Evelina Kulcinskaja Vem bryter ner maten efter oss? Tarmfloran är viktig för vårt välbefinnande. De goda tarmbakterierna gynnar vårt immunförsvar och håller sjukdomsframkallande bakterier borta. De goda bakterierna lever bl.a. av de molekyler som vi inte kan bryta ner från vår föda. Vi mår alltså bra av att äta ämnen som får bakterien att trivas, även om vi själva inte kan bryta ner dem. Därför behöver vi studera tarmbakterierna för att se vad som får dem att trivas. Tarmfloran utgörs av flera arter av bakterier, däribland Bifidobacterium adolescentis. När maten har passerat magsäcken och tunntarmen finns där fortfarande sockerkedjor som vi inte kan bryta ner. Dessa passerar därför magen och når tjocktarmen, där B. adolescentis lever. För att kunna spjälka sockerkedjorna till mindre molekyler behövs enzymer. Vi saknar alltså dessa enzymer, men B. adolescentis har dem. Det är dock inte mycket som är känner till om enzymerna hos bakterien. Ett av dessa enzymer kallas beta-mannanas och det klipper sönder kedjor av ett socker som kallas mannos. Det är detta enzym som jag har studerat i detta arbete. Sådanna ämnen som vi inte kan bryta ner, men som stimulerar goda tarmbakterier kallas prebiotika, medan de goda tarmbakterierna själva kallas probiotika. Prebiotika stimulerar tillväxt av bra bakterier som hämmar tillväxt av de sjukdomsframkallande bakterierna.Genom att studera vad bakterien tycker om och vad som får den att växa bra kan vi tillsätta ämnen som bakterien tycker om, dvs. prebiotika, i mat som vi äter. Jag använde genen för beta-mannanas från B. adolescentis och satte in den i en annan bakterie som heter E. coli. Denna teknik gör att man kan få större mängder enzym och kan lättare studera det. När jag hade fått fram enzymet satte jag det i en lösning med sockerkedjor. Om sockerkedjorna bryts ner är enzymet aktivt, dvs. det fungerar. Ju fortare sockerkedjorna bryts ner, desto mer aktivt är enzymet. Jag undersökte enzymet under olika förutsättningar och kom fram till att det är aktivt i pH 5-6 i 37°C. Man kan också frysa det, ha det i kylskåpet eller i rumstemperatur utan att det förstörs. Beta-mannanas har en bit i början som derigerar att enzymet ska ut ur bakterien, en så kallad signalpeptid. När enzymet kommer ut ur bakterien klipps biten av. Men i mina undersökningar var enzymet kvar i bakterien. Jag provade att klippa av signalpeptiden själv och då fick enzymet mycket högre aktivitet. Det fungerade alltså inte särskilt bra med den signalpeptiden när man hade enzymet i en annan bakterie. I detta arbete har jag kommit fram till under vilka förhållanden man kan studera betamannanas utan att det förlorar sin aktivitet, dvs. utan att det förstörs. För att kunna säga mer om B. adolescentis behövs fler studier. Man kan då bl.a. titta på om enzymet kan bryta ner andra sockerkedjor än just de som jag har studerat. Handledare: Henrik Stålbrand Examensarbete 30 hp i Biokemi 2010 Avdelningen för Biokemi och Strukturbiologi, Lunds Universitet Examensarbete, Naturvetenskapliga fakulteten, Lunds Universitet Evelina Kulcinskaja Optimized expression and characterization of β-mannanase from Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium adolescentis is a bacteria living in the human colon. The gene for endo-1,4-βmannanase from B. adolescentis has previously been cloned and expressed in pET28b+ expression vector and E. coli BL21(DE3) cells by Stålbrand group. In this work, the enzyme was expressed and the basic characteristics of the protein have been established. Optimization of expression was tried, but activity was low, maximum 0.14 nanokatal/ml culture. The optimal pH was found to be 5.5. The enzyme is stable in temperatures from -20°C to 37°C and in pH 5-6. New gene constructs were subcloned and expressed. The activity increased to 116 nkatal/ml culture when native excretion signal peptide was removed. Advisor: Henrik Stålbrand Degree project 30 ECTS-credits in biochemistry 2010 Department of Biochemistry and Structural Biology, Lund University Examensarbete, Naturvetenskapliga fakulteten, Lunds Universitet