Institutionen för fysik, kemi och biologi
Examenarbete
Alternativ splicing: Mutationer i BRCA1 och BRCA2
orsakar bröstcancer
Sahar Azadi
Examensarbetet utfört vid IFM Biologi
2012-05-31
LITH-IFM-G-EX--13/2721—SE
Linköpings universitet Institutionen för fysik, kemi och biologi
581 83 Linköping
Avdelning, Institution
Division, Department
Datum
Date
Avdelningen för biologi
Institutionen för fysik och mätteknik
Språk
Language
x Svenska/Swedish
Engelska/English
Rapporttyp
Report category
Licentiatavhandling
x Examensarbete
C-uppsats
D-uppsats
Övrig rapport
________________
_______________
URL för elektronisk version
ISBN
____________________________________________
ISRN
____________________________________________
Serietitel och serienummer
Title of series, numbering
ISSN
LITH-IFM-G-Ex—13/2721--SE
Handledare
Supervisor:
Johan Edqvist
Ort
Location: Linköping
Titel
Title
Alternativ splicing: Mutationer i BRCA1 och BRCA2 orsakar bröstcancer
Alternatice splicing: Mutations in BRCA1 and BRCA2 cause breastcancer
Författare
Author
Sahar Azadi
Sammanfattning
Abstract
During the past decade it has been shown that alternative splicing is a important mechanism for the proteome
diversity. AS is a mechanism that generates a large amount of protein isoforms from a low number of human genes.
Alternative splicing is regulated by four groups of cis-regulatory elements and different splicing factors. Even though
AS is important for the diversity and complexity of different organisms it is also a source for different genetic
diseases like cancer. This review article will focus on breast cancer and its connection to the mechanism of
alternative splicing. Breast cancer is a common disease in women. In recent years many studies have shown an
important relationship between mutations in the alternative splicing mechanism and the two most important genes
involved in breast cancer BRCA1 and BRCA2. This article will also present different efforts against this disease.
Nyckelord
Keyword
Alternativ splicing, BRCA1, BRCA2, Breast Cancer, Splicing, DNMT, PARP
1
Innehållsförteckning
Abstrakt ...................................................................................................................................... 3
Introduktion ................................................................................................................................ 4
Alternativ splicing ...................................................................................................................... 5
Regleringsproteinerna SR och hnRNP .................................................................................. 7
Olika typer av alternativ splicing .......................................................................................... 8
Alternativ splicing har en stor betydelse vid cancer ............................................................. 9
Epigenetiska modifieringar och DNMT genen ........................................................................ 10
Viktiga gener för forskningen inom bröstcancer...................................................................... 11
Vilka domäner har BRCA1? ............................................................................................... 11
BRCA1 och homolog rekombination .................................................................................. 12
BRCA1 och non-homologous end-joining .......................................................................... 12
Mutationer i BRCA1 ........................................................................................................... 13
BRCA1 splice varianter ...................................................................................................... 14
BRCA2 ..................................................................................................................................... 15
Vilka domäner har BRCA2? ............................................................................................... 16
BRCA2 splicevarianter……………………………………………………………………17
Kopplingen mellan BRCA1 ochBRCA2.................................................................................. 17
Forskningen kring förebyggandet av bröstcancer .................................................................... 18
Splicingvarianter och läkemedel……………………………………………..……………….18
Samanfattning………………………………………………………………...……..…..……19
Referenser........................................................................................................................... …..21
2
Abstrakt
Under det senaste decenniet har det visat sig att alternativ splicing är en viktig mekanism för
proteomets mångfald. Alternativ splicing är en mekanism som genererar en stor mängd
proteinisoformer från ett lågt antal mänskliga gener. Alternativ splicing regleras av fyra
grupper av cis-regulatoriska element och olika splicing faktorer. Även om alternativ splicing
är viktig för mångfalden och komplexiteten i olika organismer är det också en källa för olika
genetiska sjukdomar som cancer. Denna review artikel kommer att fokusera på bröstcancer
och dess koppling till mekanismen alternativ splicing. Bröstcancer är en vanlig sjukdom hos
kvinnor. På senare år har många studier visat ett viktigt samband mellan mutationer i
alternativ splicing mekanismen och de två viktigaste generna involverade i bröstcancer
BRCA1 och BRCA2. Denna artikel kommer också att presentera olika insatser mot denna
sjukdom.
Nyckelord: Alternativ splitsning, BRCA1, BRCA2, bröstcancer, splicing, DNMT, PARP
3
Alternativ splicing: Mutationer i BRCA1 och BRCA2 orsakar bröstcancer
Introduktion
År 1977 upptäckte nobelpristagarna Philip Sharp och Richard Roberts att eukaryota gener
oftast är uppdelade i kodande exoner och icke kodande introner [1]. Detta innebär att
eukaryota gener är avbrutna, d.v.s. icke kodande sekvenserna ligger inom kodande regioner
och bryter av den kodande genen. För de flesta eukaryota celler måste RNA genomgå olika
processer innan den slutgiltige mRNA:t ska genomgå translation och syntetisera ett visst
protein. En utav de viktigaste processerna kallas för splicing. Splicing innebär att intronerna
plockas bort från prekursor-mRNA (pre-mRNA). Därutav består mRNA endast utav kodande
sekvenser d.v.s. exoner som sätts ihop under splicing processen [2, 3].
Splicing sker via två esterfieringsteg. De två esterfieringstegen katalyseras av splicosomen.
Splicosomen är en makromolekylkomplex som består bland annat av fem små
ribonukleoprotein partiklar (snRNPs); U1, U2, U4, U5 och U6. Dessa snRNPs omsluter
intronen vid splicing.
Varje intron har en 3’ splice site region och en 5’splice site region. Intronens 5’ site
innehåller en GU dinukleotid och 3’ siten har tre konserverade segment; förgreningspunkten,
polypyrimidindelen och ett terminalt AG segment. Som det visas i figur 1, så börjar första
esterfieringsteget med att en hydroxyl grupp i föreningspunkten attackerar fosfaten i 5’ siten.
Detta leder till att exonen klyvs från intronen. Nu sitter 5’ intronen ihop med hydroxyl
gruppen i förgreningspunkten på 3’ siten. Två produkter uppstår från denna klyvning. Andra
esterfieringsteget är en attack från hydroxylgruppen på den fria exonens 3’ site mot fosfaten
på 3’siten av intronen. Detta steg ligerar två exoner och frigör intronen [4,5,6].
Figur 1. De två esterfieringstegen för pre-mRNA splicing. Proteingrupper som är inblandade i
första steget är blå markerade. Grupper från andra steget är rosa markerade. Bilden är tagen
från källa 4 i referenslistan.
4
Dessa två esterfieringsteg sker med hjälp av spliceosomen. Spliceosom bildningen börjar med
att snRNP U1 binder till 5’splice sitet på pre-mRNA:t. Heterodimeren U2AF (U2 auxuliary
faktor), som är ett hjälparprotein, binder till 3’splice sitet och SF1 (splicingfaktor 1) binder till
förgreningspunkten. Dessa tre steg utgör E-komplexet (early complex), som är ATP
oberoende (Se fig.2). Nästa steg är bildandet av ett ATP-beroende A-komplex. Med hjälp av
U2AF ersätts SF1 på förgreningspunkten utav snRNP U2. A-komplexet står för ATPdependent pre-spliceosome complex. I nästa steg binder tre snRNPs U5, U4 och U6 till Akomplexet och B-komplexet bildas. B-komplexet innehåller samtliga faktorer som krävs för
att splicing ska ske. Innan B-komplexet blir aktivt sker en del konformationsförändringar. U1
och U4 lossnar och C-komplexet bildas, därefter sker splicingen [7,8,9].
Figur 2. Mekanismen för splicing. Innan själva splicingen sker måste splicosomen bildas på
rätt plats. Detta sker i olika steg där intermediära komplex bildas. Bilden är tagen från källa 8
i referenslistan.
