Mekanismer för kinolonresistens hos
Neisseria gonhorroeae
Examensarbete i mikrobiologi, 20 p
2002
Camilla Lang
Institutionen för biologisk grundutbildning, Stockholms Universitet
Handledare:
Bengt Wretlind, professor
Emma Lindbäck, ST-läkare
Kerstin Bergman, Biomedicinsk analytiker
Karolinska Institutet, Huddinge Universitetssjukhus
Abstract
Antibiotic resistance in gonococci is an increasing problem in the treatment of gonorrhea.
Ciprofloxacin is the recommended drug to use, however, resistance has developed especially
in Asia. The main mechanism for resistance is mutations in the genes encoding the target
enzymes, DNA gyrase (gyrA) and topoisomerase IV (parC). However, these mutations are not
enough to give the high levels of resistance observed in many strains. To investigate if an
efflux pump that actively exports ciprofloxacin out of the cell is the explanation, two
transformations were made. DNA from two resistant strains were inserted in a susceptible
strain, the quinolone resistance determining region of the transformants were sequenced and
the levels of resistance tested with Etests. The gyrA mutations were found in all transformants,
but the resistance levels were considerably lower than in the donor strains, showing the
importance of an additional mechanism. Gel electrophoresis was used to search for proteins
with the size of bacterial outer membrane proteins, and the intracellular concentration of
ciprofloxacin, with and without an efflux inhibitor, was measured. The results could neither
prove nor exclude the presence of an efflux pump. However, the methods used need to be
optimized to suit gonococci and to be repeated in order to give reliable results.
2
Förkortningar
ATP
BHI
CCCP
cfu
far
MATE
MFP
MFS
MIC
mtr
QRDR
RND
SMP
TSB
Adenosintrifosfat
Brain heart infusion broth
Carbonylcyanid m-klorofenylhydrazon
Colony forming unit
Fatty acid resistance
Multidrug and toxic compound extrusion
Membrane fusion protein
Major faciliator superfamiljen
Mininum inhibitory concentration
Multiple transferable resistance
Quinolone resistance determining region
Resistance nodualtion division
Small multidrug resistance protein
tryptic soy broth
3
Inledning
Neisseria gonorrhoeae
Familjen Neisseriaceae består av släktena Neisseria, Branhamella, Moraxella, Kingella och
Acinetobacter (1). Släktet Neisseria omfattar bl a N. lactamica, N. sicca, N. cinerea, N.
subflava, N. flavescens och N. mucosa som är icke-patogena och ingår i normalfloran i
slemhinnorna i nasofarynx hos människa samt N. gonorrhoeae och N. meningitidis som
betraktas som humanpatogener (1, 2).
Neisseria gonorrhoeae (gonokocker) är 0,6-1,5 μm stora, kaffebönsformade gramnegativa
bakterier som ofta förekommer som diplokocker (1, 3, 4, 5). De påvisades för första gången
med mikroskopets hjälp av Albert Neisser år 1879 i varceller från en patient med gonorré (2).
N. gonorrhoeae är strikta parasiter som tillverkar indofenoloxidas och katalas, är icke
sporbildande samt saknar rörlighet (4) och kapsel. De kräver också CO2-haltig miljö för sin
initiala tillväxt (2, 5). N. gonorrhoeae är enbart humana patogener som inte kan överleva
längre perioder utanför den mänskliga värden, förutom under laboratorieförhållanden (1, 2, 3,
6).
Gonorré
Gonorré är en sexuellt överförbar sjukdom som har funnits i tusentals år (2, 6). Det är den näst
vanligaste könssjukdomen efter klamydia och drabbar framför allt människor med frekventa
partnerbyten (1).
Inkubationstiden är 2-6 dagar och symptomen skiljer sig mellan män och kvinnor. Hos
kvinnor involverar infektionen vanligen uretra och cervix, men kan även spridas till
äggledarna och orsaka salpingit, i värsta fall med sterilitet som följd (2, 4). I många fall är
symptomen milda och svåra att skilja från andra infektioner. Ofta upptäcks inte ens
infektionen. (1, 3, 4). I sällsynta fall kan dock spridning till blodet ske, med eventuell artrit
som följd (4). Hos män uppstår ofta en smärtsam infektion i urinröret med påföljande flytning
(1, 3, 4). Vanligtvis är sjukdomen begränsad till uretra, men spridning till prostata och
epididymis kan förekomma (2, 4).
