Next Generation Sequencing (NGS) –
från forskning till rutindiagnostik
Paula Mölling, Molekylärbiolog, Docent
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU,
Universitetssjukhuset Örebro
FORSKNINGSPROJEKT MED NGS
Doktorandprojekt
SYFTE
Undersöka de genetiska grunderna till ökningen av
Neisseria meningitidis serogrupp Y i Sverige
50
45
Number of isolates
40
35
30
B
25
C
20
15
Y
10
5
W-135
0
Year
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
FORSKNINGSPROJEKT MED NGS
Incidens per 100,000 invånare
0.25
0.2
Övriga (n=44)
0.15
Klon YIII (n=6)
Finetyping
7 x MLST gener
porA
0.1
0.05
Klon YII (n=7)
porB
Klon YI (n=28)
fetA
fHbp
penA
0
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
År
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Journal of Clinical Microbiology July 2015 Volume 53 Number 7
Illumina HiSeq, Oxford University
1995-2012 (n=185)
Core genome MLST (cgMLST), 1600 gener
Subtype 1
2006-2012
Subtype 2
1995-2012
NGS
cgMLST ger er samma grova indelning som ”fintypning” av 12gener
YI består egentligen av två subtyper
Subtyp 1 är ansvarig för den stora ökningen av McY i sverige
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
NGS SOM RUTINANALYS?
Misstänkt bakteriell meningit
Rutintypningar: genetiska/fenotypiska
- dagligen/veckovis
Serogruppering/antibiogram
DNA prep
PCR
SP GBS MC 16S
HI LM
A
Y
C
B
Utbrottsutredningar – i stunden
Finetyping
MLST (7)
fHbp
fetA
penA
porB
MLVA
VR1 VR2,3
W-135
Kapselgener
Identifiering
Epidemiol övervakning – 2 ggr/år
Genogruppering
porA
Genosubtypning
NGS
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Bibl. prep
2-4 h
hands-on
4-6h
MiSeq sekv
20 min
hands-on
1 - 2 dygn
Analys
Helt automatiserad på
MiSeq eller alt. mjukvara
20 min - 1 dygn
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Ex. MiSeq körning: MiSeq reagent v3.0 (600 cycle)
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
DNA extraktion: kvalité + mängd
Resuspendera ¼ dels blå ögla av bakterier i
1 ml NaCl
Manuell: Wizard® Genomic
Purification Kit (Promega)
Qubit ® 2.0 Fluorometer
(Invitrogen)
Späd i två steg ner till 0,2 ng/µL
i 10 mM Tris-HCl
Eluera i Tris-HCL utan EDTA
Automatisk: QIASymphony
DSP Virus/pathogen MIDI kit
med RNAase (Qiagen)
Qubit – Broad range dsDNA kit
Eluera i Tris-HCL utan EDTA
Qubit - High Sensitivity dsDNA kit
Bra kvalité
Exakt mängd enl kit: 1 ng
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Optimerat flödesschema - NexteraXT
DNA preparation
(Qubit)
BIBLIOTEKSPREPARATION
Tagmentering
Mät exakt till 0,75 ng
7,5 min
PCR-amplifiering
PCR-rening
Normalisering
(Qubit/TapeStation?)
Normalisering
(kulor)
Poolning
(Qubit)
Fragmentstorlek / mängd
Mängd - mät hela poolen
MiSeq
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
MISEQ - ILLUMINA
Normalisering av varje prov
Kulbaserad normalisering
qPCR
Qubit
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYS
QC kontroll: Kvalitetscheck på sekvenserna
FastQC (ex. Illumina BaseSpace App)
Assembly: Lägga ihop sekvenser ”assembla” till contigs
SPAdes (Illumina App), CLC Genomics Workbench, Velvet Optimiser
Databaser för typning av bakterier - Extrahera fintypningsdata:
• BIGSdb, http://pubmlst.org/software/database/bigsdb/
N. meningitidis mfl
• Ridom SeqSphere+, http://ridom.com/seqsphere/
MRSA, N. meningitidis mfl
• Center for Genomic Epidemiology, http://www.genomicepidemiology.org/
ESBL, MRSA mfl (ResFinder, MLST, plasmid MLST, spa mm)
• 1928 Diagnostics, https://alex.1928diagnostics.com/ (MRSA under utvärdering)
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYS
Coverage = antal reads x antal cycler totalt / genomstorlek
Reads
Contig
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYS
Neisseria meningitidis
BIGSdb = Bacterial Isolate Genome Sequence Database
Neisseria locus/sequence definitions database – Extract finetype from whole genome data
Assembled FASTQ file
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
DATA ANALYSIS
MRSA - Ridom SeqSphere+
J. Clin. Microbiol. April 2016 vol. 54 no. 4 1008-1016
SeqSphere templat:
AlereMicroarray
Samt:
Resistensgener
PVL
TSST
ETA/ETB
etc
1928 Diagnostics (+SCCmec typ)
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
NGS SOM RUTINDIAGNOSTIK PÅ VÅRT LAB
2013-2015 N. meningitidis
Epidemiologisk övervakning – 2 / år
2016 N. meningitidis, N. gonorrhoeae, MRSA
Rutinmässig genetisk typing / Epidemiologisk övervakning - varje månad
2017/18 N. meningitidis, N. gonorrhoeae, MRSA + C.diff + ESBL
Rutinmässig genetisk typing / Epidemiologisk övervakning - varje vecka
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
…fortsatta projekt
nytt doktorandprojekt
12 McY isolat
Subtype 1
2006-2012
Subtype 2
1995-2012
• PacBio sekvensering, http://www.pacificbiosciences.com/products/smrt-technology/
inkl Metylering (6mA, 4mC, 5mC)
• Bakterie fitness – musstudier
inkl Transkriptomanalys (mRNA-NGS)
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
SAMMANFATTNING
NGS – enorma möjligheter!!!
Epidemiologisk typning, utbrottsutredningar, karaktärisera resistensmarkörer,
identifiera okända organismer, hitta virulensgener, tumörpaneler, etc
Begränsningar
Kostar, tar tid, bioinformatiskt kunnande saknas, ger enorma datamängder att hantera
MEN
Med optimerade biblioteksprepsprotokoll –
Jämnare coverage per isolat - fler isolat kan poolas i samma körning
– billigare (inga omkörningar)
Användarvänliga moln baserade mjukvaror och databaser ex BaseSpace,
pubMLST.org
– reducerar behovet av bioinformatiskt kunnande för enklare typningsdata för klinisk diagn
Automatiserad bibliotekspreparation:
minimera hands-on och mer anpassat för rutindiagnostik!!!
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
Laboratoriemedicinska kliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro
