeptid S
samt koksaltslösning innehållande permeabilitetsmarkören 51Cr-EDTA i hastighet av 1,0 ml/h.
NaCl-infusionen gavs för att kompensera för vätskeförluster under experimentet.
Buken laparatomerades längs med linea alba med ett cirka fem cm långt snitt. Ventrikel
och duodenum lyftes mycket försiktigt ut ur bukhålan med hjälp av tamponpinnar.
Gallgången kateteriserades strax innan dess mynning i tarmen med en PE10-kateter för att
samla upp galla och bukspott innan de kommit ut i duodenum.
16
En mjuk silikonsond fördes genom munnen via esofagus och ventrikeln och ut i
duodenum via pylorus där den fästes på plats med hjälp av en ligatur kring pylorussfinktern..
Ca 3 cm distalt om pylorus, direkt distalt om gallgångens mynning, diatermerades tarmen för
att skapa en blödningsfri öppning, som kateteriserades med en hård PE-320-kateter. Buken
stängdes sedan med några intramuskulära stygn i m. rectus abdominis och täcktes med
plastfolie för att minska vätske- och värmeförluster via såret.
Det proximala röret kopplades till en peristaltisk pump (Gilson Miniplus 3, Villiers–Le-Bel,
Frankrike) och duodenum perfunderades med isoton NaCl-lösning i hastigheten 0,4 ml/min.
Perfusatet samlades upp från det distala röret (Fig. 8). Efter avslutad operation tilläts djuret
återhämta sig i cirka en timme så att gastrointestinala, respiratoriska och cirkulatoriska
funktioner stabiliserades.
Figur 8. Schematisk bild av försöksmodellen.
17
Analyser
Duodenal bikarbonatsekretion
Alkaliniseringen i lumen mättes genom att baktitrera perfusatet i uppsamlingsrören till pH
4,90 med 10 mM HCl. Perfusatet blandades med hjälp av kontinuerligt bubblande av 100%-ig
kvävgas. Titreringen utfördes med pH-statutrustning (Autoburette ABU 901 och pH-stat
controller PHM 290, Radiometer, Köpenhamn, Danmark). pH-elektroden kalibrerades
dagligen med buffertlösningar (pH 4,00 och pH 7,00) innan försöken påbörjades. Det antogs
att volymen HCl som krävdes för att nå pH 4,90 var ekvivalent med det utsöndrade HCO3−
som fanns i varje prov.
Duodenal mukosapermeabilitet
Den paracellulära permeabiliteten utvärderades genom att mäta hur mycket 51Cr-EDTA som
passerar från blod till lumen via tarmmukosan. 51Cr-EDTA diffunderar fritt över
kapillärväggarna och distribueras därför jämnt i blod och interstitialrum. Molekylen tas inte
upp av cellerna och metaboliseras inte. Inom fysiologiska gränser har det visats att
basalclearance av 51Cr-EDTA inte påverkas av förändringar i blodflödet till tarmen, vilket
indikerar att molekylen passerar tarmmukosan via den paracellulära vägen, där
genomsläppligheten främst begränsas av tight junctions.54 Blodplasma och rör med perfusat
analyserades i en gammaräknare (1282 Compugamma CS, Pharmacia, Uppsala, Sverige). En
linjär regressionsanalys av plasmaproverna gjordes för att beräkna ett korresponderande
plasmavärde för varje perfusatprov. Blod-till-lumen clearance beräknades enligt formeln:
Clearance =
perfusat ⋅ (cpm / ml ) × perfusionshastighet ⋅ (ml / min)
×100 g
plasma ⋅ (cpm / ml ) × tarmvikt ⋅ ( g )
Duodenal motorik
Via en T-tub kopplades den proximala duodenalslangen till en tryckgivare som registrerade
det intraluminala trycket. En stegring på 2 mmHg över baslinjen räknades som motorik.
Tryckförändringarna analyserades i PowerLab®-mjukvara (AD Instruments Ltd. Hastings,
East Sussex, UK). Motorisk aktivitet i duodenum mättes i total area under kurva (AUC) per
10-minutsperioder.
18
Duodenalt nettovätskeflux
För att beräkna nettovätskeflödet över tarmväggen vägdes uppsamlingsrören före och efter
försöket. Efter avslutandet av varje försök samlades pumputflödet upp direkt i ett provrör.
Pumpens standardflöde beräknades som medelvikten av vätskemängden under två 10minutersperioder, och avvikelsen från det värdet betraktades som nettovätskeflux över
duodenalmukosan.
Blodtryck
Den ena femoralisartärkatetern kopplades till en tryckgivare som kontinuerligt registrerade
det systemiska medelartärblodtrycket i PowerLab®-mjukvara.
