NGS eller Sangersekvensering av
”besvärliga” gener
En fallbeskrivning
Sektionen för
Genanalys
Del av Klinisk kemi Sahlgrenska Universitessjukhuset
Firar 20 årsjubileum i år.
15 personer
Totalt antal analyser >8.000/år
AD, sekvens, fragmentanalys, kvantitativ PCR, NGS och
digital PCR på väg.
Hematologiska sjukdomar, metabolasjukdomar,
hemoglobinopatier mm
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
Patientfall
• Par från Norge med två graviditeter som slutat i spontan
abort runt vecka 20.
• Prov från aborterat foster.
• Paret har inga kända sjukdomar i släkten.
• Frågeställning om neurometabolsjukdom
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
NGS-panel
136 gener
Peroxisomala sjukdomar
Lysosomala sjukdomar
Kopparmetabola sjukdomar
Multiple acyl-CoA dehydrogenas- och riboflavintransportör-brist
Hemokromatos
Hyperbilirubinemi
Pyruvatdehydrogenas-komplex-brist
Erytrocytenzymopatier
Ärftlig erytrocytos
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
NGS
• Egendesignad panel
• SureSelectQXT
• MiSeq
• Filtrering i Illumina Variant Studio
• Copy Numberanalys med Biomedical Genomics
Workbench (CLC)
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
NGS resultat:
Utsvarad som inget fynd, då vi vanligen inte rapporterar
anlagsbärarskap
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
Kunden återkommer och undrar om det verkligen inte finns
något i GBA-genen då man funnit misstänkta Gaucher celler.
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
Sangersekvensering
7 PCR fragment
20 sekvensprimers
ABI Prism Big Dye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit
Version 1.1
ABI 3130XL
SeqScape
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
Sangersekvensering av GBA
Fynd från NGS c307+1G>A Heterozygot
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
Nytt fynd i GBA
c.476C>T Heterozygot
Med mutationen är denna del exakt som Pseudogenen
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
Hur vi försöker undvika problem med
pseudogen i NGS
Proberna 120bp långa plockar upp både gen och
pseudogen (hybridisering trots några mismatches)
Mappningen görs mot helgenom därför orsakar
pseudogensekvenser vanligen inte några
problem.
Täckning finns för både gen och pseudogen, men variant
calling görs enbart för target området (kodande delar +/25 bp av aktuella gener)
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
Täckning finns för både gen och
pseudogen,
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
Hur vi försöker undvika problem med
pseudogen i Sangersekvensering
Sangermetoden har noga utvalda primers med hänsyn tagen till
Pseudogenen
Stora fragment i PCRen där sedan flera sekvensprimers används.
3 extra primerpar om misstanke finns att pseudogenen
amplifierad
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
Vid misstanke om Gauchers sjukdom
används sangersekvesering
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
Genanalys
SEKTIONEN FÖR GENANALYS KLINISK KEMI SAHLGRENSKA
UNIVERSITETSSJUKHUSET
