Next generation sequencing för
behandlingsstyrande analyser inom
molekylärpatologin
Caroline Rolandsson
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik, FoU
Örebro Universitetssjukhus
Next generation sequencing –
Massiv Parallell sekvensering
Första generationen
Andra generationen
www.biology.reachingfordreams.com
Massiv parallell sekvensering
Fyra steg
• Bibliotekspreparering
• Templatpreparering
• Sekvensering
• Analys av data
Bibliotekspreparering
• Fragmentering
• Adaptor, Index och primrar
• Amplifiering
www.illumina.com
MiSeq (Illumina)
PGM (Thermo Fisher)
MiSeq (Illumina)
www.illumina.com
MiSeq (Illumina)
www.illumina.com
MiSeq (Illumina)
www.illumina.com
MiSeq (Illumina)
www.illumina.com
PGM (Thermo Fisher)
Templatpreparering
www.lifetechnologies.com/iontontorrent
Ion chef (Thermo Fisher)
Bibliotekspreparering och templatpreparering
PGM (Thermo Fisher)
Sekvensering
www.lifetechnologies.com/iontontorrent
Sekvenser sorteras/mappas upp
Behandlingsstyrande analyser
Analyser som efterfrågas idag
− Kolorektalcancer: KRAS, NRAS, BRAF
− Icke småcellig lungcancer: EGFR, KRAS, ALK, ROS1, RET
− Maligna melanom: BRAF
− Ovarialcancer: BRCA1/2
BRCA1/2
• 10-15 % av alla epiteliala ovarialcancerfall
• Olaparib (Lynparza) - december 2014 godkänt av European
Medicines Agency och U.S. Food and Drug Administration för
patienter med höggradig serös ovarialcancer med BRCA1/2
mutationer som blivit behandlade med cellgifter minst tre gånger
BRCA1/2
• 43 prover, höggradig serös ovarialcancer, 2012-2015, Örebro
Universitetssjukhus
Valideringsprover
• 10 prover, Institut für Pathologie, Universitetskliniken i Köln (GeneRead
DNAseq targeted panel V2, Human BRCA1 and BRCA2, Qiagen)
• 4 prover jämförts med Lund (TruSeq Custom Amplicon, Illumina)
• 12 prover jämförts med Akademiska sjukhuset, Uppsala (AccelAmplicon,
Swift Biosciences)
• 8 prover jämförts med annan panel i Örebro (Oncomine BRCA, ThermoFisher)
BRCA1/2
• Bibliotekspreparering
− Multiplex PCR: BRCA Tumor MASTR Plus Dx kit (Multiplicom)
− Universal PCR: KAPA library quantification kit (Illumina)
− Denaturering
• Miseq (Illumina)
− Templatpreparering
− Sekvensering
• Dataanalys
− Mappas upp mot referensgenomet hg19
− CLC Genomics Workbench (Qiagen, Tyskland)
− Ingenuity Variant Analysis (Qiagen)
BRCA1/2
Resultat
• 14.3 % (6/42) kliniskt relevanta mutationer i BRCA1/2
• Alla 10 prover från Universitetskliniken i Köln visade på samma
genetiska varianter
• Prover skickade till Lund och Uppsala visade överensstämmande
resultat
• Ett prov analyserat med Oncomine BRCA panel var negativt,
Örebro (Multiplicom) och i Uppsala var positivt för frameshift i
BRCA 2.
Lunga/kolon/malignt melanom
− Kolorektalcancer: KRAS, NRAS, BRAF (realtids-PCR, pyrosekvensering)
− Icke småcellig lungcancer: EGFR, KRAS (realtids-PCR)
ALK, ROS1, RET (FISH)
− Maligna melanom: BRAF (pyrosekvensering)
• Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research Panel (Thermo Fisher)
− Ion AmpliSeq RNA Fusion Lung Cancer Research Panel
• Oncomine Focus Assay (Thermo Fisher) – DNA och RNA
Panel
Gener
Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer KRAS, EGFR, BRAF, PIK3CA, AKT1,
ERBB2, PTEN, NRAS, STK11, MAP2K1,
Research Panel
Ion AmpliSeq RNA Fusion Lung
Cancer Research Panel
ALK, DDR2, CTNNB1, MET, TP53, SMAD4,
FBX7, FGFR3, NOTCH1, ERBB4, FGFR1 och
FGFR2
ALK, RET, ROS1 och NTRK1
Oncomine Focus Assay - DNA
AKT1, ALK, AR, BRAF, CDK4, CTNNB1,
DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4,
ESR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, GNAQ,
HRAS, IDH1, IDH2, JAK1, JAK2, JAK3, KIT,
KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MTOR,
NRAS, PDGFRA, PIK3CA, RAF1, RET, ROS1
och SMO), DNA CNV (ALK, AR, BRAF,
CCND1, CDK4, CDK6, EGFR, ERBB2,
FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, KIT, KRAS,
MET, MYC, MYCN, PDGFRA och PIK3CA
Oncomine Focus Assay - RNA
ALK, RET, ROS1, NTRK1, NTRK2, NTRK3,
FGFR1, FGFR2, FGFR3, MET, BRAF, RAF1,
ERG, ETV1, ETV4, ETV5, ABL1, AKT3,
AXL, EGFR, ERBB2, PDGFRA och PPARG
Lunga/kolon/malignt melanom
Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research Panel v2
Automatiserad bibliotekspreperation med Ion Chef (7 timmar)
−
−
−
−
Fragmentering
Adaptor, Index och primrar
Amplifiering
Max 8 prover per bibliotekspreperation
• Templatpreparering med Ion chef (10 timmar)
− Bindning till kulor
− Amplifiering
− Laddning av PGM chip
• Sekvensering med PGM (4,5 timmar)
• Bioinformatik: Ion reporter software V4.6 (Thermo Fisher)
Lunga/kolon/malignt melanom panel
Oncomine Focus Assay – DNA och RNA
Manuell bibliotekspreparering (8 timmar)
−
−
−
−
−
−
−
Max 48 prover
Amplifiering: Ion PGM Select Library Reagents
PCR för att delvis smälta bort en bit av primrarna
Bindning av adaptorer
Rening
Amplifiering och bindning till LIB kulor
Poolning
• Templatpreparering med Ion Chef (10 timmar)
• Sekvensering med PGM (4,5 timmar)
• Bioinformatik: Ion reporter software V4.6 och Oncomine variant annotation V1.3
(Thermo Fisher)
Lunga/kolon/malignt melanom
Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Panel v2
15 prover från icke-småcellig lungcancer (endast DNA)
16 prover från koloncancer
14 prover från malignt melanom
Resultat
Överensstämmande resultat mot realtids-PCR och pyrosekvensering
Lunga/kolon/malignt melanom
Problem i framtiden (Ion AmpliSeq)
• Endast 8 prover biliotekspreparering
• Max 2 omgångar i veckan = 16 prover
Nästa steg
• RNA för lungcancer
• Biblioteksprepareringsrobot (ACSIA, PrimaDiag)
− Oncomine Focus Assay, max 48 prover (DNA och RNA)
Tack!