Gonokocker kan förutom gonorré också ge upphov till ophtalamia neonatorum,
ögoninfektioner hos nyfödda (1, 2, 3). Barn som föds av gonorrésmittade mödrar kan få
infektioner under förlossningen (1, 2, 3). Obehandlat kan detta leda till blindhet genom att
kornealepitelet förstörs (2). Credés profylax, d v s instillering av silvernitrat i ögonen på
nyfödda har varit av mycket stor betydelse för att reducera denna sjukdom, som i början av
1900-talet var den vanligaste orsaken till förvärvad blindhet (1, 2). I Sverige upphörde man
med denna profylax 1983 och sedan dess har endast några enstaka fall av ophtalamia
neonatorum rapporterats (2).
Bakterien tar sig in i kroppen via slemhinnorna i genitaltrakten (3) efter att ha blivit överförda
genom samlag. De primära målcellerna är icke-cilierat cylindriskt epitel i genitalslemhinna
och hornhinna. Förutom pili krävs också Protein II och eventuellt lipopolysackarid för
vidhäftning. Mikrokolonier bildas på cellytan och mikrovilli hos värdcellen stimuleras att
4
omsluta enskilda gonokocker som genom endocytos innesluts i en fagolysom. Där sker
förökning och fagolysosomen lägger sig inne i cellen. Där brister dess membran varpå
gonokockerna kan penetrera till underliggande vävnad. Den infekterade cellen exfolieras då,
leukocyter strömmar till och den inflammatoriska reaktionen startar (2).
Trots förekomsten av effektiva behandlingsmetoder är gonokockinfektioner relativt vanliga.
Detta beror dels på att genomgången gonorré inte följs av immunitet, utan upprepade
infektioner är vanliga. Dessutom ger användande av orala preventivmedel förändrade
slemhinnor vilket är till gonokockernas fördel. En tredje anledning är att asymptomatiska
kvinnor och män med frekventa partnerbyten lätt kan föra smittan vidare till många andra
individer (2, 3).
Sverige har en relativt tillförlitlig statistik över gonorré alltsedan 1912, då läkare ålades
skyldighet att anmäla nyupptäckta fall. Första halvåret 2002 raporterades 248 fall, vilket är en
minskning med 13% jämfört med samma period under 2001. Annars har antalet fall stigit
sedan 1997. Fortfarande smittas betydligt fler män än kvinnor (www.smittskyddsinstitutet.se).
I Smittskyddslagen ingår gonorré bland de samhällsfarliga sjukdomarna och måste därför
rapporteras (2).
Behandling av gonorré
Ampicilinderivat har länge använts som ett effektivt förstahandsmedel mot gonorré (4), men
på 1970-talet uppstod gonokockstammar som var resistenta mot penicillin beroende på en
plasmid som kodar för penicillinas (3, 5). Andelen penicillinasproducerande stammar har i
Sverige endast utgjort 1-2% medan siffror på 20-40% rapporterats från Sydostasien, vissa
områden i Afrika samt vissa storstäder i Europa (2). En plasmid som kodar för
tetracyklinresistens har också hittats (5). Därför används idag ofta kinoloner såsom ofloxacin
eller ciprofloxacin i behandlingen mot gonorré (4, 7).
Kinoloners verkningsmekanism
Kinoloner introducerades på 1980-talet (8). De är bredspektrumantibiotika som kan användas
mot en rad olika gram-negativa bakterier (9). De verkar bakteriedödande med två
livsnödvändiga bakteriella enzymer som mål: DNA-gyras och topoisomeras IV. Gyras spelar
flera olika roller i kromosomens funktion. En är att bibehålla en viss nivå av supercoiling,
vilket aktiverar kromosomen för alla reaktioner som involverar separation av de två
strängarna. En annan funktion är att underlätta rörelse av replikations- och
transkriptionskomplex genom DNA genom att införa negativa supercoils framför komplexen.
En ytterligare funktion är att avlägsna knutar på DNA samt att böja och vika DNA. (8).
DNA-gyras binder till DNA som en tetramer där två A- och två B-subenheter vrider DNA i en
positiv supercoil. Dessa två subenheter kodas av generna gyrA och gyrB. Sedan passerar en
region DNA genom en annan genom att DNA klipps upp och sedan sammanfogas igen.
Bindning av ATP till gyras bestämmer riktningen som DNA flyttar sig i, förmodligen genom
konformationsändringar hos gyras (8).
5
Topoisomeras fungerar genom att separera de två dottersträngarna efter replikation och består
liksom gyras av fyra subenheter, två av vardera ParC och ParE. Produkten av den närliggande
genen parF kan eventuellt underlätta DNA-beroende membranbindning av topoisomeras IV.
