RNA kvalitet
RNA från blod och benmärg
Julia Asp
Docent
Sektionen för Genanalys
Sahlgrenska Universitetssjukhuset
Equalis användarmöte 121108
Sektionen för Genanalys
EDTA-rör:
blod
benmärg
likvor
DNA isolering
TaqMan genotypning
RNA isolering
PCR
cDNA-syntes
Sekvensering
Gelelektrofores
Fragmentanalys
Realtids-PCR
Ca 9000 analyser/år
Julia Asp
Sektionen för Genanalys
RNA isolering
cDNA-syntes
Realtids-PCR
t(9;22) BCR-ABL1
t(15;17) PML-RARa
t(8;21) RUNX1-RUNX1T1
Inv16 CBFB-MYHI1
t(1:19) TCF3(E2A)-PBX1
t(12;21) ETV6-RUNX1
SIL-TAL
t(6;9) DEK-NUP241
MLL translokationer
Wt1
Ca 1000 analyser/år
Julia Asp
Sektionen för Genanalys
RNA isolering:
Automatiserad prep
Julia Asp
Sektionen för Genanalys
Realtids-PCR
Triplikat
Log-skala!
Bestämning av antal transkript
av fusionsgen och referensgen
fusion
Kopietal (copy number, CN)
referens
Normaliserat kopietal (NCN)
CN (fusion)
CN (referens)
% NCN eller kvotvärde
CN (fusion)
x 100
CN (referens)
Pågående utmaning
Övergång till totRNA från mRNA. Varför?
Göra resultat mer
jämförbara med andra lab
Säkra tillgång till reagens
Möjliggöra framtida
alternativa analyser
Julia Asp
Sektionen för Genanalys
RNA är känsligt!
Snabbt omhändertagande av prov
RNase-fria förhållanden
Julia Asp
Sektionen för Genanalys
RNA isolering - preanalys
EDTA-rör till RNA-prep
omhändertas inom 48 h
för att undvika
nedbrytning av transkript
Etablerat system
Förändring av transkript kan inte uteslutas
48 h ibland kort om tid
Julia Asp
Sektionen för Genanalys
Test av PaxGene-rör
för blod
Utvecklade för att
stabilisera/konservera RNA
Förvaring
3 dagar i 18-25°C
5 dagar i 2-8°C
6 månader i -20°C
Julia Asp
Sektionen för Genanalys
EDTA + PAX från patient
EDTA 1 d
EDTA 1 d
EDTA 1 d
PAX 1 d RT
PAX 3 d RT
PAX 5 d RT
!
cDNA-syntes
Realtids-PCR
Julia Asp
Sektionen för Genanalys
TotalRNA med QiaSymphony
Bild Qiagen
RNA binder in till kiselcoatade magnetkulor.
Julia Asp
Sektionen för Genanalys
Kontroller vid RNA-prep
Vatten-prep
Normalblod från blodgivare
Ytterligare kontroller i efterföljande
analyssteg
Julia Asp
Sektionen för Genanalys
BCR-ABL1
• Europe Against Cancer 2003
• Ackrediterad analys – Neqas
• Standardisering för koppling till
prognos i kliniska studier
Julia Asp
Sektionen för Genanalys
Förhållande mellan respons och
nivå på BCR-ABL1 transkript
Baccarani M et al. Blood 2006;108:1809-1820
Julia Asp
Sektionen för Genanalys
