Examensarbete i kemi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Kloning och uttryck av NuoB, C, D och G subenheter i Komplex I i
andningskedjan
Anders Holmberg
För att förstå hur ett specifikt enzym fungerar måste man i första hand titta på hur det är uppbyggt. De
flesta enzymer är komplexa sammansättningar av ett flertal proteiner (subenheter), vilka tillsammans
bidrar till enzymets funktion. Så är fallet vad gäller det enzym som jag har studerat i mitt arbete.
Andningskedjan är lokaliserad i cellernas mitokondrier. I mitokondrierna förbränns sockerarter och
den energirika föreningen ATP (adenosintrifosfat) produceras. ATP kommer till användning vid
muskelarbete, transporter genom cellmembran, kemiska uppbyggnadsarbeten och övriga processer i
cellen där energi krävs. Mitokondrierna använder sig av drygt ett tjugotal olika enzymer för att
åstadkomma att den kemiska energin ur socker bevaras i form av dessa ATP-molekyler.
Det hela börjar i citronsyracykeln. I citronsyracykeln oxideras ättiksyramolekyler till
koldioxidmolekyler. Denna oxidationsprocess sker i små steg och på ett sådant sätt att det kemiska
energiinnehållet i ättiksyran tillvaratages. Bildandet av ATP ur denna energi sker genom ett samarbete
mellan citronsyracykelns och andningskedjans enzymer. De olika enzymerna är belägna på olika
platser i mitokondrien. Somliga sitter fästade på membraner, andra finns mellan membranen.
Mitokondrierna är omgivna av två begränsande membraner och andningskedjan, innehållande det
nämnda enzymet Komplex I, är lokaliserad i det inre av de två.
Andningskedjan består av fyra enzymkomplex (I, II, III och IV) genom vilka en elektrontransport
skapar en vätejonspotential över membranet. Denna potential driver i sin tur ATP-produktionen,
vilken sker genom enzymet ATP syntas.
Komplex I är det största och mest komplexa enzymet i andningskedjan. Det består av ett flertal
subenheter och man har antagit att dessa förekommer i antalsförhållandet 1:1. Dock finns det inga
direkta experimentella bevis för detta antalsförhållande. Antalsförhållandet mellan subenheterna är av
stor vikt för förståelsen för hur enzymet. För att antalsbestämma de olika subenheterna i Komplex I
krävs antikroppar mot de individuella subenheterna. Målet för mitt arbete var att producera just sådana
antikroppar mot fyra ur enzymet utvalda subenheter (NuoB, C, D och G).
För att möjliggöra en produktion av antikroppar krävs en stor mängd av en specifik subenhet.
Massproduktion av subenheter görs genom att man först klonar generna som kodar för subenheterna,
dvs. man framställer ett stort antal kopior av de specifika generna. Generna som användes som mall
vid kopieringen isolerades från kromosomerna i bakterien Rhodobacter capsulatus. Kopieringen
gjordes med hjälp av en teknik kallad PCR (Polymerase Chain Reaction). På varje kopia adderades en
extra bit genetiskt material (His-tag). Denna His-tag är ett verktyg för att kunna isolera subenheterna
efter att man låtit bakterieceller uttrycka dem. Bakterien som användes vid uttryckandet av generna var
Escherichia coli (BL21).
Då jag i mitt arbete inte lyckades med att addera, den för proteinisoleringen nödvändiga, His-taggen
kunde jag aldrig påvisa att ett utryck av mina subenheter hade skett. Därigenom blev det inte heller
möjligt att tillverka några antikroppar.
Om man i framtiden lyckas uttrycka och isolera de önskade subenheterna, och därefter låter ett
försöksdjur producera antikroppar mot dessa kan man genom Rocket Immuno Electrophoresis
bestämma antalsförhållandet mellan dem. Prover med kända koncentrationer av subenheterna kan då
appliceras på en gel innehållande antikropparna. På samma gel appliceras ett prov innehållande
vildtypen av Komplex I. Genom att jämföra resultaten för vildtypen med resultaten för proverna med
de kända koncentrationerna kan subenheternas antalsförhållande bestämmas.
Swedish official title: Kloning och uttryck av NuoB, C, D och G subenheter i Komplex I i
andningskedjan
Swedish credits: 20p
Supervisor: Cecilia Hägerhäll, Biochemistry
Submission date/time: 2001-02-16
Examensarbete i kemi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Cloning and expression of the NuoB, C, D och G subunits of Complex
I in the respiratory chain
Anders Holmberg
Chemistry, Biochemistry
Spring 2000
Abstract in English
Complex I is the largest, most complex, but still the least understood of the respiratory chain
enzyme complexes. It is assumed that all the subunits of Complex I in bacteria are present in
1:1 stoichiometry, but there is no direct experimental evidence for this. To quantitate the
Complex I subunits we need antibodies against individual subunits, both of the peripheral and
the membrane-spanning domain of the enzyme. The aim of this work was to produce
antibodies against the NuoB, C, D and G subunits in bacterial Complex I. The first step was to
clone the subunits from Rhodobacter capsulatus. The B, C and D subunits were cloned in one
unit. Since these subunits together resemble a soluble NiFe hydrogenase, they are expected to
form a unit within Complex I. NuoG, resembling a single subunit Fe-only hydrogenase was
cloned as a single gene. By adding a His-tag to the cloned genes purification of the expressed
proteins could be done by Ni2+-affinity chromatography. Escherichia coli (BL21) was used as
an expression host. The purified proteins can be used for antibody production. Antibodies can
be used to quantitate the subunits by rocket immuno electrophoresis