Alternativ splicing
Alternativ splicing är en process som medför att olika proteiner kan produceras från en enda
gen. Studier har visat att 40-60% av människans gener genomgår alternativ splicing [10]. År
1977 upptäcktes exoner och introner hos andenovirusets hexon gen. Strax därpå upptäcktes
processen splicing. Som tidigare nämnt sker splicing efter transkriptionen då introner tas bort
från pre-mRNA och exonerna fogas ihop. Exonerna kan fogas ihop via flera olika
kombinationer, vilket medför att det bildas olika mRNA isoformer från en gen. Detta kallas
alternativ splicing [11].
5
Figur 3. Bilden ger en generell förklaring till mekanismen alternativ splicing. En gen kan
innehålla flera exoner och introner. Exonerna kan under splicing sättas ihop på olika sätt.
Detta kallas alternativ splicing (AS). AS ger upphov till olika proteiner från samma gen.
Bilden är från källa 12 i referenslistan.
Det finns två modeller för mekanismen alternativ splicing; intron definition och exon
definition. Antingen kan intronen plockas bort som i beskrivningen ovan, eller så kan exonen
exkluderas [4]. Intron definition innebär att splicosomen och inblandade splicing proteiner
känner igen intronen och placeras runt den. Intron definition anses vara det evolutionära
ursprunget för alternativ splicing. Exon definition sker när de inblandade proteinerna för AS
placeras runt exonen. En indikation för exon definition är hög koncentration av G-C
bindningar. Exon definition är en mekanism som har utvecklats med tiden och är vanligare
hos högre eukaryoter [13].
Det finns flera cis-element som avgör vilka exoner som ska uteslutas och vilka exoner som
ska vara med. Dessa delas in i fyra grupper; exonic splicing enhancers (ESE), exonic splicing
silencers (ESSs), intronic splicing enhancers (ISEs), intronic splicing silencers (ISSs) [10].
ESE och ESS förekommer i exoner som genomgår alternative splicing. ESE aktiverar
närliggande splice siter och detta leder till att inkluderingsfrekvensen för exonen ökar vid
alternativ splicing. För ESS gäller det motsatta, d.v.s. exkluderingsfrekvensen för exonen ökar
[14]. ISE och ISS fungerar på motsvarande sätt men för introner [11].
6
Figur 4. Bilden visar de olika splicingregulatorerna ESS, ESE, ISE och ISS. Splice site
igenkänning styrs av att proteiner som SR, hnRNP, TIA1 m.m. interagerar med de olika
regulatoriska sekvenserna. Bilden är tagen från källa 4 i referenslistan.
Regleringsproteinerna SR och hnRNP
Cis-elementen interagerar med regleringsfaktorerna, SR-proteiner (serin- och argininrik
region) som initierar exoninkludering och hnRNPs (heterogeneous nuclear
ribonucleoproteins) som inhiberar exoninkludering.
SR-proteiner har en viktig roll vid splice site igenkänning. Dessa proteiner kan binda in till
ESE och initierar exoninkludering i mRNAt. Det är fortfarande okänt om ESE aktiviteten är
beroende av SR proteiner eller inte men deras närvaro verkar vara viktig för identifiering av
exoner [15]. Alla SR proteiner innehåller två viktiga sekvenser. Ena sekvensen är RS
domänen, som binder till andra RS domäner. SR proteiner kan även innehålla en eller två
RRMs, RNA recognition motifs, som binder till RNA:t. RRMs sitter vid N-terminalen och RS
domänen sitter vid C-terminalen. RS domänen fosforyleras via olika kinaser. Denna
fosforylering är mycket viktig för att RS domänerna ska kunna interagera med varandra samt
kunna vara inblandade i splicing mekanismen [16,17]. Ett utav de viktigaste SR proteinerna
som spelar en stor roll vid splicing är ASF/SF2 (Alternative splicing factor/splicing factor 2).
Genom att interagera med pre-mRNA och snRNPs ökar ASF/SF2 sin affinitet för splice siten
[18,19]. Fosforylering av serin sker vid ASF/SF2 proteinets RS domän. Fosforyleringen sker
med hjälp av SR specific protein kinase, SRPK1. Detta leder till att proteinet förs till kärnan
och påverkar en del protein-protein interaktioner som sker i samband med splicing [20].
Ändring av mängden splicing faktorer i cancerceller har visat sig vara en betydelsefull faktor
för cancer, t.ex. bröstcancerceller har en högre mängd av splicing faktorn SF2/ASF som är
viktig för AS mekanismen.[21]
En annan regleringsfaktor är hnRNPs (Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins). HnRNPs
är en multifuktionell proteinfamilj. Dessa proteiner är inblandade i splicing, mRNA export,
lokalisering av mRNA, translation och stabilitet [22]. Proteinet hnRNP består av flera
funktionella domäner. Den viktigaste domänen är RRM, som styr proteinets interaktioner med
pre-mRNA. De flesta hnRNP proteiner innehåller även RGG boxar som är upprepningar av
Arg-Gly-Gly tripeptider [23].
7
HnRNPs inhiberar splicing. Detta kan ske på olika sätt. Proteinet kan binda till splice siten
direkt, vanligtvis till ESS på pre-mRNA, och inhibera splicing. HnRNP kan även inhibera
splicing genom att interagera med proteiner som binder till enhancern [24].
För att förstå hur hnRNP reglerar AS krävs lite bakgrundsfakta. En viktig skillnad mellan
cancerceller och friska celler är deras metaboliska regulation. Mogna celler utnyttjar
citronsyracykeln och oxidativ fosforylering, vid närvaro av syre, för maximal energi
produktion. Celler som växer snabbt, t.ex. embryoniska celler och cancer celler, utnyttjar en
annan metabolisk väg dvs. icke oxidativ nedbrytning av glukos. Dessa celler omvandlar
glukos till laktat anaerobt. Detta fenomen kallas Warburg effekten. Ett enzym som är
inblandad i den glykolytiska metabolismen är pyruvat kinas (PK). Proteinet hnRNP
kontrollerar den metaboliska switchen mellan de två olika stadierna dvs oxidativ fosforylering
och aerobisk glykolys. Detta görs genom att hnRNP påverkar alternativ splicing för enzymet
PK och dess isoformer. Dessa studier påvisar återigen att alternativ splicing spelar en stor roll
vid tumörbildningar och cancer.[25].
Mutationer som påverkar regleringsproteiner och komponenter som är inblandade i alternativ
splicing medför högre risk för flera gener att modifieras felaktigt [26]. Alternativ splicing
regleras via extracellulära signaler främst via aktivering av komplexa signal transduktions
nätverk. I dagsläget finns det alltför lite information om hur dessa extracellulära signaler
påverkar splicing faktor aktiviteten[27].
Olika typer av alternativ splicing
Det finns flera typer av alternativ splicing mekanismer som kan delas in i fem grupper. Första
och vanligaste gruppen är exon skipping. Exon skipping står för cirka 40% av alternativ
splicing hos högre eukaryoter. Exon skipping innebär att ett exon tillsammans med dess
sammanhängande introner splicas bort från transkriberingen. Förekomsten av exon skipping
ökar ju högre upp i den eukaryotiska trädet man kommer, vilket innebär att den typen av
alternativ splicing har en evolutionär betydelse för utvecklingen av högre eukaryoter
[28,29,30].
Den andra och tredje gruppen är alternativ 3’ splice site (SS) selection och 5’SS selection.
Dessa typer av mekanismer inträffar när två eller fler splice siter känns igen i ena änden av en
exon.
Den fjärde gruppen är mutually exclusive exons, det innebär att bara en exon väljs utav en
grupp av uppradade exoner [30].
Den minst vanliga typen av alternativ splicing hos människan är den femte gruppen som
kallas intron retention. Där får intronet vara kvar i mRNA. Denna mekanism är dock vanlig
hos växter.[4]
8
Figur 5. Olika mekanismerna för alternativ splicing. Bilden är tagen från källa 30 i
referenslistan.
