Spårning av enskilda molekylers
diffusionstillstånd och
övergångshastigheter i levande celler
Tack vare ett nytt analysverktyg är det nu möjligt att kombinera information från tusentals
korta förflyttningar bland enskilda molekyler av intracellulärt diffunderande proteiner.
Metoden har redan bidragit till en objektiv interaktionskarta för Hfq-proteinet. En karta som
visar ett antal nya diffusionstillstånd och övergångshastigheter.
Ett sätt att öka kunskapen om kinetiken hos olika intracellulära processer är att observera svar
på perturbationer (inducerade förändringar av biologisk funktion). Denna metod är kraftigt
begränsad av svårigheterna med att inducera specifika perturbationer in vivo. En metod med
större möjligheter är SPT (eng., single-particle tracking), där man följer enskilda partiklars
förflyttningar.
Med hjälp av SPT är det möjligt att följa enskilda proteinmolekylers förflyttningar i levande
cellers membran och i cytoplasma. När de enskilda molekylernas bindningstillstånd förändras,
förändras ofta diffusionsegenskaperna, vilket kan användas för att fastställa intracellulära
reaktionshastigheter utan hjälp av några externa perturbationer. En utmaning med denna
metod är dock att de enskilda intracellulära diffusionsbanorna som mäts med hjälp av
fluorescensinmärkta fusionsproteiner sällan är längre än 100 ms. Samtidigt är det lätt att med
hjälp av avancerade mikroskopitekniker samla in tiotusentals enskilda diffusionsbanor under
bara några minuter. En annan utmaning är därför att kombinera informationen från tusentals
korta molekylförflyttningar för att få fram antalet bindningstillstånd och hastigheten för
övergångarna mellan de olika tillstånden. Forskarna har utvecklat en algoritm för att göra
sådana analyser med tillförlitlig statistik och har implementerat metoderna i den fritt
tillgängliga mjukvaran vbSPT (variational Bayes SPT).
Forskarna på SciLifeLab testade metoden genom att spåra fluorescensinmärkt Hfq. Hfq är ett
RNA-hjälpprotein som medierar genreglering efter transkriptionen genom att möjliggöra
interaktioner mellan RNA och icke-kodande, små sRNA-molekyler. Eftersom mRNA
antingen återfinns i fri form eller kopplat till andra makromolekyler, förväntade sig forskarna
att hitta Hfq i bindningstillstånd med mycket olika diffusionsegenskaper.
När man tillämpade vbSPT-analys på ett dataset som omfattade 12 130 förflyttningar från ett
enda Hfq-spårningsexperiment på omkring tio E. coli-celler fick man fram en ”best-fit”modell med tre tillstånd med diffusionskonstanter på omkring 3 µm2 s−1, 0,7 µm2 s−1 och 0,2
µm2 s−1. För celler som har behandlats med antibiotikumet rifampicin (rif), i vilka RNA:t är
nedbrutet, fick man fram en modell med två tillstånd med diffusionskonstanter som
motsvarade de två snabbare tillstånden för obehandlade celler. Dessutom var den fraktion som
hos de obehandlade cellerna utgjorde mellantillståndet, men som i de behandlade utgör det
långsammaste tillståndet (0,7 µm2 s−1), betydligt mindre.
Dessa tillstånd kan representera interaktioner mellan Hfq och olika RNA-varianter. Det
långsammaste skulle kunna utgöras av Hfq bundet till RNA som transkriberas, medan
minskningen av den långsammare fraktionen efter rif-behandling kan förklaras av det lägre
antalet RNA-molekyler som finns tillgängliga för bindning. Omvandling från långsamt till
snabbt tillstånd kan avspegla hastigheterna för Hfq:s dissociation från RNA och/eller RNAnedbrytning. Ingen av dessa parametrar förändras av rif-behandling.
Användning av vbSPT för att skapa objektiva interaktionskartor för proteiner som Hfq ger
ökade möjligheter att karaktärisera intracellulära processer baserat på spårningsinformation
från enskilda molekyler.
Referens
Persson, Lindén et al. (2013) Extracting intracellular diffusive states and transition rates from
single-molecule tracking data. Nature Methods Vol. 10 No. 3 265-269.
Kontakt
Johan Elf
[email protected]
I