Inklusionskriterier
För att säkerställa att den motoriska aktiviteten återkommit efter tillförsel av parecoxib var
varje djur tvunget att ha >75 AUC 10 min-1 i medelvärde under basalperioden (0-30 min) för
att inkluderas i studien. Radioaktivitetsmarkören 51Cr-EDTA administreras intravenöst, och
djurens blod innehöll under försöken större mängd 51Cr-EDTA än mjukvävnaderna. För höga
värden i perfusatet tyder på kontaminering från blödning i tarmen, som kan uppstå under
operationen eller under försökets gång. Baserat på tidigare värden från samma försöksmodell
exkluderades permeabilitetsvärdena för de djur som under basalperioden hade ett medelvärde
högre än 1,0 ml min-1 100 g-1. För låga permeabilitetsvärden kan tyda på dålig perfusion av
mjukvävnad och sänkt allmäntillstånd. Den nedre inklusionsgränsen sattes till 0,1 ml min1
100 g-1. Med tidigare försök som referensram bestämdes lägsta tillåtna medelvärde för
bikarbonatsekretion under basalperioden till 4 µmol cm-1 h-1, och det högsta tillåtna till 26
µmol cm-1 h-1. För nettovätskeflux inkluderades basalperiodsmedelvärden större än -4 ml g-1
h-1 och mindre än 4 ml g-1 h-1, också det baserat på tidigare försök. Ett för lågt systemiskt
artärblodtryck leder till otillräcklig organgenomblödning, med ischemiska skador och
funktionsnedsättning som följd. Alla djur som inkluderades i studien var tvungna att ha ett
medelartärtryck >80 mmHg under basalperioden.
19
Statistiska analyser
Alla värden uttrycks som medelvärde ± SEM. Statistisk signifikans analyserades i
programmet GraphPad Prism 5.02, och ett P-värde på 0,05 sattes som den övre gränsen för
statistisk signifikans. Skillnader inom grupper analyserades med en envägs-ANOVA följt av
ett Tukey post-hoc test.
Försöksprotokoll
30 minuter efter att det kirurgiska ingreppet avslutats gavs parecoxib (Dynastat®) 10 mg/kg
kroppsvikt intravenöst för att reversera den paralytiska ileus som bukoperationen orsakat.15
Sammanlagt fick försöksdjuren vila minst 60 minuter efter utförd operation innan försöket
påbörjades.
Efter att tarmmotoriken återkommit administrerades den radioaktiva markören 51CrEDTA (krommärkt etylendiamintetraacetat) intravenöst som en bolusdos på ca 75 μCi, följt
av en kontinuerlig infusion på ca 50 μCi 51Cr-EDTA/timme under resten av försöket. 51CrEDTA tilläts fördela sig i vävnaderna i minst 30 minuter innan försöket startades. Vid två
tillfällen, 10 minuter innan försökets början och direkt efter försökets avslutande, togs ett
arteriellt blodprov på ca 0,3 ml. Vid den första provtagningen kompenserades volymförlusten
med en lika stor injektion av 7%-ig albuminlösning. Blodproven centrifugerades och 50 μl av
plasma från supernatanten samlades upp för att mäta radioaktivitet i blodet.
Perfusatet från duodenum samlades upp i vägda provrör som byttes var tionde minut i
totalt 150 minuter (120 min för kontrollförsök). Efter försöket vägdes provrören på nytt.
Studien innehöll en kontrollgrupp och en NPS-grupp. NPS-gruppen erhöll neuropeptid
S från råtta (H-6164, Bachem, Weil am Rhein, Tyskland) utspätt i NaCl-lösning (155 mM).
20
För NPS-gruppen delades försöksprotokollet in i fyra perioder enligt följande;
0-30 min, kontinuerlig i.v. infusion av isoton NaCl
30-70 min, kontinuerlig i.v. infusion av NPS 0,5 nmol kg-1 h-1.
70-110 min, kontinuerlig i.v. infusion av NPS 5 nmol kg-1 h-1.
110-150 min, kontinuerlig i.v. infusion av NPS 50 nmol kg-1 h-1.
Strax innan försökets avslutande öppnades buken och det isolerade tarmsegmentet
exciderades för mätning av längd, omkrets och våtvikt. Direkt därpå avlivades djuret med 1
ml mättad KCl-lösning i.v.
21
Resultat
Totalt har 16 st djur inkluderats i studien, 8 st är kontroller behandlade med endast fysiologisk
koksaltläsning och 8 st har behandlats med intravenös infusion med NPS. Alla djur hade ett
stabilt medelartärblodtryck >80 mmHg under basalperioden och kroppstemperaturen var
stabil på ~36,5-38°C.
