MODY-diagnostik i praktiken
MODY
• Monogen form av diabetes - en enda gen orsak
• Delas in i MODY 1-6 beroende vilken gen som
är muterad
• Ärvs autosomalt dominant
• DNA analys för att:
– Fastställa MODY & klassificera subtyper
– Bättre prognos och behandling
– Utredning av familjemedlemmar med diabetes
symptom
Mutationsförekomst hos de 3 vanligaste MODY
formerna:
• MODY 1 – HNF4α - 10 exon samt 6 isoformer
• MODY 2 – GCK - 10 exon samt 2 isoformer
• MODY 3 – HNF1α - 10 exon
• Flera olika mutationer rapporterade, spridda i alla
exon & splicesites i intron
sekvensanalys med Sanger sekvensering
• MODY validerades under
2006 och kliniska
analyser startades 2007.
• Man valde att optimera
med AmpliTaq Gold
Mastermix samt en och
samma annealing
temperatur för samtliga
system.
• Enkelt och smidigt i den
bästa av världar!
• 2009 valde vi att optimera om samtliga
system då flertalet system inte var
fungerade gällande läsbar sekvens i båda
riktningar.
• Vissa primersystem fick designas om i
Oligo v.6.69 (primerdesign mjukvara)
• Idag använder vi 5 olika PCR protokoll
• Vi arbetar med AmpliTaq Gold, AmpliTaq Gold 360, två
stegs PCR samt ett protokoll med högre primer
koncentration
• Ett MODY projekt består av max 7
patientprov samt ett blankprov
• Vi får en bra logistik med:
- 4 primär PCR plattor
- 6 sekvens PCR plattor
• 36 h på ABI 3130xl
Analys av sekvensdata
• Tolkningsprogram SeqScape v.2.5
• DNA sekvens med kvalitetsvärde på minst
20
• Läsbar sekvens i båda riktningar
• Två BMA tolkar oberoende av varandra
• Referenssekvens importeras från NCBI, refseq.
• Använder ROI:s, region of interest, = lager med
definierade exon & flankerande intron i den analyserade
genen (eventuella isoformer i ett eget lager)
• Provernas konsensus sekvensen jämförs med
referenssekvensen & eventuella mutationer hittas &
markeras av programmet automatiskt
- överblick över läsbara sekvenser & mutationsförekomst
för varje prov
- enklare att analysera & tolka hela projektet på en gång
Tekniskt/medicinskt godkännande
• Alla polymorfier kontrolleras i HGMD och i
Alamut
• Funna mutationer sammanställs i en
svarsrapport, signeras av BMA och ansvarig
läkare
• Avvikelser i ett projekt sammanställs och
signeras av ansvarig läkare
• Endokrinolog sammanfattar genotypresultat i ett
slutsvar till beställande läkare samt en kopia till
DNA-lab
Alamut® - Mutation Interpretation Software
Överskådlig bild av genen
Flera databaser kopplade till sig t.ex.
- Swissprot, HGMD, dbSNP m.m.
• mutationsrapport med rätt nomenklatur för okända
”nya” mutationer
• Vi analyserar MODY fyra gånger per år
• Ett projekt tar ca 1 månad
• Antalet prover har ökat, innebär att så fort
ett projekt är klart är det dags att börja
med nästa!
• Riktad sekvensering ökar i och med
familjeutredningar
Framtiden…
• MLPA – detektion av stora
deletioner/insertioner
• HNF4α – ”ny” promotor och exon 1
specifik för pankreas