Likheterna mellan gyras och topopisomeras födde tanken att även topoisomeras kan vara ett
mål för kinoloner. Det har nu visats att så är fallet. Hos vissa arter, såsom E. coli och N.
gonorrhoeae, är kinolonernas främsta målenzym gyras, medan det hos Streptococcus
pneumoniae är topoisomeras IV (8).
Dessa ovan nämnda processer avbryts av kinoloner, som låser enzymerna i en position då
endast halva reaktionen ägt rum, d v s då DNA är sönderklippt men inte sammanfogat igen,
vilket leder till dubbelsträngsbrott på kromosomen och följaktligen bakteriens död. (8).
Först bildas ett kinolon-enzym-DNA-komplex som innehåller uppklippt DNA. Gyras har då
skapat två enkelsträngsbrott på DNA där det virats runt enzymet för att bilda en öppning där
en annan del av DNA kan passera. Efter att DNA har passerat, stängs öppningen och hydrolys
av ATP återställer gyraset och gör det redo för en ny reaktion. Kinolonerna verkar låsa DNAgyras-komplexet efter att DNA klippts upp, men innan det sammanfogats igen. Det verkar
också som om gyras kan återförsluta öppningen i DNA om kinolonerna avlägsnas (8).
Resistens mot fluorokinoloner ökar hos ett antal gramnegativa bakterier, främst hos
Pseudomonas aeruginosa, men hos praktiskt taget alla arter där dessa antibiotika har använts
(3). Flera olika studier har visat att ett samband föreligger mellan mutationer i QRDR
(Quinolone Resistance Determining Region) i generna gyrA respektive parC och resistens mot
fluorokinoloner hos gramnegativa bakterier, inklusive gonokocker. Dessa mutationer
förhindrar alltså kromosombrott till följd av kinolonbehandling (7, 8, 10), men kan inte vara
hela förklaringen till uppkomsten av resistens (7). En annan resistensmekanism kan vara aktiv
efflux (9, 10).
Effluxoumpar som mekanism för antibiotikaresistens har rapporterats hos Burkholderia
cepacia, Campylobacter jejuni, Cotrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica
serovar Typhimurium, Shigella dysentariae, Stenotrophomonas maltophilia, Vibrio
parahaemolyticus och anaeroben Bacteroides fragilis (9). En effluxpump troligen tillhörande
RND-familjen och som transporterar ut ciprofloxacin och oflxacin har hittats hos Serratia
marcescens (10).
Effluxpumpar
Efflux som mekanism för antibiotikaresistens rapporterades för första gången under det tidiga
1980-talet, och gällde tetracyklin. Sedan dess har efflux-medierad resistens mot ett flertal
antibiotika, inklusive fluorokinoloner, rapporterats hos många olika bakteriearter, och ett antal
olika effluxpumpar har hittats och sekvenserats (9).
Bakteriella effluxpumpar kan grupperas in i fyra grupper, främst grundat på deras
aminosyrasekvenshomologi. Dessa är Major Faciliator Superfamiljen (MFS), ATP-binding
casette-familjen, Resistens-Nodulation-Division-familjen (RND) och Small Multidrug
Reistance Protein-familjen (SMP). Nyligen har en femte grupp karakteriserats, nämligen
6
Multidrug and Toxic Compound Extrusion-familjen (MATE). Antibiotikapumpar faller inom
antingen RND-, MFS- eller MATE-familjen
och använder protontransport över
cellmembranet som energikälla för att transportera at antibiotikamolekylerna ur cellen. RNDpumpar finns endast hos gramnegativa bakterier och fungerar oftast tillsammans med ett
periplasmatiskt Membrane Fusion Protien (MFP) och ett yttermembranprotein (9).
Alla Fluoroquinolone Multidrug Resistance (FQ-MDR) -pumpar är kromosomalt kodade och
finns hos både känsliga och resistenta stammar. Resistensen beror oftast på en mutation som
ger uppreglering av uttrycket av effluxgenen. Detta tyder på att FQ-MDR-pumparna är en
viktig del av de gramnegativa bakterierna och fungerar oberoende av antibiotikaefflux och –
resisitens, medan andra effluxpumpar fungerar enbart som antibiotikapumpar och är beroende
av yttre faktorer. I inget av dessa fall är emellertid antibiotika det ursprungliga substratet (9).
Experimentella bevis finns för två funktionella effluxpumpar hos N. gonorrhoeae: mtr
(multiple transferable resistance) och far (fatty acid resistance) (6, 9).