Kontroller
För att åskådliggöra eventuella förändringar över tid delades försöken in i 4 tidsintervaller; 030, 30-60, 60-90 och 90-120 min för alla parametrar utom nettovätskeflux, som delades upp i
3 perioder; 0-30, 30-70 och 70-120 min.
Under det första tidsintervallet (0-30 min) var den motoriska aktiviteten (motoriken) i
duodenum 694 ±198 AUC 10 min-1 (n=8), ett värde som inte förändrades under försöket utan
låg stabilt över tid (Fig. 10.A).
Den paracellulära permeabiliteten (blod-till-lumen clearance av 51Cr-EDTA) sjönk
signifikant med tiden (Fig.10 B). Medelvärdet för permeabiliteten under intervallet 0-30 min
var 0,42 ± 0,09 ml min-1 100 g-1 (n=6). Jämfört med intervallet 0-30 min sjönk
permeabiliteten under intervallet 60-90 min till 0,28 ± 0,06 ml min-1 100 g-1 (p<0,01) och
under det sista tidsintervallet (90-120 min) sjönk permeabiliteten ytterligare till 0,23 ± 0,05 ml
min-1 100 g-1 (p<0,001).
I likhet med den paracellulära permeabiliteten sjönk duodenums utsöndring av
bikarbonatjoner med tiden (Fig. 10 C). Bikarbonatsekretionen var under intervallet 0-30 min
12 ± 2,1 µmol cm-1 h-1 (n=8). Jämfört med de inledande 30 min sjönk sekretionshastigheten
till 10,4 ± 2,0 µmol cm-1 h-1 (p<0,05) under perioden 30-60 min, 8,8 ± 1,7 µmol cm-1 h-1
(p<0,01) under perioden 60-90 min och till 8,5 ± 1,9 µmol cm-1 (p<0,001) under perioden 90120 min.
Nettovätskeflux förändrades inte över tid (Fig. 10 D, n=8). Nettovätskeflux var under
intervallet 0-30 min -0,17 ± 0,27 ml g-1 h-1.
22
Det systemiska medelartärblodtrycket (Fig. 10.E, n=8) förändrades inte signifikant
under försöken och ändrades i medel från 114 ± 5 mmHg vid försökets början till 106 ± 6
mmHg vid försökets avslutande.
23
Figur 10. Kontrollförsökens resultat för motorik (A), permeabilitet (B), bikarbonatsekretion (C),
nettovätskeflux (D) och medelartärtryck (E). *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 jämfört med
basalperioden (0-30 min). Värden uttrycks som medelvärde ± SEM.
24
NPS-behandling
Försöken inleddes med en 30-minutersperiod då djuret endast administrerades isoton NaCllösning. Efter den inledande kontrollperioden (0-30 min) administrerades neuropeptid S
intravenöst med tre på varandra stigande koncentrationer (0,5, 5 och 50 nM kg-1 h-1), 40 min
med varje koncentration. Försöket delades således upp i följande tidsintervall; 0-30, 30-70,
70-110 och 110-150 min.
Under det första tidsintervallet (0-30 min) var motoriken under kontrollperioden (0-30
min) var 603 ± 75 AUC 10 min-1 (Fig. 11.A, n=8). Kontinuerlig i.v. infusion med NPS 0,5
nM kg-1 h-1 minskade den motoriska aktiviteten signifikant till 400 ± 93 AUC 10 min-1
(p<0,001). Båda de högre koncentrationerna gav en signifikant minskning jämfört med
basalperioden, NPS 5 nM kg-1 h-1 till 336 ± 81 AUC 10 min-1 (p<0,001) och NPS 50 nM kg-1
h-1 till 293 ± 86 AUC 10 min-1 (p<0,001). Mellan de olika koncentrationerna var det ingen
signifikant skillnad.
Permeabiliteten var under basalperioden 0,28 ± 0,08 ml min-1 100 g-1 (Fig. 11.B, n=6).
Medelvärdet för det sista tidsintervallet (110-150 min) var 0,14 ± 0,03 ml min-1 100 g-1, vilket
var en minskning jämfört med basalperioden (p<0,05).
Bikarbonatsekretionen var under det första tidsintervallet (0-30 min) 8,7 ± 1,7 µmol cm1
h-1 (Fig. 11.C, n=8). Jämfört med basalperioden sjönk den under 30-70 min till 6,9 ± 1,3
µmol cm-1 h-1 (p<0,05), under 70-110 min till 6,3 ± 1,1 µmol cm-1 h-1 (p<0,01) och under 110150 min 5,8 ± 0,9 µmol cm-1 h-1 (p<0,001).
Det basala nettovätskeflödet under den första 30-minutersperioden var -1,1 ± 0,46 ml g-1
h-1 (Fig. 11.D, n=8). Administrering av NPS 0,5-50 nmol kg-1 h-1 påverkade inte
nettovätskeflödet.
