FilmArray - helautomatiserad
multiplex likvordiagnostik
Sara Thulin Hedberg, Molekylärbiolog, PhD
David Nestor, Sara Thulin Hedberg, Paula Mölling &
Martin Sundqvist
Laboratoriemedicinska Länskliniken, Molekylärdiagnostik F&U
/Klinisk Mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro
CNS-infektioner
Meningit = Hjärnhinneinflammation
Encefalit = Hjärninflammation
Kan orsakas av bakterier, virus & jästsvampar
Bakteriell meningit ofta mer akut och vårdkrävande än viral
Akut CNS-infektion
Hög morbiditet och ibland även mortalitet
Huvudvärk, feber, nackstelhet, ljuskänslighet, men varierar beroende på
etiologi
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Meningit-agens, bakterier & jästsvamp
Patogen
Prevalens/Incidens
Streptococcus pneumoniae
~50 % av alla fall av BM
Neisseria meningitidis
~10 % av alla fall av BM
Haemophilus influenzae
~5 % av alla fall av BM (efter
vaccinationsinförande)
Listeria monocytogenes
~5 % av alla fall av BM
Streptococcus agalactiae
~5 % av alla fall av BM
Escherichia coli
~5 % av alla fall av BM
Borrelia burgdorferi
~70/100 000/år
Cryptococcus neoformans
ffa bland HIV-patienter
Cryptococcus gattii
ffa bland HIV-patienter
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Meningit/encefalit-agens, virus
Patogen
Prevalens/Incidens
Enterovirus (EV)
Vanligaste orsaken till aseptisk meningit
(85-95 % av identifierade agens)
Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1)
~2-3/1000 000/år, 90 % av alla HSVorsakade encefaliter
Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2)
~7-10 % av alla fall av viral meningit
Varicella Zooster Virus (VZV)
Rel. hög incidens i Sverige jämf. med
länder med VZV-vac.
Cytomegalo Virus (CMV)
Sällan primär CNS-patogen
Epstein-Barr Virus (EBV)
Sällan primär CNS-patogen
Humant Herpes Virus 6 (HHV6)
Sällan primär CNS-patogen
Humant Parechovirus (HPeV)
Förekommer globalt
Flaviviridae spp
140-190 TBE-fall/år i Sverige
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Diagnostik av meningit/encefalit
Svårt att särskilja vilket agens (bakt/virus/svamp) som
orsakat CNS-infektion baserat bara på kliniska symptom
och biokemiska tester
Odling av bakterier: känslig metod, men tar tid, risk för
falskt neg vid ab-behandling
PCR bra för detektion av både bakterier, virus och
svamp i CSF, men kräver molekylärbiologiskt kunnig
personal, ej 24/7
behov av en snabb, enkel molekylärbiologisk analys
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Syfte
Att utvärdera en helautomatisk
Meningit/Encefalit-panel från
FilmArray
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Material & Metod
Material
• 32 frysta kliniska CSF-prover
S. pneumoniae (n=13), N. meningitidis (n=4), HSV-1 (n=4), HSV-2 (n=3), VZV (n=3),
Enterovirus (n=5)
• Spikade prover, spädningsserier i negativ CSF;
S. pneumoniae, N. meningitidis, L. monocytogenes, S. agalatiae , HSV-1, HSV-2, VZV
• EQA-prover;
UK NEQAS; Virus i CSF (HSV-1 n=1; VZV n=1; EV n=2)
Panel för tre-labs-jämförelse; H. influenzae (n=2), S. pneumoniae (n=2),
N. meningitidis (n=2)
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Material & Metod
FilmArray Meningitis/Encephalitis, RUO (BioMerieux)
•
•
•
•
200 µL CSF-prov mixas med 300 µL lysis buffer och laddas i pouchen
Pouchen placeras i FilmArray-instrumentet, analysen startar
Total analystid 75 min, inkl 5 min hands-on
Endast kvalitativ: Positiv/Negativ
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
FilmArray Meningitis/Encephalitis
DNA/RNA-extraktion
Kulor & Magnetpartilar
RT-PCR
Nestad PCR
IC
RNA-kontroll – hela processen
DNA-kontroll – PCR II
PCR II
Varje target amplifieras
i 3 individuella brunnar
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
FilmArray Meningitis/Encephalitis (ME) panel