Mtr-systemet karakteriserades första gången 1973 och spelar förmodligen en avgörande roll i
gonokockers gradvisa kromosommedierade resistens mot penicillin (6, 11). Tre mutationer
krävs för dylik resistens: penA, penB och mtr. (6)
Mtr är ett kromosomalt locus som kodar för en effluxpump som använder protontransport
över cellmembranet för att pumpa ut diverse antibakteriella ämnen. Dessa är alla hydrofoba
och inkluderar antibiotika (azithromycin, erythromycin och rifampin), antibakteriella peptider,
gallsalter och steroidhormoner. Effluxpumpen består av tre proteiner: MtrC, MtrD och MtrE
som alla är nödvändiga för effluxaktiviteten, och placeras i gruppen RND (ResistanceNodulation-Division) (6).
MtrD fungerar som transportprotein över plasmamembranet och har troligen kontakt med
MtrC-proteinet i periplasman. MtrC är i sin tur förbundet med MtrE i yttermembranet där det
tjänar som exportkanal ut till den extracellulära omgivningen. Troligen behövs MtrF för
export av höga nivåer av antibiotika. MtrR- och MtrA-proteinerna kan reglera uttrycket av
effluxoperonet. MtrA inducerar uttryck av mtrCDE-generna medan MtrR undertrycker direkt
uttryck. Förlust av MtrR-proteinet genom deletion eller inaktivering genom insertion
resulterar i ökad resistens mot vissa antibiotika och ökar uttrycket av mtrCDE-genkomplexet.
Detta system verkar agera synergistiskt med andra kromosomala mutationer (6).
I en undersökning av Veal et al 2002 visades att mutationer i mtrR, penA och penB orskar
höga resistensnivåer mot antibiotika (11).
Deletion av ett enda baspar i mtrR var tillräckligt för att ge höga resistensnivåer mot te x
erythromycin och Triton X-100, men endast en tvåfaldig ökning av resistensen mot penicillin.
När mutationer i penA och penB lades till, ökade resistensnivåerna 8-10 gånger. PenBmutationen består i en missense-mutation som ger aminosyreutbyte i loop 3 hos PorIB. Detta
ger en minskad influx av penicillin och tetracyklin. I gonokocker med både penA, penB och
mtrR-mutationerna ökar penicillinresistensen 66 gånger jämfört med vildtyp (11).
MtrC-MtrD-MtrE-effluxsystemet och PenB-förändringen i permaebilitet i yttermembranet
verkar synergistiskt för att öka resistensen mot penicillin och tetracyklin hos gonokocker (11).
7
Möjligheten för effluxsystem att verka synergistiskt med andra resistensmekanismer är ett
stort problem vid behandlingen av bakterieinfektioner. Därför har det främsta intresset för
bakteriella effluxsystem riktats mot deras betydelse för utveckling av antibiotikaresistens (6).
Ett antal studier har gjorts där man visat att inaktivering av effluxpumpar är effektivt för att
förhöja bakteriers känslighet mot fluorokinoloner och andra antibiotika, samt för att förhindra
uppkomsten av fluorokinolonresistens. Nyligen har den första bredspektrum-efflux-inhibitorn
av Mex-efflux-systemet i P. aeruginosa rapporterats (9).
Syfte med projektet
Finns det en effluxpump som agerar synergistiskt med mutationerna i gyrA och parC och ökar
graden av resistens? Går den i sådana fall att påvisa genom elektrofores av membranproteiner
och mätning av intracellulärt ciprofloxacin?
Material och metoder
Två resistenta stammar från Bangladesh, A och B, (ciprofloxacin MIC >32 resp 32) användes
som givarstammar då DNA överfördes till en känslig stam, 1, från Sverige, via
transformation. Dessa stammar hade mutationer i positionerna 91 och 95 i gyrA, men inga
mutationer i parC. DNA extraherades från givarstammarna med hjälp av guanidium
thiocyanat (12). Därefter utfördes transformation enligt följande: Mottagarbakterier odlades i
10 ml TSB-buljong över natt i CO2-inkubator varefter 45 μl extraherat DNA från
givarstammarna tillsattes och bakterierna placerades i 15 ml cellodlingsflaskor. Till en flaska
tillsattes inget DNA och dessa bakterier användes som negativ kontroll. Efter inkubering i 6
timmar centrifugerades bakterierna i 10 min i 3000 rpm och racklades sedan ut på
hematinagarplattor innehållande ciprofloxacin (0,016; 0,064 respektive 0,25 mg/L). Som
positiv kontroll användes H-plattor utan ciprofloxacin. Efter två dygn hade transformanter
vuxit fram och kunde användas för vidare försök. De namngavs enligt följande:
1=mottagarstam, en svensk klinisk stam; A = givarstam, en högresistent stam (MIC >32) från
Bangladesh, (nr 11 i ref. 7); B = givarstam, en högresistent stam (MIC 32) från Bangladesh,
(nr 19 i ref. 7); första siffran därefter: 1 = selekterad på platta med ciprofloxacin 0,016 mg/L,
2 = selekterad på platta med ciprofloxacin 0,064 mg/L; sista siffran = ordningstal.
