Molekylärgenetisk diagnostik av akut bakteriell meningit Paula Mölling, PhD Molekylärbiolog Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Bakteriell meningit – hjärnhinneinflammation Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Neonatal (<1mån) GrB strep, E. coli, L. mono Bakteriell meningit - etiologi Barn/ungdomar (<15år) N. men, S. pne Vuxna (>15år) N. men, S. pne, Staphylococcus Holland, 2008 Mikrobiologen Örebro (HiB och MenC vaccination) S.aur Övr L.mono L.mono Övr GrpB strep S.pne E.coli N.men H.inflHi GrpB strep S.pne Hi GrpB strep E.coli L.mono S.aur Övr N.men N.men Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro S.pne Från patient till provsvar… Misstänkt meningit Ingen växt PCR Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Mc Hi S. pne S. agal (GBS) L.mono 16S Detektion av universella (U) och variabla (V) species specifika regioner i 16S rRNA genen V1 V2 U1 1 bp U2 V6 V7 V8 V3 V4 V9 V5 U3 U4 U5 U6 U7 U8 500 bp 1000 bp 1500 bp Steg 1 + UV Alla bakterier S. pne Steg 2 Mc H. infl S. aga Alla streptokocker Listeria monocytogenes Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro MW VIII Prov 1 1+GBS Prov 2 2+GBS +K Provart: Likvor, blod, ledvätska, pleuravätska mm. 2 1:10 2 1:10 +K -K +GBS Steg 1: Bakterier= 1030 bp; Steg 2a: Mc Hi Strep = 710 bp = 540 bp = 300 bp Steg 2b: Pne S. aga L. mon = 937 bp = 544 bp = 265 bp Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro 200 µL CSF Kromosomal DNA preparation RealtidsPCR: Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Streptococcus agalactiae (GBS) Listeria monocytogenes Neisseria meningitidis 16S rRNA genen (U2-U3 )för ev. vidare sekvensering Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Material Isolat av MC, HI, SP, GBS, LM n=327 Andra kliniska isolat n=89 Kliniska prover n=185 Neisseria arter, Moraxella catarrhalis, H. parainf, P. multocida, legionella, Strept arter, enterokocker, S. aureus, S. haemolyticus, Salmonella, E. coli odlings neg (50*+33**), odlings pos (20), konsekutiva (82) *tidigare labverifierade från 1999-2007 ** tidigare ej labverifierade Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Metod DNA preparation MagNaPure Compact: Mutanolysin + MagNA Pure Bacteria Lysis Buffer (BLB), MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I LightCycler PCR (ett och samma PCR program) MC SP HI GBS LM 16S ctrA lytA P6 cfb hly U2-(V6)-U3 - capsular transport - autolysin – outer membrane protein 6 - CAMP factor - hemolysin listeriolysin - universell/variabel region Duplex (Hybridiserings prober LC 640/705) SP/HI resp GBS/LM Simplex (Hydrolys prober FAM 530) MC resp 16S Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Resultat detektionsnivå: Neisseria meningitidis 1 bakterie genom Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Streptococcus pneumoniae 1 bakterie genom Haemophilus influenzae <10 bakterie genom Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Streptococcus agalactiae (GBS) <10 bakterie genom Listeria monocytogenes <10 bakterie genom Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro 16S rRNA Neg 10 bakterier DNA sekvensering av 16S rRNA kunde identifiera MC, HI, SP, GBS, LM med en tiopotens lägre känslighet Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro forts. Resultat MC HI SP GBS LM 106*/107 84/84 99/99 23/23 14/14 Tre H. parainfluenzae gav falskt positiva resultat med P6 (HI) – dock med höga CP! *Det falskt negativa isolatet: 1 MC - utan kapsel Kan identifieras med sekvenseringen av genen för 16S rRNA!!!! Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro forts. Resultat Kliniska prover n=185 odlings neg (50*+33) *MC (n=16), SP (n=15), HI (n=1), GBS (n=2), LM (n=1) konsekutiva (82) MC (n=4), SP (n=8), HI (n=2), GBS (n=1), LM (n=1) odlings pos (20): Culture results (no. of isolates) N. meningitidis (3) S. pneumoniae (7) H. influenzae (1) S. agalatiae (2) Other bacteria (7), i.e. E. coli (1), S. aureus (1), CoNSa (1), unspecified staphylococci (2), Neisseria spp (1), unspecified streptococci (1) PCR results 3/3 ctrA+ 7/7 lytA+ 1/1 p6+ 2/2 cfb+ 1 E. colib, 1 unspecified staphylococcib Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Exempel från några rutinkörningar… Inhibition? Spikning av prover + kontroll Spikade prover Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Förekomst av bakteriellt DNA? 16S rRNA-genen Patientprov 2 ej sekv. Patientprov 1 sekv. + kontroll - kontroller Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Positiv för Neisseria meningitidis !!! Patientprov Mc+ Positiv kontroll Mc Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Meningokocker kan orsaka epidemier – Är sjukdomsfallen kopplade? Typning! Pilu s Kapsel – sero/genogrupp LOS CPS fHb p OM Rmp Rmp PG protei n PBP 2 IMB Porin B – serotyp Porin A - genosubtyp För utförligare utbrottsfrågeställningar kan även generna kodande för PorB, PBP2, FetA, fHbp och studeras samt PFGE och MLST Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Metoder: Genetisk identifiering, gruppering och subtypning DNA preparation LightCycler PCR I* SP HI GBS MC 16S LM II* A Y C III B W-135 VR1 VR2,3 Kapselgener porA * Endast på odlingsnegativa prover Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria, Kliniskt mikrobiologiska kliniken, Universitetssjukhuset Örebro Mc identifiering Prober (ctrA) Mc gruppering Mc subtypning SYBR Green SYBR Green A B C Y W-135 H 2O Cycler Temperatur (T) Mc Mc H 2O Temperatur (T) Sekvensering Mölling P, et al. J Clin Microbiol. 2002 Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro F1 Genosubtypning - porA F2 VR1 VR2 VR3 R1 R2 …. ACTGTGACTGTT.... PLQNIQPQVTKR P1.5,2,36-2 Cyklisk sekvenserings PCR Kapillär elektrofores Översättning till aminosyror (3 baser-1 aminosyra) Namngivning av VR till genosubtyp http://neisseria.org/nm/typing/pora/ Mölling P, et al. APMIS 2000; Clarke SC, et al. Vaccine 2003 Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Metod: Pulsfält gel elektrofores (PFGE) Hela genomet Restriktions enzym (SpeI, NheI) delar upp genomet Genom fragmenten separeras – ”fingeravtryck” Mölling P, et al. J Clin Microbiol. 2001 Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro ”Extra” metoder: Genotypning - porB porB genen porB3 porB2 Realtids PCR SYBRGreen Internationell databas för Neisseria karaktärisering: http://neisseria.org/nm/typing/porb/ porB3:7,7,10,12,11,6. DNA sekvensering Genotyp Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro …forts ”Extra” metoder: typning – penA (PBP2 förändringar – nedsatt känslighet mot -laktam antibiotika) WT WT2 M1 M2 M3 M4 M5 GEDGAEVVLRDRQGNIVDSLDSPRNKAPKNGKDIILSLDQRIQTLAYEELNKAVEYHQAKAGTVVVLDARTGEILALANTPAYDPNRPGRADSEQRRNRA .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .....K.....NK............SV....Q.M.............D......A..K....A......Q.......V.S......Q..Q.N........ AGE.........E...............Q................................................V.....E..K..Q.......... WT WT2 M1 M2 M3 M4 M5 VTDMIEPGSAIKPFVIAKALDAGKTDLNERLNTQPYKIGPSPVRDTHVYPSLDVRGIMQKSSNVGTSKLSARFGAEEMYDFYHELGIGVRMHSGFPGETA .................................................................................................... .................................................................................................... ........................................AQ............H..................SSK....L.................S. .................................................................................................... ..........M...T......S..V.ATDTF..L......AT.Q......T....................M.TPK.......D..V............. ......................D..N..............AQ...............................SSK....L.................S. 464 469 472 WT WT2 M1 M2 M3 M4 M5 WT WT2 M1 M2 M3 M4 M5 Sekvensering Neisseria meningitidis penA database: http://neisseria.org/perl/agdbnet/ penA-allel 22, WT (n=32) (n=1) (n=38) (n=1) (n=16) (n=1) (n=1) GLLRNWRRWRPIEQATMSFGYGLQLSLLQLARAYTALTHDGVLLPVSFEKQAVAPQGKRIFKESTAREVRNLMVSVTEPGGTGTAGAVDGFDVGAKTGTA .................................................................................................... .......................................................K...VI.A...KK..E.......A..................... .A....QK...........................V..........................S....Q..E............................. .................................................................................................... .................................................................................................... .A....QK......................................................A....Q..E............................. 504 510 515 541 549 566 RKFVNGRYADNKHIATFIGFAPAKNPRVIVAVTIDEPTAHGYYGGVVAGPPFKKIMGGSLNILGISPTKPLTA-AAVKTPS* 581 ...............................................T.................................* 581 ..L.....V....V.........................N.......T................V................* 581 ..L.....V........................................................................* 581 ..L.....V.Y..V.........................N.......T..V..QV.........V.......NV.......* 582 .................................................................................* 581 501 501 501 501 501 501 501 .................................................................................* 581 Thulin, et al. AAC. 2006 Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro …forts ”Extra” metoder: typning - penA 10 20 30 40 50 60 70 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|... WT1 (n=19) WT2 (n=25) WT3 (n=1) M1 (n=8) M2 (n=4) M3 (n=4) M4 (n=3) M5 (n=3) M6 (n=2) M7 (n=2) M8 (n=2) M9 (n=1) M10 (n=1) M11 (n=1) M12 (n=1) M13 (n=1) M14 (n=1) Pyrosekvensering WT1 (n=19) WT2 (n=25) WT3 (n=1) M1 (n=8) M2 (n=4) M3 (n=4) M4 (n=3) M5 (n=3) M6 (n=2) M7 (n=2) M8 (n=2) M9 (n=1) M10 (n=1) M11 (n=1) M12 (n=1) M13 (n=1) M14 (n=1) GTGCGGTGGACGGTTTCGATGTCGGCGCGAAAACCGGCACGGCGCGCAAGTTCGTCAACGGGCGTTATGCCGACAACA .............................................................................. .............................................................................. ....T.....T........C..A..T..A........T........T..AC.G.....T..T..C....TG....... .......A..T........C........A........T........T.....G..T.....T.....C.T...TT... ..............................................T.....G..T.....T.....C.T...TT... ....T.....T.................A........T........T.....G..T.....A..A..C.T...T.... ....T.....T........C..A..T...........T........T..AC.G..T..T..C..C....TG....... .C..........................A........T........T.....G..T.....A..A..C.T...TT... .C..................................................G..T.....T.....C.T...TT... .......A..T........C........A........T........T.....G..............C.T...T.... ....T.....T........C..A..T...........T........T.....G..T.....T.....C.T...T.... .......T.............................T........T.....G..T.....T.....C.T...TT... ..............................................T.....G..T.....A..A..C.T...TT... .......A..T........C........A........T........T.....G..T.....A..A..C.T...T.... .......A..T........C..A..T...........T..T.....T..AC.G.....T..T.......TG....... ....C.....T........C..A..T...........T........T..AC.G.....T..C..C....TG....... 110 120 130 140 ....|....|....|....|....|....|....|....