Genexpressions analys - RNA-uttryck
Alla gener som är aktiva transkriberas: det bildas ett RNA (transkript).
Proteinkodande gener transkriberas till mRNA, ribosomalRNA gener till rRNA osv.
Man pratar ofta om sk. genexpression eller genuttryck.
om man menar mRNA, benämns det ofta som mRNA expression/uttryck
alt. protein expression/uttryck.
mRNA expressionen bidrar givetvis till att ge en gen dess specifika funktion i en celleller vävnadstyp. Genom att studera mRNA expressionen kan man få viktig
information om en gens funktion och hur den regleras. mRNA expressionen studeras
vanligtvis utifrån några olika aspekter:
1. I vilken cell- eller vävnadstyp uttrcks mRNAt (vävnadsspecificitet)?
2. Vilken storlek har mRNAt och finns det flera mRNA (komplexa
transkriptionsenheter)?
3. Hur mycket mRNA finns det (mRNA nivå) i en specifik cell- eller vävnadstyp?
4. Hur regleringen av mRNA expressionen sker?
Det finns flera olika metoder att studera ovan frågeställningar.
De flesta metoder kräver att man preparerar RNAt som skall analyseras.
Preparation av RNA
Preparerar man RNA från en vävnad får man sk. totalRNA vilket innehåller alla typer
av RNA: rRNA, mRNA och tRNA. (mRNA utgör c:a 7-10% av totalRNAt)
RNA kan prepareras från vävnad genom extraktion med sur fenol (DNA samt
proteiner avlägsnas med fenolen) följt av etanol fällning av RNAt. En metod som
utnyttjar denna extraktion kalls Trizol™ extraktionsmetoden.
Isolering/anrikning av mRNA från totalRNA
Man utnyttjar att de allra flesta mRNA har en polyA-svans när man isolerar mRNA.
En polyT(20-50) esDNAsträng binds upp till små kulor (ofta av Fe) och blandas med
totalRNAt. polyTnukleotiden och polyA-svansarna kommer att hybridisera och det är
sedan möjligt att magnetiskt rena kulorna vilka drar med sig mRNAt. Resterande
delar av RNAt kan sedan tvättas bort. Man får loss mRNAt genom att värma eller
tillsätta salt. mRNAt kan sedan fällas med etanol och lösas upp i en en buffert. Denna
procedur kallas PolyA+ selektion och det RNA som man får kallas Poly A+RNA.
(det finns ett fåtal mRNA som saknar polyA-svans och dessa missar man!)
Egenskaper hos RNA
RNA är mer känsligt än vad DNA är och skall hanteras på is. Det förvaras bäst fruset
-80°C. Känsligheten ligger i att RNA mycket lätt tuggas ner av RNA specifika
nukleaser sk. RNaser. RNaser är mycket stabila proteiner som finns lite här och var.
Bakterier samt alla andra organismer producerar dem och vi har dem på vår hud. Rika
källor på RNaser är bukspottkörtel, tunntarm och mjälte. När man arbetar med RNA
finns risk för RNase kontamination med RNA degradation till följd. Genom att arbeta
sterilt och på is miskar man risken att RNAt degraderas (bryts ner).
1
mRNA analysmetoder:
qRT-PCR
”northern blot” analys
Array expressionsanalys
RNA (cDNA) sekvensering
* In situ hybridiserings analys
PCR-baserad analys som har hög känslighet och
är snabb.
Analys som ger information om relativ mängd,
mRNA storleken samt om det finns flera RNA.
Metod att analysera expression av många gener.
Låg känslighet men kraftfull eftersom många
(alla) gener kan analyseras samtidigt.
Sekvensering av hela cDNA bibliotek. Dyrt men
kraftfull metod eftersom man får en fullständig
information om vilka gener som uttrycks
Metod att analysera mRNA direkt i vävnader ”på
stället” (vävnadssnitt).
RT-PCR (reverse transcriptase PCR)
RT-PCR är en kvantitativ PCR-baserad analys som bygger på att mRNA först
översätts till cDNA vilket utgör templat vid PCR analysen. En PCR reaktion körs och
mängden produkt (PCR fragment) kommer att vara proportionell mot mängden
cDNA.
