Cellulär Immunomonitorering
Ola Winqvist
Cellulär Immunologi Idag
– Cellulär fenotypning CD4/CD8, CD19, CD56 NK celler
– Granulocytfunktion
– Stimuleringsassay
Kan Utföras
UTFÖRS
IDAG
Trender
Personlig medicin
Multiplex analyser
Diagnos/staging
Monitorering
Autoimmunitet
Nya Biologiska läkemedel förenar
SLE
Psoriasis
RA
IBD
Utveckling av Cellulära Analyser
Standardisering
Normalmaterial
Undersökningar hos sjuka
Undersökningar vid behandling
European COoperation in Science and Technology
European Network for Translational Immunology Research and Education
(ENTIRE):
From immunomonitoring to personalised immunotherapy
Funktionella tester
– Proliferations assay thymidin inkorperering
– Cytokin analys
– ELISA, ELISPOT, Intracellulära cytokiner
– Aktiveringsmarkörer
– Aktivering av intracellulära kinaser
FASCIA
F low-cytometric
A ssay for
S pecific
C ell-mediated
I mmune-response in
A ctivated whole blood
FASCIA
-flödescytometrisk proliferationstest
Dag 0
Heparinblod
+ medium +/antigen
Proliferation av T- och B-celler
Dag 7
+ FACS antikroppar
CD3, CD4 och CD19
+ lys
Aktivering av lymfocyter leder till blastformering
Naive cell
Lymfo blast
Ostimulerat
stimulerat
Ostimulerat
stimulerat
Stimuli
– Mitogen
–
–
–
–
–
PHA
Con A
Pokeweed (PWM)
Stafylokock enterotoxin A
Anti CD3
Concanavalin A
Concanavalin krosslinkar
methylmannoside receptorer
ConA
T
T
TCR
AKTIVERING
Medium kontroll
Con A
Pokeweed
PWM
Polyklonalt stimuli
– Aktiverar alla celler, tydliga svar
– Kraftigt stimuli
– Endast beroende av direkt effekt av
responder cell
TCR stimuli efterliknar fysiologiskt svar
Stimuli
– Antigen-specifika stimuli
–
–
–
–
Tetanus toxin
Varizella-zoster virus
Influensa virus
PPD
Antigen specifikt stimuli beroende
av antigen presenterande cell
APC
T cell
Protein
TCR
class II
Virus
Peptid
Tetanus toxin
PPD
Antigen specifikt stimuli
– Aktiverar specifika celler
– Fysiologiskt stimuli
– Beroende av antigen presenterande celler
Svar beroende av prekursor frekvens
Immuniserad
Naive
Adekvat svar
Inget svar
Andra tänkbara stimuli
–
–
–
–
–
Pneumokock
CMV, pp65
Candida
HIV antigen
………….
Referensvärden
CD4, celler/µL
CD8, celler/ µL
Stimulator
Medelvärde
Medelvärde
Ostimulerad
(bakgrund)
4
2
PHA*
3200
3500
PWM*
1200
370
PPD*
760
10
TT*
38
0
Candida*
863
14
Influenza A*
34
13
CMV*
200
30
HSV*
42
2
VZV*
100
3
Ostimulerat
Nyfödd flicka, få Boch T-celler.
Misstänkt Ommens
syndrom
Frisk pojke 2 år
Con A, polyklonalt stimuli
Nyfödd flicka,
misstänkt Ommens
syndrom
Frisk pojke 2 år
FASCIA analys lämpar sig för
samtidig cytokin analys
Naive cell
Lymfoblast
Cytokin
Principen för Bio-Plex Assay
Indikation för FASCIA
– Kommer ersätta Proliferations assay
– Misstänkt immunbrist med normalt antal
eller måttligt sänkt antal lymfocyter
– Misstanke om defekt svar mot spec agens
– Vaccinering av immunbrist patient
Multiplex immunfenotypning
Freiburg Normal
CD19+ B lymphocytes 4,7-15%
Freiburg 1
1. Naive B cells IgD+IgM+CD27-
47-84%
2. Marginal zone B cells IgD+IgM+CD27+ 6-29%
3. Switched memory cells B cells IgD-IgM-CD27+ 8-29%
Freiburg 2
4. CD38loCD21lo B cells 1.1-6.9%
Freiburg 3
5. Transitional B cells CD38++IgMhi
6. Plasmablast CD38++IgM-
0.5-3.5%
0.5-4.1%
Normalvärden 1mån-18 år
1
2-3 4-6 7-12
mån mån mån mån
1
år
2-5 6-10 1118
år
år
Naive
IgD+
CD27-
91-97
90-97
90-95
90-95
84-93
73-89
68-89
63-88
Margin
IgD+
CD27+
2-8
2-7
3-8
3-8
3-10
6-14
5-16
6-17
Switch
Memory
IgDCD27+
0.030.40
0.1-1
0.31.1
0.62.0
1.95.0
3-10.3
4-14
4-19
Freiburg CVID
Blood 2008
