Laboration – DNA Datum:16/11­20/11 2015 Labgrupp: 11 Laboranter: Johanna Olsson & Kent Johansson Material och metod Materiallista hänvisas till labhandledning s.3 (BIMA15 ht 2015, Lab III: DNA.) Uppsamling och isolering av DNA Laborationen inleds med toppsning av laboranternas insida av kinder för att samla in celler som sedan DNA ska utvinnas från. Bomullstoppsen får lufttorka för att undvika nedbrytande enzymer från saliv i 2h, och därefter stoppas bommulsänden ner i 400
µl PBS. Anledningen till att bomullstoppsen fick stå i PBS var för att så många celler som möjligt skulle släppa från bomulstoppsen. 400µl lyseringsbuffert tillsätts för att spränga cellkärnorna, och 20µl QIAGEN Protease tillsätts för att bryta ned kärnmembran och proteiner. Blandningen puls­mixas i 15s och inkuberas i 56
°
C i 10min. Anledningen till att provet inkuberas i just 56
°
C är för att QIAGEN Proteaset har störst reaktionsförmåga vid denna temperatur. 400
µl etanol tillsätts för att fälla ut DNA från lösningen som sedan pulsmixas innan 700µl av provet överförs i en QIAamp kolonn som centrifugeras 6000 x g i 1min. Vätskan i uppsamlingsröret hälls ut och resterande prov tillsätts. Provet centrifugeras åter i 1min och vätskan i uppsamlingsröret hälls ut. Syftet med dessa 2 centrifugeringar är att skilja DNA från lösningen på PBS, lyseringsbuffert AL, etanol och QIAGEN Protease. Detta för att DNA:et ska renas ytterligare genom att tvättas med tvättbuffert AW1. DNA:et tvättas med tvättbuffert AW1 genom att tvättbufferten hälls på och provet centrifugeras i 6000g i 1min. Vätskan i uppsamlingsröret hälls ut och tvättbuffert AW2 hälls på och provet centrifugeras i 3min för att bli av med all tvättbuffert som innehåller oönskade ämnen. QIAamp kolonnen placerades i ett rent 1,5ml eppendorfrör och 150µl elueringsbuffert tilsätts och inkuberas i 5min. Elueringsbufferten lösgör DNA:et från kiselmembranet i QIAamp kolonnen. Provet centrifugeras igen för att få ut DNA:et i eppendorfröret. Spektrofotometri Spektrofotometri utförs för att undersöka hur rent det utvunna DNA:et är och hur koncentretrat det är. Därför görs två mätningar, en med 260nm och en med 280nm. Med 260nm mäts koncentrationen DNA och med 280nm mäts renheten på provet. Renheten beräknas genom att räkna ut absorbanskvoten, Abskvot = 260nm ÷ 280nm . DNA­koncentrationen beräknas genom: A
260 * 50 * spädningsfaktorn, där spädningsfaktorn är 10. Proven späds till 1:10 med TE­buffert för att fylla ut kyvetterna till en volym av 1mL. Proven hålls som nämt i kyvetter som placeras i spektrofotometern. Ljus med längd av 260nm sänds genom provet och absorbansen mäts upp. Därefter sänds ljus med längd av 280nm genom provet och absorbansen mäts. PCR PCR(polymerase chain reaction) är en metod för att duplicera en utvald DNA­region. Metoden använder sig av cykliska temperaturskiftningar för att styra processen, där varje komplett cykel ger en fördubbling av mängden DNA. Tillväxttakten är alltså exponentiell och därför kan stora mängder DNA produceras relativt snabbt från en liten startmängd. Detta görs genom att denaturera DNA:et, alltså sära strandsen vid en temperatur på 94­98
°
C. Därefter tillsätter man en primer som binder in till en viss gensekvens för att “ringa in” vilken del av genen som ska dupliceras. Detta görs vid en temperatur på 37­65
°
C. Därefter höjs temperaturen till den optimala arbetstemperaturen, vilken är 72
°
C, för polymeraset som skapar en ny kopierad DNA­sträng. Temperaturen höjs åter till 94­98
°
C för att upprepa processen tills önskad mängd DNA erhållits. I detta specifika fallet upprepades processen 35ggr. I första processen använde vi en temperatur på 96
°
C. I andra processen krävde våra primers, MA090 och MA025, 60
°
C. MA090 och MA025 avgränsar DNA­regionen för en del av cystatin­C­genen. I tre rör tillsätts en PCR­blandning innehållande DNA, 5
µl polymeraset AmpliTaq Gold spädd 1:10 för att kopiera DNA, 1
µl var av
primers MA090 och
MA025 för att välja vilken region som skall kopieras, 2,5
µl vatten för att spä ut provet, 2µl dNTP(DeoxyNucleotide mix) som utgör byggstenarna till det nya DNA:et, 1µl DMSOsom underlättar inbindningen av primers, 2,5µl PCR buffert spädd 1:10 för att ge optimalt pH­förhållande för reaktionen. PCR­bufferten innehåller även MgCl
, som
är en 2