För att undersöka om transformationen fungerat och för att skilja transformanter från spontana
mutanter, samt för att försöka hitta transformanter med resistens beroende enbart av
effluxgener, utfördes PCR för att amplifiera gyrA. DNA extraherades genom kokning (5 min)
och specifika primers användes. Dessa var tillverkade av INTERACTIVA Biotechnologie
(Ulm, Tyskland). PCR-reaktionen utfördes i 45 l reaktionslösning innehållande 5 l 10 x
PCR gold buffer (Applied Biosystems, Foster City., CA), 3 l 25 mM MgCl2, 1 l av vardera
två primers (20 M), 1,25 l av alla de fyra deoxynukleosidtrifosfaterna (10 mM), 0,25 l
AmpliTaq GoldTM (5 U/l) (Applied Biosystems) och 29,75 l sterilt vatten. Följande
temperaturprofil användes för amplifieringen: Initial förkokning vid 94C i 5 min, en cykel
denaturering vid 94C i 1 min, annealing vid 45C, elongering vid 70C i 3 min. Detta
8
upprepades i 35 cykler med en slutlig elongering vid 72C i 10 min. Den amplifierade
produkten analyserades på 2% agarosgelelektrofores. PCR-produkten renades med hjälp av
QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc. , Valencia, CA) och inmärktes med hjälp av
Big-Dye Terminator. Därefter sekvenserades produkten med kapillär elektrofores i en ABI
PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) och sekvenserna analyserades med
Clustal View och Expasy. Resultatet jämfördes sedan med vildtyps-gyrA-sekvenser
publicerade på www.genome.ou.edu.
Effluxpumpars yttre membranproteiner hos gramnegativa bakterier såsom P. aeruginosa och
E. coli har en storlek på 50-60 kDa. Med detta som utgångspunkt gjordes elektrofores för att
leta efter möjliga effluxpumpar med resistensfunktion. Mottagar- och givarstammarna samt en
definierad känslig labstam (22) odlades på hematinagarplattor och suspenderades i PBSbuffert varefter de centrifugerades i 3000 rpm i 30 min. 10-20 plattor användes för varje stam
för att en tillräcklig mängd skulle kunna erhållas. Pelleten tvättades i 5 mM
natriumfosfatbuffert innehållande 1 mM magnesiumklorid och 0,14 mM β-merkaptoetanol
och resuspenderades i samma buffert, utan β-merkaptoetanol, samt sonikerades i 3 x 1 min.
För att skilja ut cellmembranerna centrifugerades de sonikerade cellerna i 15 min, 5 000 x g.
Supernatanten resuspenderades i 10 ml natriumfosfatbuffert (5 mM) och ultracentrifugerades i
30 min,
100 000 x g. Pelleten tvättades i samma buffert och centrifugerades igen på
samma sätt. Sedan frystes membranen i 0,5 ml buffert innehållande 5 vol% glycerol. För att
separera proteinerna användes en Phast Gel (Amersham Biosciences).
En ny transformation utfördes, med en av de gamla (1A11) transformanterna som
mottagarstam och samma givarstammar som första gången. Samma metod användes, och
samma namngivningssystem tillämpades. Transformanterna selekterades den här gången på
agarplattor innehållande 0,25; 0,5; respektive 1,0 ciprofloxacin mg/L.
Några av dessa transformanter (2A21, 2A31 och 2A32) testades med ovan nämnda
elektroforesmetod, men odlades då i BHI-buljong istället för på plattor.