Specifikt primer-par för mRNA (cDNA) sekvesnsen
Översätt mRNAt till cDNA med reverse transkriptas
Använd cDNAt som templat vid PCR reaktionen
Analysera mängden PCR produkt som producerats i de olika proverna efter ett
specifikt antal cykler.
cDNA syntes! Enligt ppt presentation: oligo dT primer – RT pol , Taila 5’ med cG –
”:a strängen med dC oligo etc. EcoRi adaptorer
Relativa mängen PCR produkt i de olika proverna motsvarar skillnader i cDNA och
följaktligen mRNA nivåer i urspungs RNA proverna.
q RT-PCR (quantitative reverse transcriptase PCR, ibland ”real-time”)
Mängden produkt bestäms efter varje cykel. Detta sker under själva PCR reaktionen
(därför namnet real-time) genom att mäta specifik fluorescense som avges från PCR
produkten. Det finns olika sätt att mäta produkten. Mängden produkt plottas mot
antalet cykler (se bild för analys av prover A – G…). Antalet cykler som används för
att nå upp till en specifk nivå (jämförelsenivån) används för att bestämma nivåerna av
specifikt mTNA i varje prov. Resultatet ger ofta de relativa mRNA nivåerna mellan
olika prov. Ex. (bild) prov A (skär jämförelsenivån vid c:a 8 cykler) och innehåller i
detta fall drygt 8x (23)mer mRNA än prov B (som skär nivån vid c:a 11 cykler).
Fördel: Snabb, billig, enkel och mycket känslig metod.
Nackdel: Den extrema känsligheten gör att man lätt kan få falska positiva resultat.
Trots att den är enkel är det svårt att bemästra reproducerbarheten och variationen i
metoden. Även eventuella skevheter, fel eller variationer amplifieras ju exponentiellt
och kan bli stora.
2
”northern blot” analys
Ger information om 1) mRNA nivåer samt 2) mRNA storlek(ar).
Ett mRNA har en specifik längd som beror av genens struktur och hur "splicingen"
sker. Genomsnitts mRNAt är 2-3kb men det finns mRNA som är 10kb eller större.
northern blot analysen börjar med storleksseparation av RNA (totalRNA eller polyA+
RNA) med hjälp av agarosgelelektrofores. Olika RNA prover som skall jämföras körs
i olika brunnar. Gelen måste köras under denaturerande betingelser därför att RNA
har stor tendens att bilda sekundärstrukturer som påverkar vandringen i gelen och
vandrar då ej efter längd. Formaldehyd tillsätts i gelen för detta ändamål.
RNAt förs sedan över ("blottas") till ett nylon/nitrocellulosafilter som sedan
behandlas för att fästa RNAt till filtret.
För att kunna analysera ett specifikt mRNA måste man ha en specifik probe som kan
hybridisera till mRNA som man vill studera. Proben måste var komplementär till
mRNAt dvs - anti-sense och märks vanligtvis in med radioaktivitet genom random
priming (för ett ds DNA fragmnet) eller in vitro transkribering (för ett fragment i en
vektor).
Principen för northern-blot analys är lik Southern-blot analys. Skillnaden ligger i att
RNA sitter på filtret och inte DNA.
1. Gelelektrofores
2. Blot
3. Filterhybridisering med radioaktiv probe
4. Tvätt för att avlägsna icke hybridiserad probe
5. Exponering på röntgenfilm eller PhosphoImager för att se mängd och vilken
storlek mRNAt som proben hybridiserar till har. Mängden radioaktivitet är
proportionell till mängden mRNA. Genom att använda storleksmarkörer kan
storleken på mRNAt bestämmas.
Resultatet ger:
Ett eller flera mRNA
Längden på mRNA
Relativa mRNA nivån i de olika proven (jämföra mellan prover på samma gel)
3
(Nivåerna visas av intensiteten av banden)
Filtret kan användas på nytt med annan probe efter det att den gamla proben
avlägsnats från filtret genom behandling vid 94°C 10 min. varvid hybridiseringen
mellan mRNA och probe bryts.
Nackdel: omfattande och tekniskt svår.
Array expressionsanalys
Array expressionsanalys används då man vill jämföra två prover m. a. p. vilka geners
mRNA uttryck som skiljer mellan de två proverna. Tex. kan en tumörcell jämföras
med sin normala motsvarighet.
Metodens styrka ligger i att man kan jämföra tusentals gener på en och samma gång.
Principen är att enkelsträngat DNA med känd sekvens som motsvarar en specifik gen
fästs i ett rutmönster på ett filter eller en liten glas platta i små prickar. Man vet
således vad varje prick/DNA kodar för och i vilken position i rutmönstret det sitter.
RNA prepareras och används för att göra motsvarande cDNA från de två olika
proverna ( ex. tumör och normal). Vid cDNA syntesen tillsätts fluorescerande
märkning; (nukleotider med en fluorofor kopplad).