Alternativ splicing är viktig för reglering av genexpression hos eukaryoter. Många sjukdomar
har även visats vara kopplade till en mutation eller en förändring i processen alternativ
splicing. Sambandet mellan alternativ splicing och bildandet av onkogener och
tumörsuppressorer har väckt stora intressen inom forskningen för olika sjukdomar bl.a.
cancer. [31]
Bröst cancer är en vanlig sjukdom hos kvinnor och under senare år har man kommit fram till
viktiga samband mellan mutationer i alternativ splicing mekanismen för viktiga gener som
kan ge upphov till bröstcancer.[32]
Texten kommer att ta upp de kopplingar som har hittats mellan alternativ splicing och
bröstcancer hittills. Eventuella hypoteser om huruvida man kan förhindra och behandla
felaktig splicing kommer att diskuteras.
Alternativ splicing har en stor betydelse vid cancer
Alternativ splicing har visats spela en stor roll vid tumörutvecklingen i cancer. Detta kan
göras antingen via inaktivering av tumörsuppressorer eller via aktivering av funktioner hos
proteiner som bidrar till tumörbildning [32]. Studier har visat att förekommandet av alternativ
splicing minskar hos cancerceller jämfört med normala celler. Detta kan bero på inaktivering
av proteiner som reglerar splicingen. Även typen av alternativ splicing skiljer sig mellan
cancerceller och vanliga celler. Cancerceller har en högre nivå av intron retention än vanliga
celler som istället har exon skipping. Även typerna 3′ splice site och 5′ splice site förekommer
mer hos cancerceller. Detta visas tydligt i figur 6 Exon skipping är den vanligaste typen av
alternativ splicing hos de flesta eukaryoter [33].
9
Figur 6. Fördelningen av alternativ splicing typer hos cancerceller (lila) jämfört med friska
celler(blå). Bilden är tagen från källa 33 i referenslistan.
Ett exempel på hur splicing varianter kan vara viktiga inom cancer är den humana DNMT
genen (DNA metyltransferas). Genen kodar för de enzym som katalyserar metyleringen av
DNA. Denna modifikation har oftast regleringseffekter [34]. Metyleringen av DNA har visat
sig påverka cellbildningen, strukturen på kromosomen samt reglerar vissa genetiska uttryck.
Studier har även visat att metylering av DNA har en direkt påverkan på transkriptionen. Idag
finns det forskning som påvisar en direkt koppling mellan metylering, DNMT och cancer
[35,36] .
Epigenetiska modifieringar och DNMT genen
Epigenetiska modifieringar är ärftliga samt reversibla förändringar i genuttrycket. Dessa
modifieringar är oberoende av ändringar i själva DNA sekvensen. Exempel på epigenetiska
modifieringar är DNA-metylering och histonmodifiering [37,38]. DNA-metylering har visats
spela en stor roll vid utvecklingen av cancer. Det finns speciella enzymer s.k. DNAmetyltransferas (DNMT) enzymer som ger upphov till metyleringen av DNA:t.
Många onormalt splicade typer av DNMT transkript har visat sig förekomma i tumör och
cancerceller. Dessa mRNA transkript bidrar till att cellen förökar sig dubbelt så snabbt än
vanliga celler, vilket leder till tumörbildning [34].
DNMT består av en grupp enzymer som katalyserar metyleringen av CpG dinukleotider på
DNA:t. DNMT transfererar en metylgrupp från SAM (S-adenosyl-metionin) till C5 positionen
på pyrimidinringen för cytosin i CpG dinukleotider [39]. SAM produceras i levern och är ett
vanligt cosubstrat vid metyltransfereringar. CpG nukleotider är vanligtvis placerade på
specifika delar av genen bland annat förekommer ometylerade CpG öar som är en sekvens
med mycket hög C och G frekvens. CpG öar förekommer oftast vid promotorer. Metylering
av CpG är mycket viktig för olika processer bl.a. genomisk imprinting, X-kromosom
inaktivering, avlägsnandet av repetitiva element samt reglering av vissa genetiska uttryck
[40,41].
10
För metyleringen av CpG öarna i cancerceller krävs onormalt högt hypermetylering. Detta
leder till transcriptional silencing, d.v.s. transkriptionen stoppas. När dessa CpG öar
förekommer vid promotorer hos tumörsuppressorer leder det till att transkribering av dessa
stoppas och suppressorerna bildas inte. Viktiga tumörsuppressorer för bröstcancer som
drabbas är ER (estrogen receptor) och BRCA1 [42]. Vi återkommer till dessa suppressorer
senare i texten.
Det finns fem DNMT isoformer; DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b och DNMT3L. Det
är bara tre av dessa isoformer som metylerar DNA:t. De typer som främst förekommer i
cancerceller är DNMT1 och DNMT3b. Studier har visat att dessa två gener fungerar
cooperativt dvs. båda generna måste slås ut för en märkbart minskad metylering samt minskad
cancer spridning [43]. Alternativa splice varianter av isoformen DNMT3b förekommer
mycket i cancerceller [44]. Även om dessa splice varianter inte kodar för katalytiskt aktiva
proteiner kan de ge upphov till DNA metylering i cancerceller. Hur mekanismen för detta
fungerar är fortfarande oklart [45].
Viktiga gener för forskningen inom bröstcancer
Under den senaste tiden har många gener identifierats som är direkt inblandade i bröstcancer.
Generna BRCA1 och BRCA2 är två exempel på dessa gener. BRCA1 breast cancer type 1
susceptibility protein, är en tumörsuppressor gen som identifierades år 1994. Studier har visat
att BRCA1 genen har väldigt många olika splice varianter som även uttrycker sig på olika
sätt. Än så länge har mer än ett trettiotals olika mRNA splice varianter identifierats [32]. Det
har visats att mutationer i dessa proteiner leder till uppkomst av tumörer främst i bröst och
äggstockar. Denna gen har många olika splice varianter gör den till en bra utgångspunkt för
studier av alternative splicing och kopplingen till bröstcancer.
Främsta orsaken till bröstcancer är ärftlighet. Både BRCA1 och BRCA2, som också är en
tumör suppressor gen, är ärftliga bröstcancer gener. Bärare på mutationer i generna BRCA1
och BRCA2 uppskattas ha 85% högre risk för bröstcancer [48].
I normala celler fungerar BRCA1 och BRCA2 som proteiner där de stabiliserar DNA:t och
förhindrar okontrollerad celltillväxt. BRCA1 är även inblandad i reglering av cell cykeln,
centrosom duplikationen samt aktivering av transkriptionen [49].
Studier har visat att mutationer i dessa gener förekommer främst hos Ashkenazi judar [48].
Vilka domäner har BRCA1?
BRCA1 genen kodar för ett protein med 1863 aminosyror hos människan, och har 24 exoner.
N-terminalen består av en zinc-finger domän som är en Cys-His domän. Denna domän brukar
förekomma hos proteiner som kan interagera med DNA. Exon 11 är det största exonet hos
BRCA1. Denna exon kodar för mer än 60% av proteinet. Den domän av proteinet som kodas
av exon 11 kan interagera direkt eller indirekt med proteiner som RAD50, RAD 51, RB och
c-Myc [49].
C-terminalen för BRCA1 genen är viktig för dess tumörsuppressor aktivitet. Det är mutationer
i denna region som leder till ökad risk för bröstcancer. Denna region innehåller två
repeterande sekvenser som kallas BRCT repeats. BRCT repeats fungerar som protein-protein
interaktions moduler [50]. Studier visar att BRCT repeats sitter ihop på ett sätt som är mycket
viktig för BRCA1:s roll som tumörsuppressor. C-terminalen hos BRCA1 interagerar med
11
många proteiner bl.a. BRCA2, ATM, BARD1 och p53. På grund av dessa interaktioner kan
saknad av funktionellt BRCA1 ge upphov till genetisk instabilitet, ökad apoptos och
störningar för cellens tillväxt [51]. Mutationer i dessa proteiner är också väsentliga i olika
grad för uppkomsten av bröst cancer[49].