|. TTTTGCCCCCGCCAAAAATCCCCGTGTGATTGTGGCGGTAA ..................C...................... ..................C...................... ......................................... .........G..T........G................... .........G..T........G................... .........G............................... .........G..T........G................... .........G..T........G................... .........G..T........G................... ........................C................ ......A..T..T..G.....G................... .........G..T........G................... ......T..T...........G................... ..................C...................... ........................C................ ......................................... Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro …forts ”Extra” metoder: typning avfHbp och fetA PCR Sekvensering Internationell databas för Neisseria karaktärisering: http://neisseria.org/nm/ •FetA variable region http://neisseria.org/nm/ •Factor H binding protein Jacobsson S, et al. Vaccine. 2006 Multi Locus Sequence Typing (MLST): 7 ”housekeeping” gener DNA preparation abcZ aroE adk fumC gdh pdhC LightCycler PCR pgm ….ACTGTGACTGTT.... ST-5 DNA sekvensering Sequence Type (ST) http://www.mlst.net/ Jacobsson S, et al. Scand J Infect Dis. 2008 Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Lokala utbrott av Mc bland tonåringar i Sverige 2006, Västerås Januari: 16 år man – McC, typ T15, subtyp P1.7-2,16-29,35 14 år kvinna ” April: 17 år kvinna ” → Vaccination av alla elever och lärare på 2 skolor 2009, Falun 10/9: 11 år man – McC, typ T2a, subtyp P1.5-1,10-8,36-2 12/9: 18 år man ” 14/9: 19 år man ” → Profylaktisk behandling av nära kontakter, ingen vaccinering Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Invasive meningococcal disease in Sweden 1970-2009 No. of cases Incidence 300 3 250 200 2 150 100 1 50 20 00 0 19 70 0 Antal fall Year Incidens/100 000/år Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Tabell IV 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Totalt antal MC-isolat (ett per patient) 102 116 83 74 MC från blod/likvor 44 58 36 MC från luftvägar 56 55 MC från genitaltrakt 1 Andra invasiva MC 2007 2008 2009 73 70 75 81 76 79 41 47 48 44 43 38 45 43 27 24 19 28 34 35 24 2 3 4 0 1 3 3 2 9 1 1 1 2 2 2 0 1 1 1 A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B 23 33 20 27 24 25 21 16 14 16 C 15 14 10 11 11 15 15 15 16 10 Y 1 8 4 2 6 4 5 9 7 16 W-135 5 2 1 1 5 1 2 2 1 1 annan 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 ingen grupp 0 0 1 0 1 2 1 1 0 1 MC från CSF/blod serogrupp Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria, Kliniskt mikrobiologiska kliniken, Universitetssjukhuset Örebro PCR resultat på odlingsnegativa prover: 2007 90 PCR-analyserade odlingsnegativa likvor: 6 Mc, 5 Pne, 2 Lm positiva. 2008 90 PCR-analyserade odlingsnegativa likvor: 5 Mc, 6 Pne, 2 Lm positiva 2009 89 PCR-analyserade odlingsnegativa likvor: 18 Mc, 1 Pne, 1 HI, 2 LM positiva (6 ledvätska, 15 DNA preparationer och resten likvor) OBS! Lab som skickar DNA preparation för MC gruppering/subtypning skicka istället likvorprov (gärna mer än 200 µL annars det ni har) pga att alla reningskit är ej kompatibla med den PCR vi kör med Roche LightCycler SYBR Green kit. Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria, Kliniskt mikrobiologiska kliniken, Universitetssjukhuset Örebro Konklusion: varför använda genetisk karaktärisering? Snabb diagnos Vägledning av antibiotikabehandling Diagnostisera odlingsnegativa prover Under utveckling 16S optimering!! Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro Tack för mig!!! Medverkande Bakteriell meningit: Prof. Per Olcén Doc. Hans Fredlund Sara Thulin Hedberg, PhD För MC typningen även: Magnus Unemo, Susanne Jacobsson, Emma Johansson, Ronza Hadad Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria Laboratoriemedicinska kliniken, Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro