Molekylärgenetisk diagnostik av akut bakteriell meningit

Molekylärgenetisk diagnostik av
akut bakteriell meningit
Paula Mölling, PhD Molekylärbiolog
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Bakteriell meningit – hjärnhinneinflammation
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Neonatal (<1mån)
GrB strep, E. coli, L. mono
Bakteriell meningit - etiologi
Barn/ungdomar (<15år)
N. men, S. pne
Vuxna (>15år)
N. men, S. pne, Staphylococcus
Holland, 2008
Mikrobiologen Örebro
(HiB och MenC vaccination)
S.aur
Övr
L.mono
L.mono
Övr
GrpB strep
S.pne
E.coli
N.men
H.inflHi
GrpB strep
S.pne
Hi
GrpB strep
E.coli
L.mono
S.aur
Övr
N.men
N.men
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
S.pne
Från patient till provsvar…
Misstänkt meningit
Ingen växt
PCR
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Mc
Hi
S. pne
S. agal (GBS)
L.mono
16S
Detektion av universella (U) och variabla (V)
species specifika regioner i 16S rRNA genen
V1 V2
U1
1 bp
U2
V6
V7 V8
V3 V4 V9
V5
U3 U4 U5
U6 U7
U8
500 bp
1000 bp
1500 bp
Steg 1 + UV
Alla bakterier
S. pne
Steg 2
Mc
H. infl
S. aga
Alla streptokocker
Listeria monocytogenes
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
MW
VIII Prov 1 1+GBS Prov 2
2+GBS
+K
Provart:
Likvor, blod, ledvätska,
pleuravätska mm.
2 1:10
2 1:10
+K
-K
+GBS
Steg 1:
Bakterier= 1030 bp;
Steg 2a: Mc
Hi
Strep
= 710 bp
= 540 bp
= 300 bp
Steg 2b: Pne
S. aga
L. mon
= 937 bp
= 544 bp
= 265 bp
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
200 µL CSF
Kromosomal DNA
preparation
RealtidsPCR:
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Streptococcus agalactiae (GBS)
Listeria monocytogenes
Neisseria meningitidis
16S rRNA genen (U2-U3 )för ev. vidare
sekvensering
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Material
Isolat av MC, HI, SP, GBS, LM
n=327
Andra kliniska isolat
n=89
Kliniska prover
n=185
Neisseria arter, Moraxella catarrhalis, H. parainf,
P. multocida, legionella, Strept arter, enterokocker,
S. aureus, S. haemolyticus, Salmonella, E. coli
odlings neg (50*+33**), odlings pos (20), konsekutiva (82)
*tidigare labverifierade från 1999-2007
** tidigare ej labverifierade
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Metod
DNA preparation
MagNaPure Compact: Mutanolysin + MagNA Pure Bacteria Lysis Buffer
(BLB), MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I
LightCycler PCR (ett och samma PCR program)
MC
SP
HI
GBS
LM
16S
ctrA
lytA
P6
cfb
hly
U2-(V6)-U3
- capsular transport
- autolysin
– outer membrane protein 6
- CAMP factor
- hemolysin listeriolysin
- universell/variabel region
Duplex (Hybridiserings prober LC 640/705)
SP/HI resp GBS/LM
Simplex (Hydrolys prober FAM 530)
MC resp 16S
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Resultat detektionsnivå:
Neisseria meningitidis
1 bakterie genom
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Streptococcus pneumoniae
1 bakterie genom
Haemophilus influenzae
<10 bakterie genom
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Streptococcus agalactiae (GBS)
<10 bakterie genom
Listeria monocytogenes
<10 bakterie genom
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
16S rRNA
Neg
10 bakterier
DNA sekvensering av 16S rRNA kunde identifiera MC,
HI, SP, GBS, LM med en tiopotens lägre känslighet
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
forts. Resultat
MC
HI
SP
GBS
LM
106*/107
84/84
99/99
23/23
14/14
Tre H. parainfluenzae gav falskt positiva resultat
med P6 (HI) – dock med höga CP!
*Det falskt negativa isolatet: 1 MC - utan kapsel
Kan identifieras med sekvenseringen av genen för 16S rRNA!!!!