En av BRCA1 viktigaste uppgifter är att åtgärda skador på DNA:t. Dessa skador kan vara
interna eller externa som t.ex. UV eller oxidativ stress. BRCA1 lokaliseras oftast till
dubbelsträngs brott på DNA:t [52]. Olika skador på DNA:t medför olika reparationsprocesser.
Dubbelsträngsbrott repareras vanligtvis via homolog rekombination (HR) eller nonhomologous end-joining (NHEJ). Proteinet BRCA1 medverkar i båda dessa
reparationsprocesser [53].
BRCA1 och homolog rekombination
Proteinet som kodas från BRCA1 genen är inblandad i processen homolog rekombination.
Denna process används för att reparera dubbelsträngs brott i cellernas DNA. När processen
HR är muterat, antingen via mutationer i BRCA1 eller skador i andra inblandade proteiner,
måste cellen utnyttja andra typer av reparationsprocesser. Dessa reparationssystem är mer
felbenägna än HR. Detta kan leda till ostabila kromosombildningar och ökad risk för
tumörbildning [54].
Reparering av HR utnyttjar ena systerkromatiden som mall för att få till rätt baspar i DNA:t.
Dubbelsträngsbrott(DSB) aktiverar ATM kinaset (ataxia telangiectasia-mutated), som i sin tur
aktiverar hela DNA damage responsen. Repareringsprocessen börjar med att 3’änden av varje
sida av DSB frigörs med hjälp av MRN (RAD50-MRE11-NSB1) komplexet och detta styrs
av BRCA1. MRN komplexet binder till det skadade DNA:t och genomgår en del
konformations förändringar som i sin tur håller ATM kinaset aktivt på DSB siterna [55]. Den
enkelsträngade DNA:t omges av RPA, en grupp av proteiner som binder till RAD51 som i sin
tur katalyserar invasionen av ssDNA:t till systerkromatider. Då systerkromatiden används
som mall i denna reparations process elongeras
ssDNA och holiday junctions bildas mellan de två systerkromatiderna. Slutligen löses
holiday junction och DNA:t ligeras felfritt [53].
BRCA1 och non-homologous end-joining
Till skillnad mot HR, som använder systerkromatiden som mall för reparering av DNA:t , så
innebär NHEJ en direkt ligering av DNA-änden via ett ligeringskomplex. Det kan uppstå fel i
repareringen mer ofta än vid HR men ändå så spelar NHEJ en stor roll för DNA reparering
och den genetiska stabiliteten.
Det har gjorts många studier som visar att NHEJ regleras av BRCA1. Skador på gener
inblandade i NHEJ har visats leda till ökad risk för utveckling av bröstcancer [53]. Man har
försökt få fram kopplingen mellan NHEJ och BRCA1 och hur mutationer och defekter i
BRCA1 kan leda till cancer [56]. Det har nyligen påvisats att skadade BRCA1 hos mouse
embryonic fibroblasts (MEFs) leder till en tydlig minskad aktivitet av NHEJ [57,58].
Forskning har gjorts för att hitta liknande samband hos människan. Fortfarande kan inget
fastställas då olika studier och försök har lett till olika resultat. En förklaring kan vara att det
finns fler än en NHEJ mekanism och där BRCA1 inte behövs vid alla dessa mekanismer. Hos
människan har BRCA1 polymorfier en stor betydelse vid NHEJ och bröstcancer [56].
12
Mutationer i BRCA1
Studier har visat att BRCA1 är inblandad i regleringen av alla faser av cell-cykeln.
Mutationer i BRCA1 kan därför medföra skador i DNA samt apoptos. Figur 7 visar att
mutationer i BRCA1 leder till genetisk instabilitet. Detta på grund av mutationens påverkan
på cellcykelfaserna, centromduplikationen och DNA reparerings mekanismen. Den genetiska
instabiliteten visar sig på tre olika sätt som i sin tur leder till defekter samt cancer [51].
Figur 7. En sammanfattning av vad mutationer i BRCA1 kan medföra. Bilden är tagen från
källa 51 i referenslistan.
Genom att studera BRCT regionen har många olika mutationer som brukar förekomma i
bröstcancer kartlagts. Ett exempel är nonsense mutationen som kan uppstå vid Tyr 1853.
Denna mutation raderar de 11 sista aminosyrorna på BRCT domänen vilket är en typisk
mutation för det tidiga stadiet för utvecklingen av bröst cancer. Det som händer är att de
hydrofobiska delar som är i kontakt med den regionen som raderas, ändrar konformation och
det leder till destabilisering av proteinet.
Ett annat exempel är två missense mutationer i BRCT regionen. Dessa kallas för A1708E och
M1775R. Båda är relaterade till bröst och äggstockscancer.
Dessa mutationer skadar DNA regleringsfunktionen hos BRCA1 samtidigt som de försvagar
BRCT domänens roll som transkriptions aktivator. Som figur 8 visar är Ala 1708 och
Met1775 två hydrofobiska regioner mellan de två BRCT strängarna. Ala 1708 är belägen på
2 spiralen som även sitter ihop med 1’ och 3’ som är belägna I center av interaktionen.
Denna region kan lätt attrahera negativt laddade Glu. Met1775 kan substitueras med en Arg.
Dessa mutationer destabiliserar den hydrofobiska interaktionen mellan BRCT strängarna.
13
Figur 8. BRCT regionen. Bilden visar sekvenserna Ala1708 och Met1775 som är två
hydrofobiska regioner mellan de två BRCT strängarna. Bilden är tagen från källa 50 i
referenslistan.
Williams et al. har gjort en studie för att påvisa konsekvenserna av dessa mutationer hos
BRCT. Studien visar att destabilisering av BRCT regionen ökar risken för bröstcancer.
Orsaken till de flesta missense mutationer som förekommer i BIC databasen är fortfarande
okända. BIC står för breast cancer information core och är en databas [83], som tar upp de
olika mutationer som identifierats inom bröstcancer. Men i de flesta fall ligger orsaken i
destabilisering av BRCT domänen. Det förekommer även mutationer som ligger på ytan av
BRCT och har inget med interaktionen mellan de två strängarna att göra. Dessa mutationer
kan istället leda till att förändra en viktig bindningssite för BRCT regionen som är viktig för
dess funktion [50].
BRCA1 splice varianter
Som tidigare nämnts spelar alternativ splicing en stor roll för den genetiska diversiteten. En
kartläggning av de olika splice varianterna av BRCA1 kan ge en bättre förståelse om dess
funktion som bland annat tumörsuppressor. Tabell 1 visar de hittills kända splice varianterna
av BRCA1. Tabellen visar även vilka organ dessa splicevarianter förekommer i. Än har det
inte gjorts studier på varje specifik splicevariant men fyra av dessa förekommer ofta i olika
vävnader och kallas för predominanta splicevarianter . De predominanta splicevarianterna är
full length, D(9,10), D(11q), och D(9,10,11q) [59].
Dessa varianter används flitigt i olika studier. I vissa friska men även sjuka bröstvävnader
förekommer splice typerna full length och D(11q) mer än typerna D(9,10) och D(9,10,11q).
Hos de flesta bröst och äggstocks tumörer förekommer främst splice varianten D(9,10) men
även mindre mängd D(11q).
Dessa skillnader i resultat kan delvis bero på olika metoder som används samt heterogeniteten
av de olika tumörbiopsierna. Det är dock bevisat att under G1 fasen i cellcykeln ökar
transkriptionen av BRCA1 då ökar även mängden av fullängdsvarianten av BRCA1 jämfört
med de andra splice varianterna.