kofactor till polymeraset och underlättar för en fullständig denaturering av DNA. Utöver detta tillsätts 10µl DNA­koncentrat i två av rören och 10µl vatten i det tredje röret. Provröret inehållande vatten agerar blank. Klyvning med restriktionsenzym För att avgöra vilken genotyp en person har kan PCR­produkten klyvas med ett restriktionsenzym. Restriktionsemzymet försöker klyva på den sekvens som är utmärkande för ena genotypen men saknas i den andra. I detta fall används SacII och klyningsstället försvinner om basen G ersatts med A på den platsen. I fallet att SacII inte klyver på klyvningsstället påvisas att personen i fråga innehar B allelen. Om däremot SacII klyver på klyvningsstället är det en påvisning om att personen innehar A allelen. Det finns en möjlighet att vara heterocygot i detta fall. Det innebär att DNA biten klyvs delvis. Man kan genom gelelektrofores ta reda på om man är homocygot A, homocygot B eller heterocygot A/B. Ursprungssekvensen är 493bp och vid ett homozygot B­resultat kommer ingen klyvning att ske och endast ett DNA­band av storleken 493bp att kunna detekteras. Vid ett homozygot A­resultat kommer en total klyvning att ske, vilket resulterar i två DNA­band med storlekarna 350 respektive 143bp. Vid ett heterozygot resultat kommer tre band av storlek 493, 350 samt 143bp att återfinnas. Experimentellt blandades 12
µl PCR­produkt, 1,5µl buffert C spädd 1:10 samt 1,5 µl enzym SacII i ett eppendorfrör. Blandningen inkuberades i 37
°
C över natten. Gelelektrofores Gelelektrofores är en metod man kan använda för att separera DNA­fragment med avseende på storlek. Tekniken utnyttjar det faktum att DNA är negativt laddat genom att sätta en spänning över ett medium. DNA­fragmenten vandrar då genom mediet i riktning mot anoden med en hastighet beroende på deras storlek. Ju mindre fragment, desto snabbare vandrar det. Valet av medium avgörs av storleken på fragmenten. I detta fall används agaros, då det täcker storleken 100­70.000bp. Våra fragment förväntas kunna variera mellan 143­493bp i storlek. Ramen för gelgjutning sätts ihop. 1g agaros och 50mL TBE­buffert hälldes i en E­kolv och värmdes 2 x 30min i microvågsugn till lösningen blivit klar och ganska lättflytande. 5
µl SYBR safe DNA gel stain och den lösta gelen får en rödaktig färg. SYBR safe DNA gel stain tillsätts för att vid fotografering med UV eller blått ljus, kunna se var DNA­banden befinner sig. Lösningen hälls i ramen och ramen täcks med aluminiumfolie då SYBR safe DNA gel stain är ljuskänslig. Ramen får stå och stelna i ca 30min. Efter 30min monteras ramen isär och en fast gel av agaros, TBE­buffert och SYBR safe DNA gel stain har erhållits. Proven tillreds enligt tabell 1. Prov nr Prov Prov volym H
O 2
6 x Ficoll 1 Markör 10µl 5µl 3µl 2 Blank 10µl 5µl 3µl 3 Kontroll Allt (15µl) ­­ 3µl 4 PCR­produkt 1 10µl 5µl 3µl 5 Klyvning 1 ­­ 3µl 6 PCR­produkt 2 10µl 5µl 3µl 7 Klyvning 2 ­­ 3µl Allt (15µl) Allt (15µl) Tabell 1
: Mängder till tillredning av prov för elektrofores på agarosgel. Ficoll­lösning tillsätts till proven för att dels tynga ner proverna så de ej rinner ut i bufferten samt för att den ger en blå färg som vandrar lite snabbare än DNA­banden och påvisar ungefär hur långt elektroforesen har gått. Gelen läggs i elektroforeskärlet och TBE­buffert hälls på tills brunnarna täcks. Därefter adderas proverna till brunnarna med pipett. Proverna vandrar under 45minuter under 100 V spänning, och fotograferas därefter på UV­ljusbord. Resultat Resultaten för spektrofotometri återfinns i tabell 2. Kvoterna avviker något från optimalkvoten på 1,8 men är inte så pass avvikande att det skulle påvisa avsaknad av DNA. Koncentrationerna styrker även att det finns DNA i proven. Prov 260nm 280nm Kvot DNA konc(
µg/mL) ABS Johanna 0,0282 0,0180 1,567 14,1 ABS Kent 0,0210 1,910 20,05 0,0401 Tabell 2:
Resultat för spektrofotometriska mätningar av DNA koncentration och renlighet av prov vid 260nm och 280nm. Resultaten för gelelektrofores återfinns i bild 1. Det framgår tydligt ur klyvningsmönstret att båda laboranterna är av genotyp homozygot A. Bild 1: Prov fr. v. markör(1), blank(2), kontrol(3), PCR­produkt 1(4), klyvning 1(5), PCR­produkt 2(6), klyvning 2(7). Bilden är ett fotografi av agarosgelen efter elektroforesen. Gelen visar att både Johanna (klyvning 1) och Kent (klyvning 2) är homocygota A.
