Next Generation Sequencing (NGS) – Revolution i den kliniska vardagen? Paula Mölling, Molekylärbiolog, Docent Laboratoriemedicinska länskliniken Molekylärdiagnostik & FOU Universitetssjukhuset Örebro Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro INNEHÅLL BAKGRUND – DNA HISTORA – DNA SEKVENSERING NEXT GENERATION SEQUENCING MISEQ - ILLUMINA DATA ANALYS KLINISKA APPLIKATIONER FORSKNING till KLINISK APPLIKATION NGS SOM RUTINANALYS SAMMANFATTNING Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro BAKGRUND - DNA 1953 Dubbelhelix – Watson & Crick James D. Watson, 1928 Francis Crick, 1916 Baser: G=Guanin C=Cytosin A=Adenin T=Thymin Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro HISTORA - DNA SEKVENSERING 1975 Sanger sekvensering (stoppnukleotider) Frederick Sanger, 1918 1977 Maximam - Gilbert sekvensering (kemisk nedbrytningssekvensering) Walter Gilbert, 1932 1977 Utveckling av Sanger sekvensering G* C* A* T* G* G* G* Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro HISTORA - DNA SEKVENSERING 1977 Bakteriofag X174 1984 Epstein-Barr-virus, 170 tusen bp 1987 1:a Helautomatiska DNA sekvenserings maskinen ABI 370 Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro HISTORA - DNA SEKVENSERING 1995 1:a bakteriegenomet Haemophilus influenzae 1,8 miljoner bp 1996 Pyrosekvensering – Pål Nyrén & Mostafa Ronaghi, KTH, Stockholm 2001 1:a Humana genomet >3 miljarder bp Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro NEXT GENERATION SEQUENCING 2000 MPSS – (Lynx Therapeutics) Referensgenom – Massive Parallell Signature Sequencing 2010 SMRT (Pacific Bioscience) – ”massiv parallell sekvensering” Single Molecule Realtime Technology http://www.pacificbiosciences.com/products/smrt-technology/ Ordlista Sekvenseringsdjup = x coverage, dvs hur många gånger samma bas ”täcks in” De novo sequencing = sekvensering av ”okända” organismer Resequencing = sekvensering av känd organism där ett referensgenom används i analysen, se bild ovan. Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro MISEQ - ILLUMINA Bibl. prep 2h hands-on 4-6 h MiSeq sekv 20 min hands-on 1-2 dygn Analys Helt automatiserad på MiSeq eller alt. mjukvara ~1 dygn Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro MISEQ - ILLUMINA Tagmentering – fragmentering och inmärkning Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro MISEQ - ILLUMINA Kluster generering Flödescell Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro MISEQ - ILLUMINA Sekvensering Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro MISEQ - ILLUMINA Ex. MiSeq run Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro MISEQ - ILLUMINA Flödesschema - NexteraXT DNA preparation Tagmentering PCR-amplifiering PCR-rening Normalisering (BioAnalyzer & qPCR) Normalisering (kulor) Poolning Kritiska steg för kvalitén på NGS data MiSeq Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro MISEQ - ILLUMINA DNA preparationen: kvalité + mängd Wizard® Genomic Purification Kit (Promega) Qubit ® 2.0 Fluorometer (Invitrogen) 2 loopar of >1µL kollonier resuspi Nuclei Lysis Solution sedan enl protokoll Qubit dsDNA BR assay Kit (Molecular Probes) Eluera i Tris-HCL utan EDTA Späd till 0,2 ng/µL (mät mellan spädningar) Bra kvalité Exakt mängd: 1 ng (5µL) (Även andra metoder fungerar, tex QIASymphony) Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro MISEQ - ILLUMINA Tagmentering >1 ng DNA minskad fragmentering (för långa fragment) <1 ng DNA ökad fragmentering (för korta fragment) Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro MISEQ - ILLUMINA Normalisering Libary quality check – Bioanalyzer with High Sensitivity DNA kit (Agilent) 1 µL ospätt bibliotek Figuren visar ett lyckat sekvenserat bibliotek. Ett typiskt bibliotek visar en distribution från ~250 bp till 1000 bp men även fragment upp till 1500 bp går att sekvensera. qPCR Koncentrationen av varje bibliotek fastställs med qPCR från KAPA vars primerar binder in till Illuminas p5 och p7-indexar. Samma mängd in i poolen – mer lika resultat dvs antal reads per isolat Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro DATA ANALYS Samarbete med Bioinformatiker? Lägga ihop sekvenser till Contigs ”assembla”: SPAdes, CLC, Velvet Optimiser m.fl. contigs.fasta databaser för Typning av bakterier: BIGSdb, SeqSphere m.fl. databaser för Antibiotikaresistens tex ResFinder, BLAST m.fl. Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro DATA ANALYSIS MiSeq BaseSpace Apps + OR + Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro DATA ANALYSIS Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro DATA ANALYSIS Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro DATA ANALYSIS Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro DATA ANALYS BIGSdb = Bacterial Isolate Genome Sequence Database http://pubmlst.org/databases/ Neisseria locus/sequence definitions database – Extract finetype from whole genome data Assembled FASTQ file Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro KLINISKA APPLIKATIONER Mikrobiologi: Utbrottsutredningar – smittspårning, källan till smitta Epidemiologisk typning – övervakning och rapportering Karaktärisering av resistensmarkörer – koll på mutationer, hitta nya Identifiera “okända” organismer – kända/okända Detektera kända virulensfaktorer – ident. sjukdomsframkallande bakterier Patologi/kemi: Cancerpaneler – ta reda på cancertyp och sen rikta behandlingen SNP analys – analysera enstaka positioner i gener kopplade till viss sjukdom Transkriptom analys – karaktärisera uttryck av gener ex kolla vilka gener som är påslagna hos sjuka resp friska (RNA – cDNA – NGS) Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro KLINISKA APPLIKATIONER MRSA utbrott Multiresistenta Staphylococcus aureus ”SUPERBUG” http://www.bbc.co.uk/news/health-20314024 2013-10-14 Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro KLINISKA APPLIKATIONER EHEC - utbrott Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro KLINISKA APPLIKATIONER Ötzi = Ismannen Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro FORSKNING till KLINISK APPLIKATION SYFTE Undersöka de genetiska grunderna till ökningen av N. meningitidis serogrupp Y i Sverige 50 Number of isolates 45 40 B 35 30 C 25 20 Y 15 10 W-135 5 0 Year Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro FORSKNING till KLINISK APPLIKATION Incidens per 100,000 invånare 0,25 Finetyping 0,2 Övriga (n=44) 0,15 Klon YIII (n=6) 7 x MLST gener porA porB Klon YII (n=7) 0,1 Klon YI (n=28) 0,05 fetA fHbp penA 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 År (n=85) Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro FORSKNING till KLINISK APPLIKATION Genome-Based Characterization of Emergent Invasive Neisseria meningitidis Serogroup Y Isolates in Sweden from 1995 to 2012 Bianca Törös, Sara T. Hedberg, Magnus Unemo, Susanne Jacobsson, Dorothea M.C. Hill, Per Olcén, Hans Fredlund, Holly B. Bratcher, Keith A. Jolley, Martin C.J. Maiden, Paula Mölling Accepted in Journal of Clinical Microbiology April 2015 Illumina HiSeq, Strain type YII P1.5-1,2-2,36-2; F5-8; ST-23 (cc23); Oxford University 2-55; 25; 22 1995-2012 (n=185) Subtype 1 2006-2012 Subtype 2 1995-2012 Strain type YIII Strain type YI P1.5-1,2-2,36-2; F5-8; ST-23 (cc23); P1.5-2,10-1,36-2; F4-1; 3-36; 25; 1 ST-23 (cc23); 3-36; 25; 22 NGS ger samma grova indelning som ”fintypning” av de 12 generna YI består egentligen av två subtyper där Subtyp 1 är ansvarig för den stora ökningen av McY i sverige Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro NGS SOM RUTINANALYS Misstänkt bakteriell meningit Rutintypningar: genetiska/fenotypiska - dagligen/veckovis Epidemiol övervakning – 2 ggr/år Utbrottsutredningar – i stunden Serogruppering/antibiogram DNA prep PCR SP GBS MC 16S HI LM A Y C B W-135 Kapselgener Identifiering Genogruppering Finetyping MLST (7) MLVA fHbp fetA penA porB VR1 VR2,3 porA Genosubtypning Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro NGS SAMMANFATTNING NGS – enorma möjligheter!!! Epidemiologisk typning Utbrottsutredningar Karaktärisera resistensmarkörer Identifiera okända organismer Hitta virulensgener Cancerpaneler etc Begränsningar Saknar Bioinformatiskt kunnande!!! Dataanalysen tar ganska lång tid och datakraft Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro Tack! Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU, Universitetssjukhuset Örebro