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
forts. Resultat
Kliniska prover
n=185
odlings neg (50*+33)
*MC (n=16), SP (n=15), HI (n=1), GBS (n=2), LM (n=1)
konsekutiva (82)
MC (n=4), SP (n=8), HI (n=2), GBS (n=1), LM (n=1)
odlings pos (20): Culture results (no. of isolates)
N. meningitidis (3)
S. pneumoniae (7)
H. influenzae (1)
S. agalatiae (2)
Other bacteria (7), i.e. E. coli (1), S. aureus (1),
CoNSa (1), unspecified staphylococci (2),
Neisseria spp (1), unspecified streptococci (1)
PCR results
3/3 ctrA+
7/7 lytA+
1/1 p6+
2/2 cfb+
1 E. colib, 1 unspecified staphylococcib
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Exempel från några rutinkörningar…
Inhibition? Spikning av prover
+ kontroll
Spikade
prover
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Förekomst av bakteriellt DNA? 16S rRNA-genen
Patientprov 2
ej sekv.
Patientprov 1
sekv.
+ kontroll
- kontroller
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Positiv för Neisseria meningitidis !!!
Patientprov Mc+
Positiv
kontroll Mc
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Meningokocker kan orsaka epidemier – Är
sjukdomsfallen kopplade? Typning!
Pilu
s
Kapsel – sero/genogrupp
LOS
CPS
fHb
p
OM
Rmp
Rmp
PG
protei
n
PBP
2
IMB
Porin B – serotyp
Porin A - genosubtyp
För utförligare
utbrottsfrågeställningar
kan även generna
kodande för PorB, PBP2,
FetA, fHbp och
studeras samt PFGE och
MLST
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Metoder:
Genetisk identifiering, gruppering och subtypning
DNA preparation
LightCycler PCR
I*
SP
HI
GBS MC 16S
LM
II*
A
Y
C
III
B
W-135
VR1 VR2,3
Kapselgener
porA
* Endast på odlingsnegativa prover
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria,
Kliniskt mikrobiologiska kliniken, Universitetssjukhuset Örebro
Mc identifiering
Prober (ctrA)
Mc gruppering
Mc subtypning
SYBR Green
SYBR Green
A
B
C
Y
W-135
H 2O
Cycler
Temperatur (T)
Mc
Mc
H 2O
Temperatur (T)
Sekvensering
Mölling P, et al. J Clin Microbiol. 2002
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
F1
Genosubtypning - porA
F2
VR1
VR2
VR3
R1
R2
…. ACTGTGACTGTT....
PLQNIQPQVTKR
P1.5,2,36-2
Cyklisk
sekvenserings PCR
Kapillär elektrofores
Översättning till aminosyror
(3 baser-1 aminosyra)
Namngivning av VR till genosubtyp
http://neisseria.org/nm/typing/pora/
Mölling P, et al. APMIS 2000; Clarke SC, et al. Vaccine 2003
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Metod: Pulsfält gel elektrofores (PFGE)
Hela genomet
Restriktions enzym (SpeI, NheI)
delar upp genomet
Genom fragmenten
separeras – ”fingeravtryck”
Mölling P, et al. J Clin Microbiol. 2001
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
”Extra” metoder:
Genotypning - porB
porB genen
porB3
porB2
Realtids PCR
SYBRGreen
Internationell databas för Neisseria karaktärisering:
http://neisseria.org/nm/typing/porb/
porB3:7,7,10,12,11,6.
DNA sekvensering
Genotyp
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
…forts ”Extra” metoder: typning – penA
(PBP2 förändringar – nedsatt känslighet mot -laktam antibiotika)
WT
WT2
M1
M2
M3
M4
M5
GEDGAEVVLRDRQGNIVDSLDSPRNKAPKNGKDIILSLDQRIQTLAYEELNKAVEYHQAKAGTVVVLDARTGEILALANTPAYDPNRPGRADSEQRRNRA
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.....K.....NK............SV....Q.M.............D......A..K....A......Q.......V.S......Q..Q.N........
AGE.........E...............Q................................................V.....E..K..Q..........