14
Tabell 1. De kända BRCA1 splicevarianterna hos människan, indikerar vilken exon som saknas
samt de organ där de främst förekommer [59].
Namn på splicevarianten
Full legnth BRCA1
With exon 1a (NM_007294)
With wxon 1b (NM_007295)
∆(2-10)(NM_007297)
∆(5)
∆(5q, 6)
∆(9,10)(NM_007302)
∆(9,10,11q) (NM_007305)
∆(9,10,11) (NM_007298)
∆(11q) (NM_007304)
∆(11) (NM_007303)
∆(14-17) (NM_007299)
∆(14-18) (NM_007300)
∆(3)
∆(3,5q)
∆(5q)
∆(6,7)
∆(9)
∆(15-17)(NM_007301)
organ
Bröst, äggstockar, testiklar, tymus m.fl.
Bröst, äggstockar, testiklar, tymus
Placenta
Bröst, lymfocyter
Bröst, äggstockar, lymfocyter
Bröst, lymfocyter
Bröst, äggstockar, lymfocyter
Bröst, äggstockar, lymfocyter
Bröst, lymfocyter
Bröst, äggstockar, lymfocyter
Äggstockar, tyroid
Bröst, lymfocyter
Bröst, lymfocyter
Bröst, lymfocyter
Lymfocyter
Bröst, äggstockar, lymfocyter
Lymfocyter
Lymfocyter
Bröst, lymfocyter
BRCA2
Genen BRCA2 identifierades år 1995. Den klassades som en tumörsuppressor gen som
stabiliserar DNA:t och är inblandad i olika regleringsprocesser. Den humana BRCA2 genen
består av 27 exoner som kodar för 3418 aminosyror [60]. BRCA2 förekommer huvudsakligen
i HR mekanismen. Som tidigare nämnts är HR en reparationsprocess för DNA:t där skadade
dubbelsträngsbrott repareras och byts ut. Proteinet Rad51 är viktig och katalyserar HR
mekanismen. Rad51 bildar ett nukleofilament på ssDNA:t vid dubbelsträngsbrott. BRCA2
hjälper till vid bindningen av RAD51 till DSB. Idag finns det över 1800 olika varianter av
BRCA2. Mutationer i denna gen ökar risken för bröst och äggstockscancer. Det är fortfarande
oklart vilka varianter som förekommer mest i cancervävnader [61].
15
Figur 9. Mekanismen för hur BRCA2 kontrollerar Rad51. Skador på DNA:t triggar igång
repareringsprocessen. Den inaktiva Rad51-BRCA2 komplexet aktiveras. Den aktiva formen
bildar nukleoproteinfilament för rekombinationen. Mekanismen för hur detta går till är
fortfarande oklart. Man vet inte än om det aktiva komplexet innefattar en
konformationsändring eller Rad51 separation från BRCA2. Fosforylering kan vara ett steg till
att aktivera Rad51-BRCA2 komplexet [62].
Vilka domäner har BRCA2?
BRCA2 består av en central DNA binding-domän (DBD) samt åtta BRCT-sekvenser som
binder till RAD51. Proteinet har även NLS-domäner som hjälper till vid lokalisering till
cellkärnan [63]. DBD består av fem domäner; 190-amino-acid- α-helix , tre oligonukleotid
bindandedomäner (OB) som binder till ssDNA samt en tower domän (TD), som skjuts ut från
OB2 för att binda till dsDNA.
Varje BRC sekvens har olika affinitet för RAD51. Studier har visat att mutationer inom
interaktionen mellan BRC4 och RAD51 spelar en stor roll hos cancerpatienter.
N-terminalen på BRCA2 binder till PALB2, vilket är ett protein som kopplar ihop BRCA1
och BRCA2. Vi återkommer till denna protein senare i texten. C-terminalen på BRCA2 består
av nuclear localization sequence (NLS regionen) samt cyclin-dependentkinase (CDK) vilket
är en fosforyleringsregion, som också binder till RAD51[64].
16
Figur 10. De olika domänerna på BRCA2.Figuren visar även vilka proteiner som binder till
de olika sekvenserna. Bilden är tagen från källa 64 i referenslistan.
BRCA2 splicevarianter
Som tidigare nämnt har avbrott i BRCA2 genen en stor påverkan för utvecklingen av
bröstcancer. Man har hittat över 1800 splicevarianter av BRCA2. Studier har även visat
kopplingar mellan vissa av dessa splicevarianter och bröstcancer [78]. Många av dessa
mutationer har klassats som founder mutationer. Founder mutationer är mutationer som
förekommer i DNA:t hos individer från en viss population. Dessa mutationer är ärftliga och
kan oftast även visa åldern på mutationen. Ett slående exempel på dessa mutationer
förekommer hos patienter från Island. Där förekommer mutationen BRCA2 999del5 hos
nästan alla bröst/äggstocks cancerfall. I Sverige är mutationen BRCA24486delG vanligt
förekommande hos svenska patienter [79]. En annan splicevariant av BRCA2 som har
kopplats med bröstcancer är 8393C>G. Denna mutation innebär att kvävebas nr 8393 byts ut
från cytosin till guanin. Detta medför att en ESE sekvens tas bort, vilket leder till att tre SRproteiner inte kan binda in. Då denna mutation ligger på exon 18 leder det hela till att exon 18
tas bort ur transkripten [77].
Kopplingen mellan BRCA1 ochBRCA2
Proteinet BRCA1 är inblandad i olika DNA reparerings processer bl.a. DDR signalering
(DNA damage repair), HR, NHEJ och SSA (single strand annealing). Däremot är BRCA2
huvudsakligen involverad i HR mekanismen. De symptom som uppstår via ärftliga mutationer
i BRCA1 och BRCA2 generna är oftast identiska. Den huvudsakliga länken mellan dessa två
proteiner är HR mekanismen [65].
PALB2 är ett protein som förbinder BRCA1 och BRCA2. PALB2 binder direkt till båda
proteinerna och skapar en fysisk länk mellan dem. Interaktionen mellan PALB2 och BRCA2
har visat sig vara viktig för att binda RAD51 till ssDNA. Dessutom är denna interaktion
väsentlig för rekryteringen av BRCA2 och Rad51 till platsen för DNA-skador och för HR.
Mutationer i alla dessa gener är relaterade till HBOC syndromen (Hereditary breast-ovarian
cancer syndrom). HR är även en viktig mekanism för tumörsuppressor aktiviteten. Mutationer
i BRCA1 och BRCA2 är dominanta för HBOC syndromen men det förekommer även andra
gener där mutationer hos dessa är viktig för HBOC men dessa förekommer i mindre
omfattning. Som exempel kan man nämna ATM och CHEK2. Kvinnor som bär på muterade
17
ATM gener löper dubbelt så hög risk att drabbas av bröstcancer. CHEK2 mutationer
förekommer främst hos nord europeiska kvinnor. (66,67,68)
Forskningen kring förebyggandet av bröstcancer
Det har gjorts mycket forskning kring bröstcancer. Idag finns det många dokumenterade
försök kring detta där man har olika tillvägagångssätt. Tills idag finns det inga skillnader
mellan behandlingar för ärftliga och sporadiska fall av bröstcancer men det finns studier som
visar att riktad terapi är mer effektiv för kvinnor med BRCA1-BRCA2 relaterade tumörer.
Studier har gjorts på mekanismen homolog rekombination. De studier som har gjorts är bl.a.
att man har hitta epigenetiska förändringar I HR mekanismen för cancer patienter bl.a.
metylering. Därmed har man kunnat utnyttja specifika microarrays för DNA metylering vid
HR. En fördel med denna metod är att DNA är stabilare än RNA och lättare att isolera.
