M13 primers vid sekvensering
Från Specifik till Universal
Raha Riazi
Karolinska Universitetslaboratoriet, Klinisk kemi, Stockholm
Faktor VIII utredning, sekvensering av exon 1-26
•
Hemofili A en ärftlig blödarsjukdom, orsakas av en eller
flera genetiska defekter i genen som kodar för FVIII (F8)
•
Genen sitter på X-kromosom, nästan 100% bara pojkar
som drabbas. kvinnor är dock bärare och för anlaget
vidare.
•
Svår, moderat och mild
Raha Riazi 2012-11-07
Faktor VIII utredning, sekvensering av exon 1-26
•
Vanligaste orsaker till svår: Inversionmutationer i intron 1
eller 22.
•
Vanligaste orsak till Mild eller moderat: mutation i F8genens exoner såsom punktmutations-, substitutions- och
deletions- effekter inom varje sekvens.
Raha Riazi 2012-11-07
F8-genen och dess exon och intron
FVIII
1
2-6
7-13
Består av 26 exoner
Exon14 indelat i 8 fragment
66 primrar (33 forward och 33 reverse)
Raha Riazi 2012-11-07
14
15-22
23-26
Mätprincip
•
F8-genens exon analyseras kvalitativt genom DNA
sekvensering av de 26 exonen.
•
PCR reaktion med specifika primrar för varje exon
•
66 primrar (33 forward och 33 reverse) → 33 erhållna PCR
produkter
•
Enzymatisk rening av PCR produkter
•
Sekvensanalys: specifika primrar designade för varje exon.
Raha Riazi 2012-11-07
F8 Sekvensering av exon 1-26
1F
Exon 1
1R
PCR produkter
F8 exon 1
14.1F
14.2F 14.1R 14.3F 14.2R
14.4F 14.3R 14.5F 14.4R
14.6F 14.5R
14.7F 14 .6R 14.8F 14.7R 14.8R
F8ex14.1
F8ex14.2
F8ex14.3
PCR produkter
F8 exon 14
F8ex14.4
F8ex14.5
F8ex14.6
F8ex14.7
F8ex14.8
Raha Riazi 2012-11-07
Hur har vi gjort?
Laborativ:
•
M13-tags kopplade till befintliga F8 primer
•
Testa med AmpliTaqGold 360 och Taq polymerase
•
PCR körning
•
Sekvensering av PCR produkter med M13 primer
•
Bra resultat!
Raha Riazi 2012-11-07
M13 universal primers
•Forward (17mer)
5´GTAAAACGACGGCCAGT 3´
•Revers (22mer)
5´GCGGATAACAATTTCACACAGG 3´
Raha Riazi 2012-11-07
Exon 1
M13-tags
5´
3´
5´
3´
1F
5´
3´
1
3´
1R
5´
3´
5´
1
3´
3´
5´
5´
3´
5´
1F
3´
5´
5´
2
2
3´
5´
3´
1F
3´
5´
5´
1R
2
3´
3´
5´
5´
3´
5´
3´
5´
5´
3´
1F
5´
1R
5´
5´
3´
5´
1F
3´
3´
1R
1R
3´
5´
3´
3
3´
3´
3´
3´
5´ 5´
1F
5´
5´
2
3´
5´
3´
5´
3
3
1F
3´
1R
5´
3´
5´
3
3´
3´
3´
5´
5´ 5´
3´
3´
3´
1R
5´
Raha Riazi 2012-11-07
Varför universal primers?
Fördelar med användning av M13-Tags.
Förenklad rutin vid sekvensering
•
Kräver inte egna primrar vid sekvensering → Från 66
specifika primrar till 2 universal primrar
•
Besparingar på arbetsblastning och tid
•
Man slipper hålla reda på vilka primrar som behövs för
sekvensering av varje PCR produkt → bättre kvalitet
Raha Riazi 2012-11-07
Universal primers
Bara positivt att byta till universal primers:
•
Snabbare
•
Säkrare
•
Bättre kvalitet
•
Billigare
Raha Riazi 2012-11-07
Tack!
Raha Riazi
Områdesansvarig DNA
Klinisk kemi, Solna 2
Karolinska Universitetslaboratoriet
171 76 Stockholm
Tel: 08-517 735 43
[email protected]
Raha Riazi 2012-11-07