WT
WT2
M1
M2
M3
M4
M5
VTDMIEPGSAIKPFVIAKALDAGKTDLNERLNTQPYKIGPSPVRDTHVYPSLDVRGIMQKSSNVGTSKLSARFGAEEMYDFYHELGIGVRMHSGFPGETA
....................................................................................................
....................................................................................................
........................................AQ............H..................SSK....L.................S.
....................................................................................................
..........M...T......S..V.ATDTF..L......AT.Q......T....................M.TPK.......D..V.............
......................D..N..............AQ...............................SSK....L.................S.
464
469 472
WT
WT2
M1
M2
M3
M4
M5
WT
WT2
M1
M2
M3
M4
M5
Sekvensering
Neisseria meningitidis penA database:
http://neisseria.org/perl/agdbnet/
penA-allel 22, WT
(n=32)
(n=1)
(n=38)
(n=1)
(n=16)
(n=1)
(n=1)
GLLRNWRRWRPIEQATMSFGYGLQLSLLQLARAYTALTHDGVLLPVSFEKQAVAPQGKRIFKESTAREVRNLMVSVTEPGGTGTAGAVDGFDVGAKTGTA
....................................................................................................
.......................................................K...VI.A...KK..E.......A.....................
.A....QK...........................V..........................S....Q..E.............................
....................................................................................................
....................................................................................................
.A....QK......................................................A....Q..E.............................
504
510
515
541
549
566
RKFVNGRYADNKHIATFIGFAPAKNPRVIVAVTIDEPTAHGYYGGVVAGPPFKKIMGGSLNILGISPTKPLTA-AAVKTPS* 581
...............................................T.................................* 581
..L.....V....V.........................N.......T................V................* 581
..L.....V........................................................................* 581
..L.....V.Y..V.........................N.......T..V..QV.........V.......NV.......* 582
.................................................................................* 581
501
501
501
501
501
501
501
.................................................................................* 581
Thulin, et al. AAC. 2006
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
…forts ”Extra” metoder: typning - penA
10
20
30
40
50
60
70
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|...
WT1 (n=19)
WT2 (n=25)
WT3 (n=1)
M1 (n=8)
M2 (n=4)
M3 (n=4)
M4 (n=3)
M5 (n=3)
M6 (n=2)
M7 (n=2)
M8 (n=2)
M9 (n=1)
M10 (n=1)
M11 (n=1)
M12 (n=1)
M13 (n=1)
M14 (n=1)
Pyrosekvensering
WT1 (n=19)
WT2 (n=25)
WT3 (n=1)
M1 (n=8)
M2 (n=4)
M3 (n=4)
M4 (n=3)
M5 (n=3)
M6 (n=2)
M7 (n=2)
M8 (n=2)
M9 (n=1)
M10 (n=1)
M11 (n=1)
M12 (n=1)
M13 (n=1)
M14 (n=1)
GTGCGGTGGACGGTTTCGATGTCGGCGCGAAAACCGGCACGGCGCGCAAGTTCGTCAACGGGCGTTATGCCGACAACA
..............................................................................
..............................................................................
....T.....T........C..A..T..A........T........T..AC.G.....T..T..C....TG.......
.......A..T........C........A........T........T.....G..T.....T.....C.T...TT...
..............................................T.....G..T.....T.....C.T...TT...
....T.....T.................A........T........T.....G..T.....A..A..C.T...T....
....T.....T........C..A..T...........T........T..AC.G..T..T..C..C....TG.......
.C..........................A........T........T.....G..T.....A..A..C.T...TT...
.C..................................................G..T.....T.....C.T...TT...
.......A..T........C........A........T........T.....G..............C.T...T....
....T.....T........C..A..T...........T........T.....G..T.....T.....C.T...T....
.......T.............................T........T.....G..T.....T.....C.T...TT...
..............................................T.....G..T.....A..A..C.T...TT...
.......A..T........C........A........T........T.....G..T.....A..A..C.T...T....
.......A..T........C..A..T...........T..T.....T..AC.G.....T..T.......TG.......
....C.....T........C..A..T...........T........T..AC.G.....T..C..C....TG.......
110
120
130
140
....|....|....|....|....|....|....|....|.
