Molekylärbiologins centrala dogma
m
Replikation: Bassekvensen i DNA står för den genetiska informationen. När en cell
ska delas måste DNA:t dupliceras – man måste få nytt DNA med exakt samma
bassekvens som originalet.
Vid proteinsyntes överförs informationen från DNA till aminosyrasekvens i två steg:
Transkription: Bassekvensen i DNA översätts till bassekvens i mRNA. mRNA fungerar
sedan som mall för proteinsyntesen.
Translation: Bassekvens i mRNA översätts till aminosyrasekvens m h a tRNA.
Processen sker på ribosomerna. En sekvens av tre baser utgör den GENETISKA
KODEN och specificerar en viss aminosyra.
Transkription
= Översättning av bassekvensen i DNA till RNA
OBS!
Enklare process i prokaryota system - mycket mer komplicerat i eukaryota system!
RNA:
Tre huvudtyper:
• tRNA
• rRNA
• mRNA
transfer RNA
ribosomalt RNA
messenger RNA
Alla tre är involverade vid proteinsyntesen:
DNA
mRNA
Protein
Transkription
Translation
rRNA
tRNA
I eukaryoter har man även funnit ytterligare en variant, snRNA (small nuclear): Involverade vid ’splicing’.
Återkommer till detta!
Funktioner hos RNA
rRNA:
Bygger tillsammans med proteiner upp RIBOSOMER.
På ribosomerna sker proteinsyntesen.
tRNA:
Transporterar aminosyror från cytosolen till ribosomen. Ser till att rätt
aminosyra hamnar på rätt plats i den växande polypeptidkedjan.
mRNA:
Utgör mall för proteinsyntesen. mRNA bildas genom avskrivning av
DNA-sekvensen.
Strukturen hos RNA - tRNA
3’
tRNA:
Minsta typen av RNA, ca 80 nukleotider.
Intramolekylära vätebindningar mellan
kvävebaser gör att tRNA-molekylen blir
klöverformad (2D).
o Aminosyran som hämtas i cytosolen och transporteras till ribosomen binds till
3’-änden av tRNA-molekylen.
o I antikodonloopen finns tre kvävebaser som basparar med mRNA och svarar för
att aminosyrorna kommer i rätt ordning i proteinet.
o Innehåller flera ovanliga, modifierade baser.
Strukturen hos RNA - tRNA
Tredimensionellt viker sig sedan tRNA så den blir L-formad.
I den tredimensionella formen hamnar bindningsstället för aminosyran så långt som möjligt ifrån
antikodonet.
Olika tRNAmolekyler binder olika aminosyror – aminosyran måste ”stämma” med antikodonet.
Strukturen hos RNA - tRNA
Strukturen hos RNA - tRNA
5
3
Esterbindning
En aminosyra kopplad på 3’-OH
Strukturen hos RNA - rRNA
Ribosom innehåller rRNA
rRNA: Stora RNA molekyler som
tillsammans med proteiner bygger upp
ribosomer (2/3 av massan är RNA,
1/3 proteiner).
50S
Ribosomerna består av en mindre och
en större subenhet (30S och 50S).
I eukaryoter (40S och 60S)
30S
S = Sedimentationskonstanten =
Svedberg
1 S motsvarar sedimentation på 10-13 s i
en ultracentrifug (2 000 000 g)
http://guweb2.gonzaga.edu/faculty/cronk/biochem/Rindex.cfm?definition=ribosome
Strukturen hos RNA - mRNA
mRNA
mRNA: Innehåller bassekvensen som specificerar aminosyrasekvensen i ett protein.
mRNA bildas när protein ska syntetiseras och bryts sedan snabbt ner för att nukleotiderna
ska kunna återanvändas och för att cellen ska kunna kontrollera när ett visst protein
syntetiseras.
Bassekvensen i mRNA erhålls genom transkription (avskrivning) av bassekvensen i DNA.
Strukturen hos RNA - mRNA
Metylerad kvävebas
Hos eukaryota organismer modifieras mRNA efter transkriptionen
En ”cap” struktur bildas på 5’ änden och en längre sekvens med
Adenin kvävebaser läggs till vid 3’ änden
Ökar stabiliteten
Roll mindre känt
Ökar stabiliteten?
Underlättar translationen?
Strukturen hos RNA - mRNA
mRNA innehåller informationen för ordningen på aminosyrorna i ett protein
Tre nukleotider i följd kodar för en aminosyra
Ex:
UUU = Phe
CAU = His
AAG = Lys
CGU = Arg
CGC = Arg
CGA = Arg
CGG = Arg
En aminosyra kan kodas av flera kodon = den genetiska koden är degenererad
Strukturen hos RNA - mRNA
mRNA innehåller start signal (AUG) för proteinsyntes
Formylgrupp
Strukturen hos RNA - mRNA
mRNA innehåller stop signal för proteinsyntes
Transkriptionen
Transkriptionen katalyseras av RNA-polymeras, ett enzym som kopplar samman
ribosnukleotider i riktning 5’ 3’.
Hos E.coli består enzymet av fyra olika subenheter:
α2ββ’σ
ββ σ.
σ-enhetens funktion är att hitta startstället, sedan
dissocierar den och α2ββ’ katalyserar själva
polymerisationen.
Transkriptionen - mekanism
Samma procedur som vid replikationen
1. Ny trifosfatnukleotid binder först till mallkedjan genom basparning i.e.
vätebindning mellan två matchande kvävebaser
2. Hydroxylgruppen på C3 i den intilliggande nukleotiden gör en nukleofil attack på
den innersta fosfor-atomen i den nya trifosfatnukleotiden.
3. PPi hydrolyseras och den nya nukleotiden sätts ihop kovalent med resten av RNA
kedjan
4. Energikrävande process. Pyrofosfat (PPi) hydrolyseras varvid energi frigörs
Transkriptionen - mekanism
Nukleofil
attack av
OH på C3
5
3
3’,5’-fosfodiesterbindning
5
3
Ny nukleotid
H-bindningar
OBS! ribos i RNA
deoxyribos i DNA
Fosfaten är kopplad från C3 i kedjan till C5 i nästa socker, alltså 3’,5’-fosfodiesterbindning.
Kedjan växer 5’ → 3’ – mRNA skrivs från 5’→ 3’
Transkriptionen
RNA polymeras tar instruktionen från DNA
Bassekvensen i mRNA är komplementär till den blåa DNA-strängen (templat kedjan)
Den svarta DNA kedjan kallas för den kodande kedjan eftersom den har samma
sekvens som mRNA förutom vid positionen för U i mRNA som är T i DNA kedjan
Transkriptionen
mRNA
Transkriptionen - mekanism
Mekanismen hos RNA polymeras liknar mekanismen för DNA-polymerasets:
• Syntetiserar ny kedja 5’ 3’.
•
3’-OH gör nukleofil attack på innersta fosfaten i trifosfatnukleotiden varvid
pyrofosfat lämnar.
•
Tar instruktioner från en DNA-mall.
Skillnader i funktion mellan DNA- resp. RNA-polymeras:
• RNA-polymeraset behöver ingen primer.
• RNA-polymeraset saknar exonukleas aktivitet.
Gör inte lika mycket om det blir fel!!!
Replikation – felet går vidare till nästa uppsättning celler
Transkription – genererar endast ett tillfälligt fel i ett och annat protein
Transkriptionen - start
Transkriptionen startar vid s k promoterregioner. Dessa regioner är AT-rika:
•
•
-35-regionen
Pribnow-boxen
(TATA-boxen)
Ser lite olika ut vid olika promoter men båda sekvenserna måste finnas
Transkriptionen - start
RNA polymeraset måste vira upp DNA för att transkriptionen skall börja
Ca 17 baspar
Transkriptionen
Transkriptionen sker i en transkriptionsbubbla som löper längst med DNA
TRANSKRIPTIONSBUBBLA:
DNA-helixen öppnas och stängs med samma
hastighet så att det hela tiden är ca 17 baser
oparade på den kodande DNA kedjan.
Transkriptionen - terminering
Transkriptionen fortgår till en termineringssignal nås.
Terminering:
Två sekvenser som innehåller många G och C viker RNA:t till en stabil hårnålsloop
Därefter kommer en sekvens med flera U → destabilisering
Destabilisering: A-U förbinds med 2
vätebindningar → RNA och DNA hålls
inte ihop så bra längre – de separerar
och RNA polymeraset släpper
G och C basparar med 3 vätebindningar
Transkriptionen - terminering
Vissa gener kräver en annan faktor för att avsluta transkriptionen, ett protein som kallas rho.
Rho känner igen ytterligare sekvenser i det nysyntetiserade transkriptet, binder till RNA:t
vilket leder till att RNA-polymeraset lossnar.
Processen kräver energi!
Notera;
I båda fallen ovan så är det signaler i det nysyntetiserade RNA:t som
känns igen och inte signaler i DNA:t!
Transkriptionen
I prokaryoter translateras mRNA innan hela genen transkriberats
I eukaryoter bildas ett primärt transkript som processas innan färdigt mRNA lämnar
kärnan för transport till ribosomerna i cytosolen.
Transkriptionen
I prokaryoter syntetiseras RNA av ett polymeras men i eukaryoter finns det tre olika polymeraser
Polymeraserna finns på olika ställen i cellkärnan
och koder för olika RNA molekyler samt är olika
känsliga för α-Amanitin som är ett gift från
svampen Amanita phalloides
Lömsk flugsvamp
Transkriptionen
Hos eukaryoter
RNA polymeras I katalyserar formation av rRNA som skall ingå i ribosomen
Från transkriptionen fås pre-rRNA
som innehåller tre olika rRNA
molekyler (18S, 5.8S samt 28S)
Modifiering av både ribos- och
kvävebasenheter (röda streck).
Ex metylering
Klyvning → Färdigprocessat rRNA
40S
60S
En annan rRNA-molekyl (5S) som skall ingå i
60S transkriberas av RNA polymeras III
Transkriptionen
Hos eukaryoter
RNA polymeras III katalyserar formation av tRNA
Processning av tidigt tRNA transkript
Borttag av nukleotider vid 5’ och
3’ ändan
Tillägg av CCA vid 3’ änden
Borttag av en 14 nukleotid lång
intron → splicing
Modifiering av socker- och
kvävebasenheter (viktigt för
funktionen)
Transkriptionen
Hos eukaryoter
RNA polymeras II katalyserar formation av mRNA
För att RNA-polymeraset ska hitta rätt startställe på DNA templatet krävs ett antal
transkriptionsfaktorer; TFII A, B, D, E, F, H. (TF = transkriptionsfaktorer, II – RNA polymeras II)
TFIID binder till TATA-boxen via en av sina
subenheter, TBP (’TATA-box binding protein’).
Detta leder till konformationsförändringar i DNA
TFIIA och TFIIB binder in till TBP:s yta.
Transkriptionen
Efter att TFIIB bundit in byggs komplexet på med TFIIF, E
och H och RNA polymeras II
TFIIH öppnar DNA helixen och fosforylerar den Cterminala domänen (CTD) av polymeraset → polymeraset
lämnar promotorn och börjar transkriptionen
Transkriptionen
Hos eukaryoter
RNA polymeras II katalyserar formation av mRNA
5’ änden stabiliseras av Cap
För att avsluta transkriptionen
känner ett specifikt endonukleas
igen sekvensen AAUAAA och
klyver RNA nedströms
En svans AAAAA(A)n kopplas på av
poly(A)polymeras
Splicing
Färdigt mRNA
Transkriptionen – splicing av mRNA
• De primära mRNA transkripten i eukaryoter består av EXONER och
INTRONER.
• Exonerna innehåller den genetiska informationen som kodar för
protein - 2% av vårt genmaterial
• Intronerna (- 98 % av vårt genmaterial) används inte som mall för
proteinsyntes utan dessa klipps bort från mRNA – processen kallas för
splicing
• I medeltal innehåller en gen hos människan 8 introner men det kan
finnas upp till 100 stycken
• Ofta kodar exonerna för olika funktionella domäner eller subenheter i
ett protein
• Genom olika (alternativ) splicing kan olika varianter av mRNA bildas
från en och samma kodande region på DNA
Transkriptionen – splicing av mRNA
Processen då introner avlägsnas och exoner sammanfogas kallas ’splicing’.
Exon
Exon
Splicing
mRNA före splicing
mRNA efter splicing
Transkriptionen – splicing av mRNA
Alternativ splicing genererar mRNA som är templat för olika proteinformer
Splicing 1 av mRNA genererar ett
membranbundet protein
Splicing 2 av mRNA genererar
ett protein som saknar den
membranbindande delen
Splicing
Mekanism:
En intron startar alltid med GU och slutar med AG.
Den har också alltid ett internt förgreningssäte med ett A.
Exon 1
Exon 2
Splicing
Stegvis:
1. 2’-hydroxylgruppen på A i förgreningssätet gör en nukleofil attack på
fosforn i fosfodiesterbindningen
som förbinder exon 1 och intronen.
Bindningen bryts.
2. 3’-hydroxylgruppen på exon 1
attackerar fosfodiesterbindningen
mellan exon 2 och intronen varvid
en ny fosfodiesterbindning bildas
mellan exon 1 och exon 2.
Splicing
Katalyseras av ett komplex, SPLICEOSOMEN, som består av proteiner och snRNA (sn = small nuclear).
U 1, 2, 4, 5, 6 är snRNA som har en viktig funktion vid splicing:
U1 binder till 5’-sätet och U2 till förgreningssätet
Ett komplex av U4-U5-U6 binder in och SPLICEOSOMEN är komplett
U6 binder in till 5’-sätet och knuffar bort U1 och U6-U2 interagerar
med varandra och knuffar bort U4.
2’-hydroxylgruppen på A i förgreningssätet attackerar 5’-sätet varpå
bindningen bryts.
U5 håller de två exonerna nära varandra
hydroxylgruppen i 5’-sätet attackerar 3’-sätet → färdigsplicad exon
Splicing
Alternativ splicing:
Viktigt för ett begränsat genmaterial kan ge upphov till många olika proteiner.
Typexempel: Antikroppsproduktion
Bananflugor har ca 14 000 gener och en människa
har ungefär dubbelt så många ca 24 000
Bananflugans huvudsysselsättning är att finna en
banan och vi har många fler funktioner.
Tittar man på antalet mRNA vi bildar är det ca 150
000 alltså 6 ggr mer än generna.
Slutsats: Genmaterialet kan användas för att ge
flera olika mRNA transkript
Notera; En stor andel av alla genetiska sjukdomar (speciellt neurologiska) orsakas av mutationer som
påverkar var gener ’splicas’.
Man tror att över 70% av alla gener är föremål för alternativ splicing för att producera funktionellt olika proteiner.
Grundtesen, en gen = ett protein stämmer alltså inte.
Vårt genmaterial skiljer sig motsvarande 1-2% från chimpanserna. Om vi inte hade alternativ splicing så skulle inte skillnaderna i
proteinuttryck vara så stor som den är mellan människa och chimpans.
Ange mRNA-sekvensen som motsvarar följande DNA sekvens
5’ CGA TGT TAG CGT-3’ Templat kedjan
Ange mRNA-sekvensen som motsvarar följande DNA sekvens
5’ CGA TGT TAG CGT-3’ Templat kedjan
3’ GCU ACA AUC GCA-5’ mRNA från 3’-5’
SVAR: 5’ ACG CUA ACA UCG 3’