Röd fluorofor till tumör-cDNAt
Grön till normala cDNAt.
Man blandar sedan de två inmärkta cDNA proverna och hybridiserar dem till DNAt
på filtret eller glasplattan. Om en gen bara uttrycks i tumörprovet kommer det att
fluorescera rött, om den uttrycks lika mycket i båda kommer det att fluorescera gult
(rött + grönt) och är genen aktiv bara i normalcellerna kommer punkten att fluorescera
grönt.
Genom att studera vilka punkter som skiljer sig så kan man få reda på vilka gener som
är olika reglerade (differentiellt uttryck) i de två proverna!
Oligonukleotid arrays (Affymetrix arrays)
Både oligonukleotider och cDNAs kan användas för att konstruera arrays. Principen
påminner om varandra för båda arrayanalyserna. Företaget Affymetrix har utvecklat
en metod att syntetisera oligonukleotider direkt på de små plattorna.
4
Fördelar: man analyserar alla gener
Nackdelar: Bara högt uttryckta gener kommer att ge signaler så man kan missa många
viktiga men lågt uttryckta gener.
RNA (cDNA) sekvensering
Allt RNA i forma av cDNA sekvenseras från en eller flera vävnader. Detta ger hela
”transkriptomet” och man kan bioinformatiskt få reda på vilka gener som uttrycks
samt hur mycket mRNA från en eller många specifika gener det gjorts. Sekvenser från
cDNA kloner från ett bibliotek som sekvenserats från ena änden kallas Ests. Est =
expressed sequence tags. Dessa sekvenser (bara änden på ett cDNA) representerar ett
cDNA (tag) som är uttryckt (expressed). All sekvensdata läggs i en databas som
motsvarar det prov som analyserats. Man analyserar/”räknar” hur många sekvenser av
ett specifikt mRNA det finns i databasen och därmed får man information om hur
uttrycket av en gen eller flera (alla gener) är uttryckta i den vävnad från vilken RNAt
var framrenat och sekvenserat.
In situ hybridiseringsanalys
Analys av mRNA in situ (på stället/plats) i celler och vävnader. Vävnaden
förbehandlas och snittas i tunna snitt c:a 10-15µm tjocka. Snitten samlas upp på
objektsglas för mikroskopi och hybridiseras som om det vore ett filter. Man använder
en probe för att detektera mRNAt. Proben kan vara antingen radioaktivt inmärkt eller
enzymatiskt. Det är vanligt att Ribo-prober används vid in situ hybridisering.
Riboprobe måste vara anti-sense mot mRNAt som skall studeras
Vid radioaktivt inmärkning skall α-[35S] ATP användas, lågintensiv β-strålare, kort
räckvidd.
Stegen vid in situ hybrdiserings analys:
• Snittning av vävnad och uppsamling på objektglas
• Hybridisering - 35S (snitt med probe)
• Tvätt
• Autoradiografi resp. exponering på fotografiskemulsion. Emulsion är flytande
film som låtes torka i ett mycket tunnt skickt över vävnadssnittet
• Framkallning av film/emulsion
• Analys (emulsion måste analyseras i i mikroskop)
Celler som har mRNA/probe hybrid blir radioaktiva och producerar silverkorn i
emulsionen (den fotokemiska reaktionen) som syns som prickar över "positiva" celler.
Icke-radioaktiv inmärkning DIG - ATP (DIG= digoxigenin)
Digoxigenin-märkta nukleotider inkorporeras i anti-sense riboproben. Digoxigenin är
en molekyl som finns hos vissa växter men ej djur. Det finns mycket bra antikroppar
som binder DIG mycket specifik. Man anänder sig av antikroppar till vilka man
kopplat (konjugerat) enzymet alkaliskt fosfatas.
1. Snittning av vävnad
2. Hybridisering med DIG - probe
3. Tvätt för att avlägsna icke hybridiserad probe
5
4.
5.
6.
7.
Inkubering med fosfataskopplad anti-DIG antikropp
Tvätt för att avlägsna icke bunden antikropp
Färgningsreaktion
Analys i mikroskop
Färgreaktion: Färglöst substrat övergår i en olösligfärgad produkt i närvaro av
alkaliskt fosfatas.
Substratet NBT-BCIP ger blåfärgad produkt. Det finns olika enzymer och
substrat.
6
Electrophoresis of
DNA or RNA
DNA or RNA
RNA gel - denaturing conditions
RNA
28S
18S
1
2
cDNA synthesis using
Oligo-dT and dG
Cloning using Eco R1
adaptors/linkers
3
4