NPS påverkade inte det systemiska medelartärblodtrycket, som i likhet med
kontrollgruppen låg stabilt (Fig. 11.E, n=8). Vid försökets början var medelartärtrycket 117 ±
7,6 mmHg, och hade vid avslutandet sjunkit till 102 ± 7,8 mmHg, vilket inte var en
signifikant sänkning.
25
Figur 11. Effekten av i.v. infusion av NPS på motorik (A), permeabilitet (B), bikarbonatsekretion (C),
nettovätskeflux (D) och medelartärtryck (E). *P<0,05, ***P<0,001 jämfört med basalperioden (0-30
min). Värden uttrycks som medelvärde ± SEM.
26
Diskussion
Resultaten i denna studie visar för första gången att neuropeptid S har en tydlig inhibitorisk
effekt på den duodenala tarmmotoriken. Kontinuerlig intravenös administrering av den lägsta
dosen (0,5 nM kg-1 h-1) inducerade en signifikant sänkning av den motoriska aktiviteten och
högre doser av NPS (5 och 50 nM kg-1 h-1) inducerade ytterligare sänkningar. Våra
observerade förändringar i den motoriska aktiviteten stämmer väl överens med resultaten i en
studie inom samma område vid Akademiska sjukhuset i Uppsala (Rudholm Feldreich et al,
opublicerat material), som också observerat en sänkning av tarmmotoriken. Resultaten i vår
studie visar även att NPS inte påverkar duodenalepitelets paracellulära permeabilitet,
bikarbonatsekretion, nettovätskeflöde eller det systemiska medelartärblodtrycket.
I tidigare studier har NPS minskat passagetiden genom distala kolon vid
intracerebroventrikulär injektion, men inte intraperitoneal. Man skulle därför kunna tänka sig
att NPS påverkar tarmen genom aktivering av centralnervösa, men inte perifera, receptorer.
Blod-hjärn-barriären utgör visserligen ett effektivt hinder för större molekylers passage
mellan blodet och CNS, men små mängder peptider har visats kunna ta sig över den genom
olika mekanismer.55 I Rudholm Feldreichs et al försök syntes dock inhibering av motoriken
både hos vakna råttor som fick NPS i.v. och i tarmbiopsier från människor som tillfördes NPS
i organbad. Det är därför rimligt att tänka sig att NPS hämmar motoriken genom en direkt
verkan i tarmen.
Regleringen av tarmens funktioner är komplicerade processer med multifaktoriella
mekanismer. Tarmens motorikreglering påverkas både av nervös reglering, hormoner,
luminala faktorer och inflammatoriska processer. Vissa signalmolekyler, t.ex. neuropeptid S,
är inblandade i, och påverkar själv, flera av de funktionsreglerande systemen.
Polymorfismer i genen för NPS-receptorn har visat sig vara associerade med
inflammatorisk tarmsjukdom, och receptorn är överuttryckt i inflammatoriska tillstånd. Vid
IBD syns en störd sensorik och motorik i tarmen. Vid IBD föreligger också ökad
permeabilitet av tarmmukosan56, förändringar i immunsystemet och regleringen av
inflammation. Inhibering och störning av den normala motoriska aktiviteten leder till
bakterieöverväxt i tarmen.57 Studier finns som visar att avledning av faeces från tarmen
förhindrar återinsjuknande vid Crohns sjukdom58, och att ökad mängd bakterier i tarmen leder
till uppreglering av adhesionsmolekyler och granulocytinfiltration, vilka båda reduceras av
antibiotika eller påskyndning av tarmpassagen.59 Det är alltså tänkbart att ett ökat uttryck av
NPS och NPSR1 som leder till en hämning av tarmmotoriken ger skadliga ämnen i lumen
27
längre tid i kontakt med ett epitel med störd barriärfunktion, och att ett större upptag av
antigen i sin tur skulle kunna utlösa eller förvärra IBD.
Studien består av in vivo-försök på råttor. Det finns alltid anatomiska och fysiologiska
skillnader mellan individer (vare sig de är människor eller råttor), vilket betyder att samma
substans kan ge olika stark effekt, eller t.o.m. helt olika effekter, hos olika försöksdjur.
Samtidigt ger in vivo-studier kliniskt värdefulla kunskaper som kan ge ökad insikt i hur den
levande människokroppen fungerar.