En annan metod för att påvisa närvaro av aktiva effluxpumpar är att mäta den intracellulära
ackumuleringen av ciprofloxacin med respektive utan tillsats av en effluxinhibitor. Celler
(stam A, B och 22, 1A23 och 2A25) odlades i 100 ml BHI över natt och centrfugerades sedan
vid 3000 rpm i 15 min, tvättades med PBS och resuspenderades i PBS till OD600: 1. Därefter
sattes 590 μl bakteriesuspension till sju eppendorfrör per stam, och 12 μl PBS tillsattes till ett
av rören. Till de övriga sattes 12 μl ciprofloxacin (500 μg/ml). Efter inkubering i 10 min
tillsattes 10 μl Carbonyl Cyanide m-Chlorophenylhydrazone (CCCP) (2,496mg/ml) som
hämmar effluxaktivitet, till tre av rören med ciprofloxacin och 10 μl PBS till de öviga rören.
Efter ytterligare inkubering i 10 min tillsattes 500 μl bakteriesuspension till eppendorfrör med
silikonolja, 325 μl dimetyldifenylpolysiloxan och 175 μl dimetylpolysiloxan. Rören
centrifugerades 1 min vid 13000 x g varefter vätskefasen avlägsnades och pelleten skars av
med en skalpell och lyserades i 2 ml glycinbuffert över natt i mörker vid rumstemperatur.
Därefter centrifugerades rören vid 12000 x g i 5 min och fluorescensen i supernatanten mättes.
Ciprofloxacin är naturligt fluorescerande och mängden intracellulärt ciprofloxacin kunde
beräknades sedan enligt
y = 0,475c + 1,995
där
c = ciprofloxacinkoncentration i provet
y= fluorescensvärde
9
Koncentrationen i ng/cfu beräknades enligt
2c/0,558 x cfu där
x = ciprofloxacinkoncentration i provet
0,558 = volymen i kyvetten
MIC-värden hos transformanterna testades med Etest från AB BIODISK.
Resultat
Transformanter selekterades på plattor innehållande ciprofloxacin av tre olika koncentrationer
(0,016, 0,064 respektive 0,25 mg/L). Inga transformanter växte på plattorna med högst
koncentration. 32 stammar valdes ut för vidare analys. Dessa togs jämt fördelat från de olika
plattorna.
Sekvensering av gyrA visade att alla stammarna utom två hade båda mutationerna, i position
91 och 95. I position 91 hade aspartat bytts ut mot glycin, och i position 95 hade serin ersatts
med fenylalanin. Dessa är de mutationer som fanns hos givarstammarna. Två stammar, 1A15
och 1A16, hade endast tagit upp mutationen i position 95 (se tabell 1).
Etesterna visade att de stammar som endast hade en mutation i gyrA hade lägre resistensnivå
än de övriga stammarna. Skillnaden var dock liten, och det mest anmärkningsvärda var att de
flesta stammarna, framför allt efter första transformationen, hade mycket låga resistensvärden.
Efter den andra transformationen höjdes resistensnivåerna, men de flesta stammarna
uppvisade
fortfarande en relativt låg resistens (se tabell 2).
Stam
MIC
(ciprofloxacin)
gyrA-mutation
gyrA-mutation
Ser→Phe
i pos 95
Asp→Gly
i pos 91
1A15, 1A16
0,047
x
1A23, 1B14
0,094
X
x
1A14
0,125
X
x
1A29, 1A210,
0,125
X
x
1B16, 1B19, 1B21
1A11, 1A19, 1A21,
0,19
X
x
1A22, 1A27, 1B10
1A25, 1B13,
0,25
X
x
1B15, 1B17
Tabell 1. MIC-värden och mutationer hos transformanter efter en transformation.
10
Stam
2A29, 2B11, 2B13, 2B15, 2B17, 2B18,
2B19, 2B110
2A27, 2B12, 2B28
2A17, 1B22
2A15, 2A19, 2A22, 2B21, 2B23, 2B25,
2B27, 2B29
2A13, 2A21, 2A23, 2A28, 2B26
2A14, 2A16, 2A110, 2A24, 2A31, 2A32
2A12, 2A18
2A26, 2A210
2A25
MIC (ciprofloxacin)
0,5
0,75
1,0
1,5
2
3
4
6
16
A
>32
B
32
Tabell 2. MIC-värden hos transformanter efter två transformationer, samt hos givarstammarna.
Gelelektroforesen för att leta efter effluxpumpar (fig. 1 och 2) visade att metoden fungerade,
men det var svårt att se band kring 50-60 kDa hos givarstammarna som inte fanns hos
mottagarstammen och labstammen. Möjligen finns en skillnad kring 30 kDa.
Bild 1. Elektrofores av membranproteiner.
Ovanifrån: markör 14-93 kDa, A, B, 1, 22.
Inga band med storleken 50-60 kDa hittades
hos enbart hos de resistenta stammarna.
