Therese Jacobson
Extraktion av DNA och RNA från arkiverad tjocktarmscancer
Analyser av vävnadsmaterial som tas tillvara tillexempel vid canceroperationer utgör
en länk mellan molekylär forskning och klinisk behandling. Formalin-fixering och
paraffin-inbäddning har, under det senaste århundradet varit standardmetoden för att
bevara och lagra vävnader för vidare forskning. Under fixeringsprocessen
fragmenteras DNA och RNA vilket försvårar deras extraktion och därav även
molekylära analyser.Graden av fragmentering påverkas av faktorer som typ av vävnad
och de förhållanden som råder vid fixeringen som tid, temperatur, pH samt val av
fixeringslösning.
Den vanligaste är att man använder fixeringslösningen formalin som orsakar den mest
centrala molekylära modifieringen, kors bryggor mellan nukleinsyror och proteiner.
Denna typ av fixering kallas kors-bindande fixering (cross-linking fixative) och är en
av de två stora grupperna av fixeringslösningar. Den andra gruppen består av
utfällningsfixeringslösningar (precipitation fixative) som bevarar substanserna i
cellerna men inte vävnadens morfologi. Exempel på dessa är etanol, metanol och
aceton.
Genuttrycksanalyser är viktiga för molekylär forskning när det gäller klassifieringar,
prognoser och behandlingar av humana sjukdomar. Det finns flera väl utvecklade
metoder som analyserar genuttryck i vävnader. Dessa metoder karakteriserar uttryckta
gener och ger molekylär information om sjukdomar som tillexempel cancer.
I min studie har jag analyserat material från tjocktarmscancer som har formalinfixerats samt paraffin-inbäddats. Jag har även tittat på friskt blod samt på akut
myeloid leukemi (AML). I studien användes flera olika metoder för att se vilken
metod som bäst bevarar DNA och RNA från dessa tre grupper av material.
Mina resultat visar att formalin-fixering och paraffin-inbäddning påverkar
extraktionen av nukleinsyror. Graden av fragmentering gör det svårare att rena fram
tillräckligt med material för att göra genuttrycksanalyser. I jämförelsen mellan de
olika extraktionsmetoderna kom jag fram till att två av metoderna lyckades bäst med
att rena fram DNA och RNA med tillräckligt hög kvalité för att kunna utföra
genuttrycksanalyser. För DNA var det en automatisk reningsmaskin, GeneMole®,
Mole AB (Oslo, Norge) och för RNA var det ett manuellt kit från Qiagen AB
(Stockholm, Sverige).
Handledare: Ali Moshfegh, Joachim Lundahl
Examensarbete 30 hp i molekylärbiologi Ht 2007
Institutionen för cell- och organismbiologi, Lunds universitet
Instititionen för onkologi och patologi, Karolinska Biomic Center (KBC), Karolinska
Universitetssjukhuset, Stockholm.
Therese Jacobson
Comparison of purification methods of DNA and RNA from archival
paraffin-embedded colon cancer, the HL-60 cell line and Fresh blood
Tissue samples collected and processed for pathology- diagnosis represent a unique
source of archived and morphologically defined disease-specific biological material.
Retrospective analysis of this archival tissue would enable the correlation of
molecular findings with the response to treatment and the clinical outcome. Formalinfixing and paraffin-embedding has, the last century been the method of choice for the
processing and long-term storage of the tissues. Quantitative polymerase chain
reaction (qPCR) is a potential method for reliable quantitative gene expression
analysis of chemically modified material such as formalin fixed, paraffin-embedded
material. In this study, we compared cycle threshold (Ct) values from qPCR of DNA
and RNA from between different groups of material extracted with different methods.
Our results show that the success in DNA extraction from paraffin-embedded material
depends on what type of method that is used. We extracted DNA with high yield and
purity for applications such as comparative genome hybridization (CGH) arrays.
Meaningful RNA expression analysis can be performed on formalin-fixed paraffinembedded (FFPE) samples, with the caveats that many samples are too degraded for
analysis although DNase treatment is recommended for successful results.
Advisor: Ali Moshfegh, Joachim Lundahl
Degree project. 30 credits in molecular biology. Autumn 2007
Department of cell- and organismbiology, Lund University
Department of oncology and pathology, Karolinska Biomic Center (KBC) Karoliska Universitetssjukhuset,
Stockholm