Experimenten i denna studie utfördes under två tidsperioder med några månaders
mellanrum. Varje djur genomgick ett stort operativt ingrepp, vilket i de flesta fall ledde till en
operationsinducerad paralytisk ileus. Kirurgens erfarenhet och skicklighet utvecklades för
varje ingrepp, vilket påverkade operationstraumats omfattning. I alla inkluderade försök
återkom tarmmotoriken efter administrering av parecoxib, men motoriken uppvisade olika
mönster hos olika individer. Vissa hade tydliga MMC-komplex som skiljdes åt av tysta
perioder, medan andra hade ett mönster som mer liknade födomotorik, med regelbundna
kontraktioner med korta intervall emellan. Det är svårvärderat hur skillnader mellan olika djur
kan ha påverkat experimentets utfall. Vilken typ av motorik som förelåg hade dock ingen
uppenbar påverkan på de studerade parametrarna.
Hos kontrolldjur bör alla parametrar i idealfallet ligga stabilt över försökets gång, som i
de studier som tidigare gjorts med samma modell av mer erfarna kirurger. I detta försök
minskade dock bikarbonatsekretionen och blod-till-lumen clearance av 51Cr-EDTA
signifikant över tid i kontrollförsöken. Dessa parametrar sjönk även i NPS-gruppen.
Permeabiliteten minskar ofta med tiden även hos erfarna kirurger, men inte i samma
utsträckning. Eftersom 51Cr-EDTA-clearance minskade lika mycket i både kontrolldjur och i
NPS-behandlade djur har NPS sannolikt inte någon påverkan på permeabiliteten.
I NPS-gruppen var permeabilitetsminskningen jämfört med basalperioden något mindre
signifikant än den i kontrollgruppen. Inlärningen av operationstekniken i denna modell är
tidskrävande, och kontrollförsöken gjordes några månader innan NPS-försöken, då operatören
var mindre erfaren. Att permeabiliten ligger stabilare i de senare försöken kan ha att göra med
att operationerna gick bättre under den andra perioden. Skillnaden kan också ha att göra med
någon egenskap som varierade mellan de olika råttgrupperna, som ju tillhörde olika kullar.
När man analyserar förändringen över tid jämför man med basalperioden, experimentets
första 30 minuter. Basalvärdet för 51Cr-EDTA-clearance låg för kontrolldjuren i medel på
28
0,42 ± 0,09 ml min-1 100 g-1, och för NPS-djuren på 0,28 ± 0,08 ml min-1 100 g-1, vilket är en
tredjedel lägre än kontrollernas värde. Ett större antal djur i varje grupp skulle minska
eventuella slumpfel som påverkar ett tidsintervalls medelvärde.
Studien var också designad så att kontrollförsöken utfördes först, under operatörens
träningsperiod, och fungerade som ett mått på uppnådd skicklighet – som utvärderades t.ex.
genom att se att alla parametrar höll sig någorlunda stabila under försöken. I en större studie
skulle operatören helst ha lärt sig metoden innan försökets början, och inte samla in alla
kontrollvärden och alla NPS-värden vid två olika tidpunkter.
Det vore även intressant att studera NPS roll i normalfysiologin genom att använda en
NPS-antagonist. NPSR1 uttrycks i tarmen även hos friska individer, och genom att hämma
effekten av den endogena NPS-produktionen kan man få en djupare kunskap om substansens
betydelse i normaltillståndet. I de här försöken har vi också bara analyserat de akuta
effekterna av NPS-tillförsel. Vid inflammatoriska tillstånd är dock NPSR1 uppreglerad under
en längre tid. Framtida studier skulle kunna visa om långtidseffekterna av ökad NPSR1stimulering skiljer sig från de omedelbara, och om fler parametrar påverkas.
Djurstudier ger en fingervisning om hur substanser fungerar i de liknande system som
finns hos människa. De kan även bana väg för humanstudier, som i slutändan behövs för att
säkert veta vilken roll NPS-NPSR1-systemet spelar i den friska och den sjuka människan, om
det finns någon nytta med att manipulera det terapeutiskt och dess exakta
verkningsmekanism.
Inflammatoriska tarmsjukdomar har en multifaktoriell patogenes, där både livsstil,
miljöfaktorer och genetiska varianter är predisponerande.60 Att hitta en enda molekyl eller ett
enda läkemedel som förklarar sjukdomarnas uppkomst eller botar alla deras manifestationer är
därför kanske inte det primära målet med forskning på ämnet. Däremot bidrar all ny kunskap
om tarmens normalfysiologi och hur den förändras vid patologi till högre upplösning på
bilden av sjukdomarna. För åkommor som inte helt kan botas med ett enda läkemedel är det
av värde att identifiera processer som nya droger skulle kunna riktas mot för
symptomlindring. Att veta hur förändringar i gener leder till sjukdomar är också relevant för
en framtid där genetiska tester kan få större klinisk betydelse, och kanske t.o.m. leda till att
uppkomsten av sjukdomen förhindras.
Sammanfattningsvis visar resultaten i denna studie att neuropeptid S verkar inhiberande
på duodenums motorik. NPS roll i denna reglering är nyupptäckt och mycket intressant.