Möjligen fanns ett sådant band kring 30 kDa.
Bild 2. Elektrofores av membranproteiner.
Ovanifrån: markör 14-23 kDa, A, B, 22,
2A21, 2A31, 2A32, markör 14-93 kDa
spädd x 5. Resultaten blev desamma som
efter den första elektroforesen (blid 1).
Mätningen av intracellulärt ciprofloxacin med och utan tillsats av CCCP gav mycket spridda
värden. Stammarna B och 2A25 hade en högre ciprofloxacinkoncentration vid tillsats av
CCCP, medan stam A hade en lägre. Den känsliga stammen 1A23 uppvisade någorlunda lika
nivåer med och utan CCCP, medan stam 22 uppvisade stora skillnader.
11
Stam
MIC
(ciprofloxacin)
CCCP
CiprofloxacinCiprofloxacinkonc
i konc per cell
provet
(ng)
A
>32
103,27
74,7
+
62,54
45,26
B
32
52,68
+
86,39
22
126,09
65,98
+
38,42
20,11
1A23
0,094
90,41
+
102,94
2A25
16
76,66
104,30
+
138,54
188,49
Tabell 3. Intracellulär ciprofloxacinkoncentration med respektive utan effluxinhibitor, CCCP.
Diskussion
Det är känt att kinolonresistens hos gonokocker kan uppstå genom mutationer i gyrA och
parC som kodar för gyras respektive topoisomeras IV. Detta förhindrar bindning av
kinolonerna till dessa enzymer och följaktligen förloras antibiotikumets verkan (7, 8). Detta
kan dock inte till fullo förklara resistensutvecklingen (7). I detta försök utfördes två
transformationer. Den första gav inte upphov till några höga resistensnivåer, ens hos de
stammar som hade båda mutationerna i gyrA. Alla stammarna låg inom området I (där S =
känslig, I = indeterminant, R = resistent) (www.tlkronoberg.se/ext/raf/raf.htm). Vid den andra
transformationen höjdes resistensnivåerna, men olika mycket. Detta visar att fler orsaker än
gyrA-mutationer finns till kinolonresistens hos gonokocker.
En möjlig annan mekanism är efflux som aktivt pumpar ut kinolonerna ur cellen. Detta har
identifierats hos ett flertal olika bakteriearter (6, 9, 10, 11). Resultaten från denna studie kan
inte bekräfta att så är fallet, men inte heller utesluta en sådan mekanism. Gelelektrofores
utfördes för att leta efter yttre membranproteiner kring 50-60 kDa. Inga band med denna
storlek hittades hos de resistenta men inte hos de icke-resistenta stammar som testades.
Möjligen fanns några sådana band kring 30 kDa. Eventuellt kan det finnas ett effluxsystem
som förhöjer reisitensnivåerna men som inte utgör en hel effluxpump utan använder delar av
ett annat effluxsystem för att pumpa ut kinoloner. För ett säkert resultat borde dock metoden
upprepas fler gånger.
Mätningen av intracellulär ciprofloxacinhalt hos resistenta och känsliga bakterier med
respektive utan påverkan av effluxinhibitor gav mycket spridda värden. Eftersom A, B och
2A25 är resistenta stammar, förväntades de uppvisa låga ciprofloxacinhalter utan tillsats av
CCCP men höga halter vid närvaro av denna substans. 22 och 1A23, som är känsliga,
förväntades uppvisa samma, höga, nivåer av ciprofloxacin oavsett tillsats av CCCP. 2A25 var
dock den enda stam som gav förväntat resultat. Om resultaten från den stammen kan
upprepas, kan det tyda på närvaro av en effluxpump. Anledningen till de spridda resultaten är
antagligen att metoden är framtagen för E. coli som är betydligt tåligare än gonokocker, som
kan ha dött på ett tidigt stadium eller lyserats under försökets gång och på så sätt gett ha gett
12
upphov till felaktiga värden. För bättre resultat skulle metoden behöva optimeras och eftersom
skillnaderna i värden är små skulle den behöva upprepas flera gånger för att ge ett tillförlitligt
resultat.
En tredje möjlighet är att bakterien producerar ett protein som skyddar gyras från kinolonerna.