TTTTGCCCCCGCCAAAAATCCCCGTGTGATTGTGGCGGTAA
..................C......................
..................C......................
.........................................
.........G..T........G...................
.........G..T........G...................
.........G...............................
.........G..T........G...................
.........G..T........G...................
.........G..T........G...................
........................C................
......A..T..T..G.....G...................
.........G..T........G...................
......T..T...........G...................
..................C......................
........................C................
.........................................
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
…forts ”Extra” metoder:
typning avfHbp och fetA
PCR
Sekvensering
Internationell databas för Neisseria
karaktärisering:
http://neisseria.org/nm/
•FetA variable region
http://neisseria.org/nm/
•Factor H binding protein
Jacobsson S, et al. Vaccine. 2006
Multi Locus Sequence Typing (MLST):
7 ”housekeeping” gener
DNA preparation
abcZ
aroE
adk
fumC
gdh
pdhC
LightCycler PCR
pgm
….ACTGTGACTGTT....
ST-5
DNA sekvensering
Sequence Type (ST)
http://www.mlst.net/
Jacobsson S, et al.
Scand J Infect Dis. 2008
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Lokala utbrott av Mc bland tonåringar i Sverige
2006, Västerås
Januari:
16 år man – McC, typ T15, subtyp P1.7-2,16-29,35
14 år kvinna
”
April:
17 år kvinna
”
→ Vaccination av alla elever och lärare på 2 skolor
2009, Falun
10/9: 11 år man – McC, typ T2a, subtyp P1.5-1,10-8,36-2
12/9: 18 år man
”
14/9: 19 år man
”
→ Profylaktisk behandling av nära kontakter, ingen
vaccinering
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Invasive meningococcal disease in Sweden
1970-2009
No. of cases
Incidence
300
3
250
200
2
150
100
1
50
20
00
0
19
70
0
Antal fall
Year
Incidens/100 000/år
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Tabell IV
2000
2001
2002
2003 2004
2005
2006
Totalt antal MC-isolat
(ett per patient)
102
116
83
74
MC från blod/likvor
44
58
36
MC från luftvägar
56
55
MC från genitaltrakt
1
Andra invasiva MC
2007 2008 2009
73
70
75
81
76
79
41
47
48
44
43
38
45
43
27
24
19
28
34
35
24
2
3
4
0
1
3
3
2
9
1
1
1
2
2
2
0
1
1
1
A
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
B
23
33
20
27
24
25
21
16
14
16
C
15
14
10
11
11
15
15
15
16
10
Y
1
8
4
2
6
4
5
9
7
16
W-135
5
2
1
1
5
1
2
2
1
1
annan
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
ingen grupp
0
0
1
0
1
2
1
1
0
1
MC från CSF/blod
serogrupp
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria,
Kliniskt mikrobiologiska kliniken, Universitetssjukhuset Örebro
PCR resultat på odlingsnegativa prover:
2007
90 PCR-analyserade odlingsnegativa likvor: 6 Mc, 5 Pne, 2 Lm positiva.
2008
90 PCR-analyserade odlingsnegativa likvor: 5 Mc, 6 Pne, 2 Lm positiva
2009
89 PCR-analyserade odlingsnegativa likvor: 18 Mc, 1 Pne, 1 HI, 2 LM positiva
(6 ledvätska, 15 DNA preparationer och resten likvor)
OBS! Lab som skickar DNA preparation för MC gruppering/subtypning skicka istället
likvorprov (gärna mer än 200 µL annars det ni har) pga att alla reningskit är ej kompatibla
med den PCR vi kör med Roche LightCycler SYBR Green kit.
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria,
Kliniskt mikrobiologiska kliniken, Universitetssjukhuset Örebro
Konklusion: varför använda genetisk
karaktärisering?
Snabb diagnos
Vägledning av antibiotikabehandling
Diagnostisera odlingsnegativa prover
Under utveckling
16S optimering!!
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
Tack för mig!!!
Medverkande Bakteriell meningit:
Prof. Per Olcén
Doc. Hans Fredlund Sara Thulin Hedberg, PhD
För MC typningen även:
Magnus Unemo, Susanne Jacobsson, Emma Johansson, Ronza Hadad
Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria
Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro