Optimerat NGS-flöde för rutintypning
av bakterier
Paula Mölling, Molekylärbiolog, Docent
Bianca Törös, Daniel Golparian, Sara Thulin Hedberg, Paula Mölling
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU,
Universitetssjukhuset Örebro
NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS)
Referensgenom
”massiv parallell sekvensering”
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Bibl. prep
2-4 h
hands-on
4-6 h
MiSeq sekv
20 min
hands-on
1-2 dygn
Analys
Helt automatiserad på
MiSeq eller alt. mjukvara
1 h - 1 dygn
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Sekvenseringsteknologi – Illumina
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Ex. MiSeq körning: MiSeq reagent v3.0 (600 cycle)
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Flödesschema - NexteraXT
DNA extraktion
Tagmentering
PCR-amplifiering
PCR-rening
Normalisering
(mät fluorometriskt/qPCR)
Normalisering
(kulor)
Poolning
Kritiska steg för hög kvalité
och ”jämna” NGS data
MiSeq
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
DNA extraktion: kvalité + mängd
Resuspendera ¼ dels blå ögla av bakterier i
1 ml NaCl
Qubit ® 2.0 Fluorometer
(Invitrogen)
Automatisk: QIASymphony
DSP Virus/pathogen MIDI kit
med RNAase (Qiagen)
Späd i två steg ner till 0,2 ng/µL
i 10 mM Tris-HCl
Mät mellan spädningarna:
Eluera i Tris-HCL utan EDTA
Manuell: Wizard® Genomic
Purification Kit (Promega)
Qubit – Broad range dsDNA kit
(Molecular Probes)
2 ng/µL
Eluera i Tris-HCL utan EDTA
Ev. NanoDrop: 260/280=1.8-2 och 260/230= ~2
1µL prov per extraktionsbatch på gel (1% agaros)
Qubit - High Sensitivity dsDNA kit
(Molecular Probes)
0,2 ng/µL
Bra kvalité
Exakt mängd enl kit: 1 ng (5µL)
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Tagmentering
>1 ng DNA / kort tagmenteringsstid
minskad fragmentering (för långa fragment)
<1 ng DNA / lång tagmenteringstid
ökad fragmentering (för korta fragment)
Optimerat till:
0,75 ng DNA (istället för 1 ng)
7,5 min tagmenteringstid (istället för 5 min)
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Normalisering utan kulor
1. Kvalitetscheck av biblioteket – Bioanalyzer, High Sensitivity DNA kit (Agilent)
1 µL ospätt bibliotek
Figuren visar ett lyckat sekvenserat bibliotek.
Ett typiskt bibliotek visar en distribution från
~250 bp till 1000 bp men även fragment upp till
1500 bp går att sekvensera.
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Normalisering av varje prov
Kulbaserad normalisering
qPCR
Qubit
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Optimerat flödesschema - NexteraXT
DNA preparation
(mät fluorometriskt)
Tagmentering
QiaSymphony prep
Qubit-mät exakt till 0,75 ng
7,5 min tagmentering
PCR-amplifiering
PCR-rening
Normalisering
(Bioanalyzer,
mät fluorometriskt)
Normalisering
(kulor)
Poolning
(mät fluorometriskt)
Kolla fragmentstorlek samt
Qubit-mät varje prov
Qubit-mät poolen
MiSeq
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYS
QC kontroll: Kvalitetscheck på sekvenserna
FastQC (Illumina BaseSpace App)
Assembly: Lägga ihop sekvenser till contigs ”assembla” - contigs.fasta
SPAdes (Illumina BaseSpace App), CLC Genomics Workbench, Velvet Optimiser m.fl.
Extrahera fintypningsdata: Databaser för typning av bakterier
• Meningokocker: Bacterial Isolate Genome Sequence Database, BIGSdb
http://pubmlst.org/software/database/bigsdb/
• S. aureus: Ridom SeqSphere+
http://ridom.com/seqsphere/
• ESBL: Center for Genomic Epidemiology (ResFinder, MLST etc)
http://www.genomicepidemiology.org/
1928 Diagnostics: ”full resistance profile + treatment suggestions – in 15 min”
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYSIS
Coverage = (PF Reads x % antal reads för resp isolat x antal cycler totalt ) / genomstorlek
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYS
BIGSdb = Bacterial Isolate Genome Sequence Database
http://pubmlst.org/databases/
Neisseria locus/sequence definitions database – Extract finetype from whole genome data
Assembled FASTQ file
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Kostnadsberäkning samt användningsområden av
NGS för rutindiagnostiken på vårt lab
Metod
Tidsåtgång
Pris MLST + 4 gener
Sanger
~5 veckor / år
~ 2000 kr / prov
NGS
~2 veckor / år
~ 600 kr / prov
Rutinmässig genetisk typing - dagligen/veckovis * NEJ, inte för tillfället
Epidemiologisk övervakning – 2 / år
JA
Utbrottsundersökningar– omedelbart
JA
*N. meningitidis + andra bakterier: N. gonorrhoeae, MRSA (ESBL, C.diff) JA
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Genome-Based Characterization of Emergent Invasive Neisseria meningitidis
Serogroup Y Isolates in Sweden from 1995 to 2012
Bianca Törös, Sara T. Hedberg, Magnus Unemo, Susanne Jacobsson, Dorothea M.C. Hill, Per Olcén,
Hans Fredlund, Holly B. Bratcher, Keith A. Jolley, Martin C.J. Maiden, Paula Mölling
Journal of Clinical Microbiology July 2015 Volume 53 Number 7
Illumina HiSeq,
Strain type YII
P1.5-1,2-2,36-2; F5-8; ST-23Oxford
(cc23);
University
2-55; 25; 22
1995-2012 (n=185)
Subtype 1
2006-2012
Subtype 2
1995-2012
Strain type YIII
Strain
type YI
P1.5-1,2-2,36-2;
F5-8; ST-23 (cc23);
P1.5-2,10-1,36-2;
F4-1;
3-36; 25; 1
ST-23 (cc23); 3-36; 25; 22
NGS
ger samma grova indelning som ”fintypning” av de 12 generna
YI består egentligen av två subtyper där Subtyp 1
är ansvarig för den stora ökningen av McY i sverige
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
SAMMANFATTNING
NGS – enorma möjligheter!!!
Epidemiologisk typning, utbrottsutredningar, karaktärisera resistensmarkörer,
identifiera okända organismer, hitta virulensgener, tumörpaneler, etc
Begränsningar
Dyrt, tar tid, bioinformatiskt kunnande saknas, ger enorma datamängder att hantera
MEN
Med optimerade biblioteksprepsprotokoll – jämnare coverage per isolat fler isolat kan poolas i samma körning – billigare (inga omkörningar)
Användarvänliga moln baserade mjukvaror och databaser ex BaseSpace,
pubMLST.org – reducerar behovet av bioinformatiskt kunnande för enklare
typningsdata för klinisk diagnostik
Automatiserad bibliotekspreparation:
minimera hands-on och mer anpassat för rutindiagnostik!!!
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Tack!
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