Man har nyligen påvisat att BRCA1 och BRCA2 är mycket känsliga mot PARP inhibitorer
(poly ADP ribose polymerase) [69,70]. PARP är den viktigaste reglerings enzymet i
repareringsmekanismen Base excision repair (BER) samt reparerar DNA vid
enkelsträngsbrott (SSB) [71]. Minskad PARP aktivitet ändrar bildningen av SSBs som istället
omvandlas till DSBs vid replikationen och startar igång HR mekanismen. [72]. Detta leder till
att skadade BRCA1 och BRCA2 celler förstörs. PARP inhibitorer har visat antitumör aktivitet
vid bl.a. bröst, äggstocks och prostata cancer som har mutationer i BRCA1 och BRCA2 [73].
Därav verkar dessa enzymer vara effektiva behandlingsalternativ för cancer patienter [74].
PARP aktiverar BER genom att snabbt rekryteras till skador på DNA siten och sätter sig på
DNA:t via dess DNA-bindande domän. Den katalytiska aktiviteten ökar för PARP genom att
poly(ADP-ribos) bildas och förs till acceptor proteiner vilket signalerar rekryteringen för
andra inblandade proteiner som XRCC1 och DNA-ligase III som startar BER för att reparera
SSBs. Om PARP inhiberas försämras BER mekansimen och SSBs omvandlas till DSBs vid
celldelningen. HR mekanismen tar över och DSB:s repareras. Tumörceller som har en icke
fungerande HR på grund av muterade BRCA1/2 är mycket känsliga för effekten av PARP
hämning då oreparerade DNA skador leder till celldöd [75].
Tills idag har man framställt flera olika PARP-inhibitorer och många fler är under
framställning. DNA reparering och PARP är viktiga forskningsområden för bröstcancer
forskning men förståelsen för vilka tumörer som kan vara mest känsliga är viktigt och kräver
vidare forskning.
Splicingvarianter och läkemedel
Alltfler sjukdomar har visats vara relaterade till någon form av alternativ splicing. Det kan
vara allt ifrån inkludering av felaktiga splicesiter i transkriptionen eller nedreglering av den
cellulära splicing mekanismen. Alternativ splicing har därför blivit ett viktigt område inom
läkemedelsforskningen. Förändrade splicing mönster kan fungera som markörer för de
cellulära förändringar som uppstår i samband med olika sjukdomar, vilket ger diagnosiskt och
prognosiskt information. Exempel på nya behandlingsstrategier är (i) över exponering av
18
proteiner som ger upphov till splicing av den påverkade exonet (ii) användning av antisense
oligonukleotider (iii) SiRNA baserade läkemedel för att dämpa gen uttryck (iv) transsplicing
metoden vilket innebär att man ersätter det muterade exonet med en vildtyps exon [80].
En av de viktigaste behandlingsmetoden är antisense strategier. Principen för denna metod är
bindningen av antisense oligonukleotider till target mRNA:t, vilket sätter stopp för
translationen. Antisense oligonukleotider består oftast av 15-20 nukleotider som är
komplementära till target DNA:t. Denna metod är mycket användbar då den har en hög
specificitet samt är billig jämfört med andra metoder [81]. Nyligen har man även utvecklat
antisense oligonukleotider till anti-apoptotiska splice varianter för att sänka den apoptotiska
tröskeln för cancer tumörer. Detta ska ge en mer effektiv kemotrapeutisk behandling [82].
DATAS – differential analysis of transcripts with alternative splicing – är en mycket
användbar teknik som används för att systematiskt identifiera RNA-splicing förändringar i ett
genom. Detta leder till upptäckten av nya splice varianter som inte kan detekteras via andra
metoder. Denna metod kan användas för jämförelse mellan RNA transkript för patienter som
reagerar mot läkemedel och de patienter som inte reagerar mot det. Detta för att jämföra de
alternativt splicade exoner och introner som skiljer sig mellan RNA transkripten för dessa
patienter.
Ökad förståelse för alternativ splicing samt karakterisering av olika splice varianter mha
tekniker som DATAS kommer att ha en stor påverkan för forskningen inom cancer
behandling [80,82]
Sammanfattning
Alternativ splicing är en process som ger upphov till flera olika proteinisoformer från en enda
gen. Detta innebär att de kodande exonerna för en gen kan fogas ihop på olika sätt för att få
olika proteiner. Vilka exoner som ska inkluderas och vilka exoner som ska tas bort avgörs via
fyra olika cis-element; ESE, ESS, ISE samt ISS. Dessa cis-element interagerar med
regleringsfaktorerna SR-proteiner och hnRNPs. SR-proteiner har en viktig roll vid splice site
igenkänning och hnRNPs inhiberar splicing [10,11,12].
Studier har visat att alternativ splicing spelar en stor roll för tumörutvecklingen i olika
cancersjukdomar. Bröstcancer är en av de mest förekommande cancersjukdomen hos kvinnor.
Idag görs det mycket forskning kring utvecklingen av bröstcancer och man har funnit två
mycket viktiga gener som är inblandade i denna sjukdom dvs. generna BRCA1 och BRCA2.
Dessa gener är tumöresuppressorer där mutationer i dessa leder till tumörbildning i bröst och
äggstockar [32,46]. Studier har gjorts på de olika splice varianterna för dessa två gener och
detta har lett till fler och mer effektiva behandlingsmetoder.
Vi har fortfarande inte tillräckligt med kunskap om alla de olika mutationer som uppstår vid
bröstcancer. Det krävs fortfarande mer forskning för att veta hur de olika mutationerna
påverkar olika cellulära signalvägar eller hur de ökar risken för tumörens spridning.
19
Framtidens utmaning är att kunna utnyttja dessa kunskaper för att förbättra behandling och
förebyggandet av bröstcancer.
‘
20
Referenser
[1]. Shampo, M. A., Kyle, R. A. 2003. Richard J. Roberts--Nobel Laureate for discovery of
split genes. Mayo Clin Proc. 78(2):132.
[2]. Clancy, S. 2008. RNA splicing: introns, exons and spliceosome. Nature Education 1(1).
[3]. Lewin, B. 2008. Genes IX. 10th ed. Sudbury: Jones and Bartlett Publishers, Inc.
[4]. Chen, M. & Manley, J. L. 2009. Mechanisms of alternative splicing regulation: insights
from molecular and genomics approaches. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 10:741–754.
[5]. Hui, J. 2009. Regulation of mammalian pre-mRNA splicing. Sci. China C Life Sci. 52:
253–260.
[6]. Licatalosi, D. D. och Darnell, R. B. 2010. RNA processing and its regulation: global
insights into biological networks. Nature Rev. Genet. 11:75–87
[7]. Schellenberg, M. J., Ritchie, D. B. och MacMillan, A. M. 2008. Pre-mRNA splicing: a
complex picture in higher definition. Trends Biochem Sci. 33(6):243-6
[8]. Biamonti, G. och Caceres, J. F. 2009. Cellular stress and RNA splicing. Trends Biochem
Sci. 34(3):146-53
[9]. Will, C. L. och Lührmann, R. 2001. Spliceosomal UsnRNP biogenesis, structure and
function. Current Opinion in Cell Biology. 13:290–301
[10]. Matlin, A. J., Clark, F., och Smith, C. W. 2005. Understanding alternative
splicing: towards a cellular code. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:386–398.
[11]. Modrek, B. och Lee, C. 2002. A genomic view of alternative splicing. Nat Genet.
30(1):13-9.
[12]. Kashyap, L och Tripathi, P. 2008. Alternative Splicing. Department of Biochemistry,
Aligarh. Engineering and Biotechnology, New Delhi, India. Immunology Group, International
Centre for Genetic.
[13]. Schwartz, S., Meshorer, E. och Ast, G. 2009. Chromatin organization marks exon–
intron structure. Nature Struct. Mol. Biol. 16: 990–995.
[14]. Luca Cartegni, L., Wang, J., Zhu, Z., Zhang, M. Q. och Krainer, A. R. 2003. ESEfinder:
a web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acids Res. 31(13): 3568–3571.
[15]. Black, D. L. 2003 Mechanism of alternative pre-messenger RNA splicing.Annual
Review of Biochemistry 72: 291-336
[16]. Twyffels, L., Gueydan, C., Kruys, V. 2011. Shuttling SR proteins: more than splicing
factors. FEBS J.278(18):3246-55
21
[17]. Collins, L. och Penny, D. 2006. Proceedings of the SMBE Tri-National Young
Investigators' Workshop 2005. Investigating the intron recognition mechanism in
eukaryotes.Mol Biol Evol. 23(5):901-10.
[18] Graveley, B. R. 2000. Sorting out the complexity of SR-protein functions. RNA.
6(9):1197-211.
[19]. Wang, Z., Rolish, E. M., Yeo, G. och Tung, V. 2004. Systematic identification and
analysis of exonic splicing silencers. Cell. 119(6):831-45.
[20]. Hagopian, J. C., Ma, C.T., Meade, B. R., Albuquerque, C. P., Ngo, J. C., Ghosh, G.,
Jennings, P. A., Fu, X. D., Adams, J. A. 2008. Adaptable molecular interactions guide
phosphorylation of the SR protein ASF/SF2 by SRPK1 J. Mol. Biol. 382 (4): 894–909.
[21]. Ghigna, C., De Toledo, M., Bonomi, S., Valacca, C., Gallo, S., Apicella, M., Eperon, I.,
Tazi, J., Biamonti, G. 2010. Pro-metastatic splicing of Ron proto-oncogene mRNA can be
reversed: therapeutic potential of bifunctional oligonucleotides and indole derivatives. RNA
Biol.7(4):495-503.
[22]. Dreyfuss, G., Kim, V. N., Kataoka, N. 2002. Messenger-RNA-binding proteins and the
messages they carry. Nat Rev Mol Cell Biol. 3(3):195-205.
[23]. Dreyfuss, G., Matunis, M. J., Piñol-Roma, S., Burd, C. G. 1993. hnRNP proteins and the
biogenesis of mRNA. Annu Rev Biochem.62:289-321.
[24]. Martinez-Contreras, R., Cloutier, P., Shkreta, L., Fisette, J. F., Revil, T., Chabot, B.
2007. hnRNP proteins and splicing control. Advances in Experimental Medicine and Biology
623:123-47.
[25]. Chen, M., Zhang, J., Manley, J. L. 2010. Turning on a fuel switch of cancer: hnRNP
proteins regulate alternative splicing of pyruvate kinase mRNA.70(22):8977-80.
[26]. Ward, A. J. och Cooper, T. A. 2010. The pathobiology of splicing. J Pathol. 220(2):15263.
[27]. Srebrow, A. och Kornblihtt, A. R. 2006.The connection between splicing and cancer.
Journal of Cell Science119: 2635-2641.
[28]. Sugnet, C. W., Kent, W. J., Ares, M. Jr., Haussler, D. 2004. Transcriptome and genome
conservation of alternative splicing events in humans and mice. Pac Symp Biocomput. 66-77.
[29]. Kim, E., Magen, A., Ast, G. 2007. Different levels of alternative splicing among
eukaryotes. Nucleic Acids Res. 35(1):125-31.
[30]. Cartegni, L., Chew, S. L., Krainer, A. R. 2002. Listening to silence and understanding
nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat Rev Genet. 3(4):285-98.
22
[31]. Skotheim, I. R. och Nees, M. 2007. Alternative splicing in cancer: Noise, functional, or
systematic?.The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 39:1432–1449.
[32]. Lixia, M., Zhijian, C., Chao, S., Chaojiang, G., Congyi, Z. 2007. Alternative Splicing of
Breast Cancer Associated Gene BRCA1 from Breast Cancer Cell Line. Journal of
Biochemistry and Molecular Biology 40(1):15-21
[33]. Kim, E., Goren, A., Ast, G. 2008. Insights into the connection between cancer and
alternative splicing. Trends Genet. 24(1):7-10.
[34]. Fackenthal, J. D. och Godley, L. A. 2008. Aberrant RNA splicing and its functional
consequences in cancer cells. Dis Model Mech.1(1):37-42.
[35].Jones, P. L., Veenstra, G. J., Wade, P. A., Vermaak, D., Kass, S. U., Landsberger, N.,
Strouboulis, J., Wolffe, A. P. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to
repress transcription. 1998. Nat Genet. 19:187–191.
[36].Nan, X., Ng, H. H., Johnson, C. A., Laherty, C. D., Turner, B. M., Eisenman, R. N., Bird,
A. 1998. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a
histone deacetylase complex. Nature 393:386–389.
[37]. Baylin, S. B., Esteller, M., Rountree, M. R., Bachman, K. E., Schuebel, K., Herman, J.
G. 2001. Aberrant patterns of DNA methylation, chromatin formation and gene expression in
cancer. Hum Mol Genet. 10: 687-692.
[38] Santos, F. och Dean, W. 2004. Epigenetic reprogramming during early development in
mammals. Reproduction 127:643-651
[39]. Miranda, T. B. och Jones, P. A. 2007. DNA Methylation: The Nuts and Bolts of
Repression. J. Cell Physiol. 213(2):384–390.
[40]. Fatemi, M., Pao, M. M., Jeong, S., Gal-Yam, E. N., Egger, G., Weisenberger, D. J.,
Jones, P. A. 2005. Footprinting of mammalian promoters: use of a CpG DNA
methyltransferase revealing nucleosome positions at a single molecule level. Nucleic Acids
Res 33 (20): e176.
[41]. Saxonov, S. och Berg, P., Brutlag, D. L. 2006. A genome-wide analysis of CpG
dinucleotides in the human genome distinguishes two distinct classes of promoters. Proc Natl
Acad Sci USA 103(5): 1412–1417.
[42]. Kurkjian, C., Kummar, S., Murgo, A. J. 2008. DNA Methylation: Its Role in Cancer
Development and Therapy. Curr. Probl. Cancer 32:187–235.
[43]. Rhee, I., Bachman, K. E., Park, B. H., Jair, K. W., Yen, R. W., Schuebel, K. E., Cui, H.,
Feinberg, A. P., Lengauer, C., Kinzler, K. W., Baylin, S. B., Vogelstein, B. 2002. DNMT1
and DNMT3b Cooperate to Silence Genes in Human Cancer Cells. Nature 416: 552–526.
23
[44]. Saito, Y., Kanai, Y., Sakamoto, M., Saito, H., Ishii, H., Hirohashi, S. 2002.
Overexpression of a Splice Variant of DNA Methyltransferase 3b, DNMT3b4, Associated
with DNA Hypomethylation on Pericentromeric Satellite Regions during Human
Hepatocarcinogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: 10060–10065.
[45]. Taberlay, P. C. och Jones, P. A. 2011. DNA Methylation and Cancer. Prog. Drug Res.
67: 1–23.
[46]. Neve, R. M., Chin, K., Fridlyand, J., Yeh, J., Baehner, F. L., Fevr, T., Clark, L., Bayani,
N., Coppe, J. P., Tong, F., Speed, T., Spellman. P. T., DeVries, S., Lapuk, A., Wang, N. J.,
Kuo, W. L., Stilwell, J. L., Pinkel, D., Albertson, D. G., Waldman, F. M., McCormick, F.,
Dickson, R. B., Johnson, M. D., Lippman, M., Ethier, S., Gazdar, A., Gray, J. W. 2006 A
collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes.
Cancer Cell. 10(6):515-27.
[47] Shen, C., Gu, M., Liang, D., Miao, L., Hu, L., Zheng, C., Chen, J. 2009. Establishment
and characterization of three new human breast cancer cell lines derived from Chinese breast
cancer tissues. Cancer Cell Int. 9:2.
[48]. Struewing, J. P., Hartge, P., Wacholder, S., Baker, S. M., Berlin, M., McAdams, M.,
Timmerman, M. M., Brody, L. C., Tucker, M, A. 1997. The Risk of Cancer Associated with
Specific Mutations of BRCA1 and BRCA2 among Ashkenazi Jews. N Engl J Med 336:14011408
[49]. Deng, C. X. och Brodie, S. G. 2000. Roles of BRCA1 and its interacting proteins.
