Examensarbete i kemi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet Upprening av Komplex II enzym för inmärkning av kinon bindande platser och bielektrokemisk analys Helena Bondesson Succinate:kinon oxidoreduktas är ett enzym i andnings kedjan som även kallas Komplex II. Hos eukaryoter finns enzymet i mitokondriens innermembran, som motsvarar cellmembranet hos prokaryoter. Som namnet antyder oxiderar enzymet succinat från citronsyra cykeln och reducerar kinon i membranet. Enzymet består av tre eller fyra protein subenheter; En polypetid väger 65 kD och innehåller en flavin grupp, en polypeptid är 28 kDa och innehåller tre järn svavel kluster och en eller två polypeptider som fungerar som membranankare och binder de andra två proteinen till membranets yta.. I bakterien Bacillus subtilis består membranankaret av en polypeptid på 23 kDa som kallas cytokrom b558 eftersom den innehåller två heme grupper. I detta arbete ville vi undersöka cytokrom b proteinets egenskaper närmare och ta reda på hur många kinon-bindande platser det finns. Dessutom ville vi försöka studera elektron överföring mellan det intakta Komplex II enzymet och en elektrod. Först renade vi fram Komplex II från en stam av B. Subtilis som tillverkar 2-3 gånger så mycket av detta enzym som normalt. Detta beror på att bakterien innehåller en plasmid med en extra kopia av generna som kodar för Komplex II. Bakerierna odlas och skördas. Därefter används lysosym så att cellväggarna går sönder och membranen kan isoleras med hjälp av centrifugering. Membranen solubiliserades sedan med en detergent så att de membranbundna proteinen fås i lösning. Därefter separeras de olika proteinen med hjälp av jonbyteskromatografi och gelfiltrering. På de olika fraktionerna som kommer ut fråm kolonnerna mäter man absorbans vid 280 nm (uppskattar protein mängd) och 412 nm (uppskattar komplex II innehåll) för att finna de fraktionerna som innehöll mest Komplex II och minst andra protein. Dessa fraktionerna poolades sedan och koncentrerades. Man kan identifiera de kinon bindande platserna genom att märka in dem med azido-kinon. Azidokinonen är stabil i mörker, men när man lyser på den med UV-ljus reagerar den med närliggande aminosyror och bildar en kovalent bindning. För att azidokinone ska reagera med aminosyror just vid de kinonbindande platserna, krävs att den liknar den naturliga kinonen så mycket som möjligt. Helst ska den fungera som ett naturligt substrat för enzymet som skall märkas in. Efter inmärkning analyserar man enzymets protein med hjälp av mass spektrometri. Om någon peptid blivit tyngre betyder det att azido kinonen reagerat just här. Vi visade att vår azidikinon fungerade som ett mycket bra substrat för enzymet. Sedan optimerade vi försöksförhållandena: Vi vill få så mycket specifik inmärkning som möjligt, utan att enzymet självt förstörs av UV-bestrålningen. Samtidigt vill vi inte använda så höga halter av azidokinon att den börjar reagera på andra platser än de kinonbindande. Den mass spektrometriska analysen är fortfarande inte klar när detta skrivs, och därför kan vi ännu inte berätta hur många kinonbindande platser det fanns. Det bioelektrokemiska försöken hade också viss framgång och vi lyckades mäta direkt elektronöverföring mellan det intakta enzymet och en guld elektod täckt av ett thiol-lager. Det behövs dock fler experiment för att kunna förstå exakt hur enzymet och elektroden interagerar med varandra Swedish official title: Upprening av Komplex II enzym för inmärkning av kinon bindande platser och bielektrokemisk analys Swedish credits: 20p E-mail address of first author: [email protected] Supervisor: Cecilia Hägerhäll, biochemistry Submission date/time: 2002-06-13 Examensarbete i kemi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet Purification of Complex II for photoaffinity labeling & bioelectrochemical analysis Helena Bondesson Chemistry, biochemistry Spring 2002 Abstract in English Succinat:quinone oxidoreductase, or Complex II of the respiratory chain, consists of three or four subunits; a 65kDa FAD containing polypeptide, a 28 kDa iron-sulfur cluster containing polypeptide and a 23 kDa membrane spanning subunit cytochrome b558 that anchors the two hydrophilic subunits to the membrane. The aim of this work was to identify the quinone binding sites of the Bacillus subtilis Complex II. First, Complex II was isolated from B. subtilis membranes to about 95% purity. A newly synthesized azido-quinone worked as a natural electron acceptor for Complex II, and could thus be used for photoaffinity labeling of the quinone binding sites. The conditions for such labeling were optimized to prevent both excess UV damage of the enzyme and unspecific labeling. Samples labeled under different conditions were prepared and sent to our collaborators at Gothenburg University for mass spectrometry analysis. We are still awaiting the final results from this analyses. Until then it is not possible to draw a final conclusion concerning the number and properties of the quinone binding sites in this Complex II. We also analyzed the cytochrome b558 properties using bioelectrochemical methods. We could demonstrate direct electron transfer between the intact Complex II and a thiol coated gold electrode in a specially designed spectroelectrochemical cell, whereas in previous electrochemical studies of Complex II only the two soluble subunits have been used.