Resultat behöver dock följas upp i större studier med fler försöksdjur. Mer grundforskning
inom området behövs, både på dess funktion i människans normalfysiologi och dess roll i
29
sjukdomstillstånd i tarmen. En bättre förståelse av vad som styr tarmens funktioner är ett
relevant mål då besvär från mag-tarmkanalen är något som drabbar i princip alla människor
någon gång under deras livstid.
30
Referenser
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
http://www.uscnk.com/directory/Neuropeptide-S(NPS)-0796.htm: USCN Life Science, 2012.
Purves D, Williams SM. Neuroscience. Sinauer Associates, 2001.
Sjoblom M. Duodenal epithelial sensing of luminal acid: role of carbonic anhydrases. Acta
Physiol (Oxf) 2011;201:85-95.
Salminen S, Bouley C, Boutron-Ruault MC, Cummings JH, Franck A, Gibson GR, Isolauri E,
Moreau MC, Roberfroid M, Rowland I. Functional food science and gastrointestinal
physiology and function. Br J Nutr 1998;80 Suppl 1:S147-71.
Boron WF, Boulpaep EL. Medical physiology : a cellular and molecular approach. Elsevier
Saunders, 2005.
Bjålie J, Haug, E., Sand, O., Sjaastad, Ö. Människokroppen. Fysiologi och anatomi. In: Liber,
ed, 1998.
Verma R, Khanna P, Chawla S. Cholera vaccine: new preventive tool for endemic countries.
Hum Vaccin Immunother 2012;8:682-4.
Christofferson R. ZL, Lindblad K., Gustafson E. Hirschsprungs sjukdom - ovanlig medfödd
tarmsjukdom. Läkartidningen 2009;17.
Halland M, Talley NJ. New treatments for IBS. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2012;10:13-23.
El-Salhy M. Irritable bowel syndrome: diagnosis and pathogenesis. World J Gastroenterol
2012;18:5151-63.
Mazur M, Furgala A, Jablonski K, Mach T, Thor P. Autonomic nervous system activity in
constipation-predominant irritable bowel syndrome patients. Med Sci Monit 2012;18:CR493499.
Camilleri M, Madsen K, Spiller R, Greenwood-Van Meerveld B, Verne GN. Intestinal barrier
function in health and gastrointestinal disease. Neurogastroenterol Motil 2012;24:503-12.
De Schepper HU, De Man JG, Moreels TG, Pelckmans PA, De Winter BY. Review article:
gastrointestinal sensory and motor disturbances in inflammatory bowel disease - clinical
relevance and pathophysiological mechanisms. Aliment Pharmacol Ther 2008;27:621-37.
Hardin JA, Wallace LE, Wong JF, O'Loughlin EV, Urbanski SJ, Gall DG, MacNaughton WK, Beck
PL. Aquaporin expression is downregulated in a murine model of colitis and in patients with
ulcerative colitis, Crohn's disease and infectious colitis. Cell Tissue Res 2004;318:313-23.
Nylander O. The impact of cyclooxygenase inhibition on duodenal motility and mucosal
alkaline secretion in anaesthetized rats. Acta Physiol (Oxf) 2011;201:179-92.
Schneeberger EE, Lynch RD. The tight junction: a multifunctional complex. Am J Physiol Cell
Physiol 2004;286:C1213-28.
Powell DW. Barrier function of epithelia. Am J Physiol 1981;241:G275-88.
Nylander O, Pihl L, Perry M. Hypotonicity-induced increases in duodenal mucosal
permeability facilitates adjustment of luminal osmolality. Am J Physiol Gastrointest Liver
Physiol 2003;285:G360-70.
Salim SY, Soderholm JD. Importance of disrupted intestinal barrier in inflammatory bowel
diseases. Inflamm Bowel Dis 2011;17:362-81.
Bueno L, Ferre JP, Ruckebusch Y. Effects of anesthesia and surgical procedures on intestinal
myoelectric activity in rats. Am J Dig Dis 1978;23:690-695.
Tortora GJ DB. Principles of anatomy and physiology. John Wiley & Sons, 2006.
Lin HC, Elashoff JD, Kwok GM, Gu YG, Meyer JH. Stimulation of duodenal motility by
hyperosmolar mannitol depends on local osmoreceptor control. Am J Physiol
1994;266:G940-3.
31
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
Hogan DL, Crombie DL, Isenberg JI, Svendsen P, Schaffalitzky de Muckadell OB, Ainsworth
MA. Acid-stimulated duodenal bicarbonate secretion involves a CFTR-mediated transport
pathway in mice. Gastroenterology 1997;113:533-41.