Detta har påvisats hos Klebsiella pneumoniae (13, 14). Där hittades en plasmid (pMG252) i
ett kliniskt isolat och visades ge höga kinolonresistensnivåer (MIC > 32 μg/ml) hos stammar
saknande yttre membranporiner, men betydligt lägre hos stammar med normala poriner. Hos
vildtypen var resistensnivåerna låga, men de höjdes lätt genom mutation. Plasmiden hade ett
brett värdspektrum och uttryckte resistens hos andra enterobacteriaceae samt i Pseudomonas
aeruginosa (13). Denna mekanism skulle kunna vara möjlig även för gonokocker. Det skulle
kunna förklara frånvaron av påvisbara effluxpumpar. Det skulle även förklara varför
transformanterna inte blev mer resistenta då DNA-extraktionen kanske inte var optimal för
extraktion av plasmiden.
Slutsatser
Resultaten från transformationerna visar att mutationerna i gyrA och parC i sig inte är
tillräckliga för att ge de höga reisitensnivåer som hittats hos många gonokockstammar.
Gelelektrofores av membranproteiner och mätning av intracellulärt ciprofloxacin kan
antagligen påvisa aktiva effluxpumpar, om de finns där. Dessa metoder behöver dock
optimeras för gonokocker och upprepas fler gånger än vad som här har gjorts. Resultaten från
denna studie kan inte bevisa att det finns en effluxpump som agerar synergistiskt med dessa
mutationer och ökar graden av resistens, men inte heller utesluta en sådan möjlighet. En annan
möjlighet kan vara plasmidburen resistens.
Efter att det experimentella arbetet i denna studie avslutats, hittades en effluxpump, NorM,
hos Neisseria gonorrhoeae, tillhörande MATE-familjen (15). Punktmutationer i –35-regionen
gav minskad känslighet för bland annat ciprofloxacin. Emellertid var förändringen i
ciprofloxacinkänslighet endast tvåfaldig, vilket visar att NorM ensamt inte är tillräcklig för
utveckling av höga resistensnivåer, utan att det antagligen finns ytterligare en effluxpump eller
någon annan mekanism som återstår att upptäckas.
13
Referenser
1. Knapp J, Koumans EH. Neisseria and Branhamella. In: Murray PR, et al. Manual of
Microbiology. 7th ed. Washington, DC: American Society for Microbiology; 1999:586603.
2. Forsgren A, Kronvall G. Klinisk bakteriologi. Studentlitteratur, 1996.
3. Madigan TM. et al. Brock Biology of Microorganisms, 9th ed. Prentice-Hall Inc. Upper
Saddle River, New Jersey 07458, USA. 2000.
4. Iwarson S. Infektionssjukdomar. Almqvist & Wiksell, 1991;48-49, 276.
5. Rein MF. Sexually transmitted diseases. In: Reese RE, Betts RF. A Practical Approach to
Infectious Diseases. 3rd ed. Little, Brown and Company, 1991;390-401.
6. Roquette-Loughlin C et al. Antimicrobial efflux systems possessed by Neisseria
gonorrhoeae and Neisseria meningitidis viewed as virulence factors. Microbial Multidrug
Efflux. 2002 Horizon Scientific Press, Wymondham, UK.
7. Lindbäck E et.al. Mutations in gyrA, gyrB, parC and parE in quinolone resistant strains
of Neisseria gonorrhoeae. APMIS, 2002;110;651-657.
8. Drlica K, Zhao X. DNA gyrase, Topoisomerase IV, and the 4-quinolones. Microbiology
and molecular biology reviews. 1997;61;377-392
9. Poole K. Minireview: Efflux-mediated resistance to fluoroquinolones in gram-negative
bacteria. Antimicrobial Agents and Chemoterapy. 2000;44;2233-2241.
10. Kumar A, Worobec EA. Fluoroquinolone Resistance of Serratia marcescens: Involvment
of a proton gradient-dependent efflux pump. Journal of Antimicrobial Chemotherapy.
2002;50.
11. Veal WL, Nicholas RA, Shafer WM. Overexpression of the MtrC-MtrD-MtrE efflux
pump due to an mtrR mutation is required for chromosomally mediated penicillin
resistance in Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology, 2002;5619-5624.
12. Pitcher DG et. al. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanat.
Letters in Applied Microbiology. 1989;8;151-156.
13. Martínez-Martínez L et al. Quinolone resistance from a transfreable plasmid. Early report,
The Lancet. 1998;351.
14. Tran JH, Jacoby GA. Mechanism of plasmid-mediated quinolone resistance, Proceedings
of the National Academy of Sciences. 2002;99.
15. Roquette-Loughlin C et al. The NorM efflux pump of Neisseria gonorrhoeae and
Neisseria meningitidis recognizes antimicrobial cationic compounds. Journal of
Bacteriology. 2003;185;1101-1106.
14