Bakterier
Virus
Streptococcus pneumoniae
Enterovirus (EV)
Neisseria meningitidis
Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1)
Haemophilus influenzae
Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2)
Listeria monocytogenes
Varicella Zooster Virus (VZV)
Streptococcus agalactiae
Cytomegalo Virus (CMV)
Escherichia coli
Epstein-Barr Virus (EBV)
Humant Herpes Virus 6 (HHV6)
Jäst
Humant Parechovirus (HPeV)
Cryptococcus neoformans
Cryptococcus gattii
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Material & Metod
Inhouse-PCR Bakteriell meningit (Thulin Hedberg et al. APMIS 2009)
DNA-extraktion: MagNA Pure Compact
PCR: LightCycler 2.0
S. pneumoniae
H. influenzae
S. agalactiae
L. monocytogenes
N. meningitidis
16S
lytA
P6
cfb
hly
ctrA/crgA
U2-U3
SP
HI
GBS
LM
MC
16S
Detektionsnivå: ca 1-100 bakt/specifik PCR
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Resultat
Spädningsserier, bakterier
Patogen
Spädning
S. pneumoniae
N. meningitidis
S. agalactiae
L. monocytogenes
FilmArray ME
Inhouse
1/10 000
+
+
1/20 000
+
NA
1/100 000
-
+
1/100 000
+
+
1/200 000
+
NA
1/1 000 000
-1
+
1/1000
+
+
1/10 000
+
+
1/20 000
+
NA
1/100 000
-
+
1/10 000
+
+
1/100 000
+
+
1/200 000
-
NA
1/1 000 000
-
+
1
Svagt positiv om man tittar på smältkurvan
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Resultat
Spädningsserier, virus
Patogen
HSV-1*
HSV-2*
VZV*
Konc.
(kopior/ml)
FilmArray ME
Kliniskt HSV-1-positivt prov,
kvantifierat vid Sahlgrenska
5000
+
1000
-1
100
NA
10
-
60 000
+
1000
+
6000
+
100
+
600
+
10
-
60
+
1000
+
6
-
100
+
10
-
Konc.
(kopior/ml)
FilmArray ME
* Kontroller från Qnostics med känd ursprungskoncentration
1 Svagt positiv om man tittar på smältkurvan
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Resultat
Kliniska prover, FilmArray ME
Patogen
Antal
positiva
prover
S. pneumoniae
12/13
Kommentar
•
•
•
Ett prov även pos även för Pne med ME, verifierat med in-house
PCR.
2/3
•
Det neg provet hade Ct 39 vid primäranalys.
2/3
•
Det neg provet hade Ct 38 vid primäranalys, även pos för E. coli i
ME, ej verifierad med in-house PCR.
Ett prov även pos för EBV med ME, kunde ej verifieras vid
Sahlgrenska.
N. meningitidis
4/4
HSV-1
4/4
HSV-2
VZV
•
Enterovirus
Det neg provet från 2006, detekterad med nestad end-point PCR.
I ME analyserat i mix med spikat virusprov.
2 prov även pos för HHV-6 med ME, kunde ej verifieras vid
Sahlgrenska.
4/5
•
Det neg provet analyserades sp 1:2 i ME pga bristande
ursprungsmaterial.
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Resultat
EQA-prover
Samtliga EQA-prover identifierades korrekt med FilmArray ME
UK NEQAS; 1 HSV-1, 1 VZV, 2 EV
Panel för tre-labs-jämförelse; 2 H. influenzae, 2 S. pneumoniae,
2 N. meningitidis
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Konklusioner
• Bred analyspanel, användarvänlig, lite hands-on och kort analystid, MEN
endast kvalitativ och låg troughput
• Bra specificitet
Endast 0,4 % oväntat positiva resultat som inte kunde verifieras (1 E.coli, 1 EBV &
2 HHV-6) EBV kommer inte vara med i det kommersiella kitet
• 5-10 × lägre känslighet för de testade bakterierna jämfört med inhousePCR, men endast ett kliniskt prov missas
• Bra känslighet för HSV-2, VZV (~100 kopior/reaktion) och EV (jämförbar
med in-house PCR)
• Spretiga resultat för HSV-1
Låg känslighet vid test av Qnostics kontroll, men hög känslighet vid spädning av
kliniskt prov
Fler tester av HSV-1 ska göras
• Dubbelpositivitet verkar inte vara ett problem
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Tack!
Labben i Linköping och Växjö för kliniska virus-positiva prov!
Klinisk mikrobiologi, Sahlgrenska för verifieringsanalys av
virusprover!
Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