Jacob P, Rossmann H, Lamprecht G, Kretz A, Neff C, Lin-Wu E, Gregor M, Groneberg DA, Kere
J, Seidler U. Down-regulated in adenoma mediates apical Cl-/HCO3- exchange in rabbit, rat,
and human duodenum. Gastroenterology 2002;122:709-24.
Nishizaki Y, Guth PH, Quintero E, Bover J, Del Rivero M, Kaunitz JD. Prostaglandin E2
enhances gastric defense mechanisms against acid injury in uremic rats. Gastroenterology
1994;107:1382-9.
Allen A, Flemström G. Gastroduodenal mucus bicarbonate barrier: protection against acid
and pepsin. Am J Physiol Cell Physiol 2005;288:C1-19.
Phillipson M, Johansson ME, Henriksnas J, Petersson J, Gendler SJ, Sandler S, Persson AE,
Hansson GC, Holm L. The gastric mucus layers: constituents and regulation of accumulation.
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008;295:G806-12.
Nylander O. The impact of cyclooxygenase inhibition on duodenal motility and mucosal
alkaline secretion in anaesthetized rats. Acta Physiol (Oxf) 2011;201:179-192.
Sedin J, Sjöblom M, Nylander O. The selective cyclooxygenase-2 inhibitor parecoxib markedly
improves the ability of the duodenum to regulate luminal hypertonicity in anaesthetized rats.
Acta Physiol (Oxf) 2012;205:433-51.
Laforenza U, Miceli E, Gastaldi G, Scaffino MF, Ventura U, Fontana JM, Orsenigo MN, Corazza
GR. Solute transporters and aquaporins are impaired in celiac disease. Biol Cell
2010;102:457-67.
Sommansson A, Nylander O, Sjoblom M. Melatonin decreases duodenal epithelial
paracellular permeability via a nicotinic receptor-dependent pathway in rats in vivo. J Pineal
Res 2012.
Wright EM, Loo DD. Coupling between Na+, sugar, and water transport across the intestine.
Ann N Y Acad Sci 2000;915:54-66.
Shepherd AJ, Downing JE, Miyan JA. Without nerves, immunology remains incomplete -in
vivo veritas. Immunology 2005;116:145-63.
Gross KJ, Pothoulakis C. Role of neuropeptides in inflammatory bowel disease. Inflamm
Bowel Dis 2007;13:918-32.
Vassilatis DK, Hohmann JG, Zeng H, Li F, Ranchalis JE, Mortrud MT, Brown A, Rodriguez SS,
Weller JR, Wright AC, Bergmann JE, Gaitanaris GA. The G protein-coupled receptor
repertoires of human and mouse. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:4903-8.
Pulkkinen V, Majuri ML, Wang G, Holopainen P, Obase Y, Vendelin J, Wolff H, Rytila P,
Laitinen LA, Haahtela T, Laitinen T, Alenius H, Kere J, Rehn M. Neuropeptide S and G proteincoupled receptor 154 modulate macrophage immune responses. Hum Mol Genet
2006;15:1667-79.
Xu YL, Reinscheid RK, Huitron-Resendiz S, Clark SD, Wang Z, Lin SH, Brucher FA, Zeng J, Ly NK,
Henriksen SJ, de Lecea L, Civelli O. Neuropeptide S: a neuropeptide promoting arousal and
anxiolytic-like effects. Neuron 2004;43:487-97.
Beck B, Fernette B, Stricker-Krongrad A. Peptide S is a novel potent inhibitor of voluntary and
fast-induced food intake in rats. Biochem Biophys Res Commun 2005;332:859-65.
Niimi M. Centrally administered neuropeptide S activates orexin-containing neurons in the
hypothalamus and stimulates feeding in rats. Endocrine 2006;30:75-9.
Smith KL, Patterson M, Dhillo WS, Patel SR, Semjonous NM, Gardiner JV, Ghatei MA, Bloom
SR. Neuropeptide S stimulates the hypothalamo-pituitary-adrenal axis and inhibits food
intake. Endocrinology 2006;147:3510-8.
Sundman L, Saarialho-Kere U, Vendelin J, Lindfors K, Assadi G, Kaukinen K, WesterholmOrmio M, Savilahti E, Maki M, Alenius H, D'Amato M, Pulkkinen V, Kere J, Saavalainen P.
Neuropeptide S receptor 1 expression in the intestine and skin--putative role in peptide
hormone secretion. Neurogastroenterol Motil 2010;22:79-87, e30.
32
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
Vendelin J, Pulkkinen V, Rehn M, Pirskanen A, Raisanen-Sokolowski A, Laitinen A, Laitinen LA,
Kere J, Laitinen T. Characterization of GPRA, a novel G protein-coupled receptor related to
asthma. Am J Respir Cell Mol Biol 2005;33:262-70.