Bioessays. 22(8):728-37.
[50]. Williams, R. S., Green, R., Glover, J. N. 2001. Crystal structure of the BRCT repeat
region from the breast cancer-associated protein BRCA1. Nat Struct Biol. 8(10):838-42.
[51]. Deng, C. X. 2006. BRCA1: cell cycle checkpoint, genetic instability, DNA damage
response and cancer evolution. Nucleic Acids Res.34(5):1416-26.
[52]. Scully, R., Chen, J., Ochs, R. L., Keegan, K., Hoekstra, M., Feunteun, J., Livingston, D.
M. 1997. Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are
initiated by DNA damage Cell. 90(3):425-35.
[53]. Wu, J., Lu, L. Y., Yu, X. 2010. The role of BRCA1 in DNA damage response. Protein
Cell.1(2):117-23.
[54]. Nussenzweig A, et al. 2010. 53BP1 Inhibits Homologous Recombination in Brca1Deficient Cells by Blocking Resection of DNA Breaks. Cell DOI 10.1016.
24
[55]. Cerbinskaite, A., Mukhopadhyay, A., Plummer, E. R., Curtin, N. J., Edmondson, R. J.
2012. Defective homologous recombination in human cancers. Cancer Treat Rev.38(2):89100
[56]. Bau, D. T., Fu, Y. P., Chen, S. T., Cheng, T. C., Yu, J. C., Wu, P. E., Shen, C. Y. 2004.
Breast cancer risk and the DNA double-strand break end-joining capacity of nonhomologous
end-joining genes are affected by BRCA1. Cancer Res.64(14):5013-9.
[57]. Zhong, Q., Boyer, T. G., Chen, P. L., Lee, W. H. 2002. Deficient nonhomologous endjoining activity in cell-free extracts from Brca1-null fibroblasts. Cancer Res. 62: 3966-70
[58]. Zhong, Q., Chen, C. F., Chen, P. L., Lee, W. H. 2002. BRCA1 facilitates
microhomology-mediated end joining of DNA double strand breaks. J Biol Chem, 277:
28641-7.
[59]. Orban, T.I. och Olah, E. 2003 Emerging roles of BRCA1 alternative splicing. Mol
Pathol.56(4):191-7.
[60]. Speevak, M. D., Young, S. S., Feilotter, H., Ainsworth, P. 2003. Alternatively spliced,
truncated human BRCA2 isoforms contain a novel coding exon. Eur J Hum
Genet.11(12):951-4.
[61]. Pettigrew, C. A., Wayte, N., Wronski, A., Lovelock, P.K., Spurdle, A.B., Brown, M. A.
2008. Colocalisation of predicted exonic splicing enhancers in BRCA2 with reported
sequence variants. Breast Cancer Res Treat.110(2):227-34.
[62]. Venkitaraman, A. R. 2001. Chromosome stability, DNA recombination and the BRCA2
tumour suppressor. Curr Opin Cell Biol.13(3):338-43.
[63]. Narod, S. A. och Foulkes, W. D. 2004. BRCA1 and BRCA2: 1994 and beyond. Nature
Reviews Cancer pp. 665-676.
[64]. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. 2011. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common
pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12(1):68-78.
[65]. Alter, B. P. och Kupfer, G. Fanconi Anemia. 2002 [Updated 2011 Nov 3]. In: Pagon, R.
A., Bird, T. D., Dolan, C. R., et al., editors. GeneReviews™ [Internet]. Seattle (WA):
University of Washington, Seattle; 1993-.
[66]. Sy, S. M., Huen, M. S., Chen, J. PALB2 is an integral component of the BRCA complex
required for homologous recombination repair. 2009. Proc. Natl Acad. Sci. USA 106:7155–
7160.
[67]. Zhang, F., Fan, Q., Ren, K., Andreassen, P. R. 2009. PALB2 functionally connects the
breast cancer susceptibility proteins BRCA1 and BRCA2. Mol. Cancer Res. 7:1110–1118.
[68]. Zhang, F., Ma, J., Wu, J., Ye, L., Cai, H., Xia, B., Yu, X. 2009. PALB2 links BRCA1
and BRCA2 in the DNA-damage response. Curr. Biol. 19(6):524–529.
25
[69]. Bryant, H. E., Schultz, N., Thomas, H. D., Parker, K. M., Flower, D., Lopez, E., Kyle,
S., Meuth, M., Curtin, N. J., Helleday, T. 2005. Specific killing of BRCA2-deficient tumours
with inhibitors of poly (ADP-ribose) polymerase. Nature.434:913–917.
[70]. Farmer, H., McCabe, N., Lord, C. J., Tutt, A. N., Johnson, D. A., Richardson, T. B.,
Santarosa, M., Dillon, K. J., Hickson, I., Knights, C., Martin, N. M., Jackson, S. P., Smith, G.
C., Ashworth, A. 2005. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a
therapeutic strategy. Nature. 434:917–921.
[71]. Bouchard, V. J., Rouleau, M., Poirier, G. G. 2003. PARP-1, a determinant of cell
survival in response to DNA damage. Exp Hematol. 31:446–454.
[72].Curtin, N. J. 2005. ARP inhibitors for cancer therapy. Expert Rev Mol Med. 7:1–20.
[73]. Fong, P. C., Boss, D. S., Yap, T. A., Tutt, A., Wu, P., Mergui-Roelvink, M., Mortimer,
P., Swaisland, H., Lau, A., O'Connor, M. J., Ashworth, A., Carmichael, J., Kaye, S. B.,
Schellens, J. H., de Bono, J. S. 2009. Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase in tumors
from BRCA mutation carriers. N Engl J Med. 361(2):123-34.
[74]. Bolderson, E., Richard, D. J., Zhou, B. B., Khanna, K. K. 2009. Recent advances in
cancer therapy targeting proteins involved in DNA double-strand break repair. Clin Cancer
Res.15:6314–6320.
[75]. Kaelin, W. G. Jr. 2005. The concept of synthetic lethality in the context of anticancer
therapy. Nat Rev Cancer. 5(9):689-98.
[76]. Soule, H. D., Vazquez, J., Long, A., Albert, S., Brennan, M. 1973. A human cell line
from a pleural effusion derived from a breast carcinoma. Journal of the National Cancer
Institute. 51(5): 1409–1416.
[77]. Fackenthal, J. D., Cartegni, L., Krainer, A. R., Olopade, O. I. 2002. BRCA2 T2722R is
a deleterious allele that causes exon skipping. American Journal of Human Genetics, pp. 625631.
[78]. Pettigrew, C. A., Wayte, N., Wronski, A., Lovelock, P. K, Spurdle, A. B., Brown, M. A.
2008. Colocalisation of Predicted Exonic Splicing Enhancers in BRCA2 with Reported
Sequence Variants. Breast Cancer Research and Treatment, pp. 227-234.
[79]. Neuhausen, S. L. 2000. Founder populations and their uses for breast cancer genetics.
Breast Cancer Res. 2(2): 77–81.
[80]. Ravindra, T., Lakshmi, N. K., Chaitanya, K., Surender, V., Ahuja, Y. R. 2006. Clinical
relevance of alternative splicing. Indian Journal of Human Genetics 12(2).
[81]. Kurreck, J. 2003. Antisense technologies- Improvement through chemical modifications.
Eur J Biochem 270:1628-44.
26
[82]. Bracco L., Kearsey J. 2003. The relevance of alternative RNA splicing to
pharmacogenomics Trends in Biotechnology, 21 (8) , pp. 346-353.
[83]. BIC (Breast Cancer Information Core)[Elektronisk]. Tillgänglig:
<http://research.nhgri.nih.gov/bic/>.
.
.
.
27