Camilleri M, Carlson P, Zinsmeister AR, McKinzie S, Busciglio I, Burton D, Zucchelli M,
D'Amato M. Neuropeptide S receptor induces neuropeptide expression and associates with
intermediate phenotypes of functional gastrointestinal disorders. Gastroenterology
2010;138:98-107 e4.
D'Amato M, Bruce S, Bresso F, Zucchelli M, Ezer S, Pulkkinen V, Lindgren C, Astegiano M,
Rizzetto M, Gionchetti P, Riegler G, Sostegni R, Daperno M, D'Alfonso S, MomiglianoRichiardi P, Torkvist L, Puolakkainen P, Lappalainen M, Paavola-Sakki P, Halme L, Farkkila M,
Turunen U, Kontula K, Lofberg R, Pettersson S, Kere J. Neuropeptide s receptor 1 gene
polymorphism is associated with susceptibility to inflammatory bowel disease.
Gastroenterology 2007;133:808-17.
Laitinen T, Polvi A, Rydman P, Vendelin J, Pulkkinen V, Salmikangas P, Makela S, Rehn M,
Pirskanen A, Rautanen A, Zucchelli M, Gullsten H, Leino M, Alenius H, Petays T, Haahtela T,
Laitinen A, Laprise C, Hudson TJ, Laitinen LA, Kere J. Characterization of a common
susceptibility locus for asthma-related traits. Science 2004;304:300-4.
Cho JH, Brant SR. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease.
Gastroenterology 2011;140:1704-12.
Cooney R, Jewell D. The genetic basis of inflammatory bowel disease. Dig Dis 2009;27:42842.
Ishihara S, Aziz MM, Yuki T, Kazumori H, Kinoshita Y. Inflammatory bowel disease: review
from the aspect of genetics. J Gastroenterol 2009;44:1097-108.
McCarroll SA, Huett A, Kuballa P, Chilewski SD, Landry A, Goyette P, Zody MC, Hall JL, Brant
SR, Cho JH, Duerr RH, Silverberg MS, Taylor KD, Rioux JD, Altshuler D, Daly MJ, Xavier RJ.
Deletion polymorphism upstream of IRGM associated with altered IRGM expression and
Crohn's disease. Nat Genet 2008;40:1107-12.
Kuballa P, Huett A, Rioux JD, Daly MJ, Xavier RJ. Impaired autophagy of an intracellular
pathogen induced by a Crohn's disease associated ATG16L1 variant. PLoS One 2008;3:e3391.
Keita AV, Soderholm JD. Barrier dysfunction and bacterial uptake in the follicle-associated
epithelium of ileal Crohn's disease. Ann N Y Acad Sci 2012;1258:125-34.
Han RW, Chang M, Peng YL, Qiao LY, Yin XQ, Li W, Wang R. Central Neuropeptide S inhibits
distal colonic transit through activation of central Neuropeptide S receptor in mice. Peptides
2009;30:1313-7.
Petrella C, Agostini S, Guerrini R, Calo G, Giaquinto A, De Nuccio C, Improta G, Broccardo M.
Neuropeptide S inhibits stress-stimulated faecal output in the rat. Pharmacol Res
2011;64:471-7.
Nylander O, Kvietys P, Granger DN. Effects of hydrochloric acid on duodenal and jejunal
mucosal permeability in the rat. Am J Physiol 1989;257:G653-60.
Van Dorpe S, Bronselaer A, Nielandt J, Stalmans S, Wynendaele E, Audenaert K, Van De Wiele
C, Burvenich C, Peremans K, Hsuchou H, De Tre G, De Spiegeleer B. Brainpeps: the bloodbrain barrier peptide database. Brain Struct Funct 2012;217:687-718.
Hollander D, Vadheim CM, Brettholz E, Petersen GM, Delahunty T, Rotter JI. Increased
intestinal permeability in patients with Crohn's disease and their relatives. A possible
etiologic factor. Ann Intern Med 1986;105:883-5.
Collins SM. The immunomodulation of enteric neuromuscular function: implications for
motility and inflammatory disorders. Gastroenterology 1996;111:1683-99.
Rutgeerts P, Goboes K, Peeters M, Hiele M, Penninckx F, Aerts R, Kerremans R, Vantrappen
G. Effect of faecal stream diversion on recurrence of Crohn's disease in the neoterminal
ileum. Lancet 1991;338:771-4.
33
59.
60.
Komatsu S, Panes J, Grisham MB, Russell JM, Mori N, Granger DN. Effects of intestinal stasis
on intercellular adhesion molecule 1 expression in the rat: role of enteric bacteria.
Gastroenterology 1997;112:1971-8.
Fiocchi C. Inflammatory bowel disease: etiology and pathogenesis. Gastroenterology
1998;115:182-205.
34