Sarcoid like (Granuloma + progressive T cell def
CD19+ B lymphocytes
Low <1% B cells
Grupp III
CD27+IgM-IgD- class switched memory cells
>0.4%
<0.4%
Grupp I (A+B)
CD19+CD21- immature B cells
>20%
Grupp Ia
<20%
Grupp Ib
Grupp II (C)
Cell Signaling Pathways
Multiplexed Phosphorylation-State
Intra-Cellular Flow Cytometry Technology
Source: P.O. Krutzik et al. / Clinical Immunology 110 (2004) 206–221
STAT5 fosforylering kan användas för SCID diagnostik
IL-2
JAK3
P
JAK3
P
P
P
PSTAT5
PSTAT5
STAT5
STAT5
Example:
Severe Combined
Immunodeficiency
(SCID) can have
different causes:
SCID-X1, gcdeficiency
JAK3 mutation
Use STAT5 (pY694) to
identify underlying
cause
P
P
STAT5 (pY694) In Normal Vs. SCID
Normal
SCID
STAT5 (pY694) in B cells: diluent (black), IL-2 x 10 min (green)
Utveckling av kinas profiler vid funktionell testning
Toll-like receptorer och patogen igenkänning
K. Takeda & S. Akira, Cell. Microbiol. 5: 143-53, 20
Toll-like receptor signalering
TRIF
Akira 2003
IRAK-4 brist
–
Nedsatt produktion av cytokiner
– IL-1b, IL-6, IL-12, TNF-a
–
Nedsatt produktion av
antikroppar mot polysackarider
–
Benägenhet för infektioner med
kapselförsedda bakterier
cytokiner
CBA Metod för multiplex kinas
kvantifiering
Y Y
Y
Y YY
Y
Y
Y
Y
Y
Y Y
Y Y Y Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Kulor
Anti kinas ak
Lysat
Y
Y
Y
Y
F
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
E
Y
Y
Y
Y
Y
ANALYSERA
Y
Y
Y
Y
Y
Y
+
TVÄTT
Y
Y
Y
D
Y
Y
Y
DETEKTOR
ANTIKROPPAR
Y
Y
C
Y
Y
Y
Y
Y
B
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
A
Y
Y
Bead Identification
Unika Pkinase
kulor
Bead Identification
1 2 3 4 5 6 78 9
A
B
C
D
E
F
G
H
I
CBA phosphoarray
Potentiella Kinas analyser vid
misstänkt immunbrist
–
–
–
–
Common gamma chain, JAK-3 (STAT-5)
TLR receptor signalering (MyD88, IRAK)
BCR signalering (BTK mm)
TCR signalering (lck, ZAP70 mfl)
Funktionell analys med
Calcium mätning
Calcium mätning
BCR
FLUO3
FLUO3
Calciummättning
BCR
Anti u
Ca2++
FLUO3
Anti m
CA FACS B cells
18
16
14
Fluo 3
12
10
WT
8
KO
6
4
2
0
1
41
81
121
tim e (s)
161
201
241
Immunosuppression
TCR
Th
Ca
Cyclosporin A
Calcineurin
Cyclophilin
-
P
NF-AT
IL-2
IL-2Ra
G0 arrest
Dynamisk Diagnostik
Inflammatorisk tarmsjukdom
Ola Winqvist M.D, Ph.D
69
17 maj 2011
Monitorering av cell aktivering
CD69
Ola Winqvist M.D, Ph.D
70
17 maj 2011
Biopsi undersökningar IBD
Aktiverade Th celler i tarmen vid Ulcerös Kolit
MFI
CD4+ T-cells
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Ola Winqvist M.D, Ph.D
Active UC (n=14)
Inactive UC (n=12)
Controls (n=11)
p=0.009
p=0.004
p=0.05
p=0.002
p=0.02
p=0.07
p=0.04
p=0.06
Terminal
ileum
Caekum
p=0.05
p=0.004
Left
Descending Sigmoid
flexure
colon
colon
Right
flexure
72
p=0.03
Rectum
17 maj 2011
Studier Dynamisk diagnostik IBD
– Glucocorticoid behandling
– TNF-a blockad
– ADA column
Ola Winqvist M.D, Ph.D
73
2011-05-17
Infektionsmarkörer
Ytmarkörer Neutrofiler CD64, CD16, HLA-DR
Cytokiner IL-1, IL6, IL-8
CRP
Tidsaspekter vid Neutrofil aktivering
CD64
CRP
Cytokinfrisättning
IL-1, IL6, IL-8
CD64 uppreglering på cellytan
vid infektion på monocyter och neutrofiler
CD64
"Center for Human Immunology (CHI)"
and the "FOCIS Centers of Excellence
(FCE) Immunophenotyping Technical
Meeting at NIH (FITMaN)“
Bethesda, MD 14./15. February 2011
Gating variabilitet
– Individualized gating account for the vast majority of interlab
variation (especially dim CD4 and CD8 cells)
Maecker HT et al., BMC Immunology, 2005
shared gating
central lab analysis
dynamic gates (available for some software)
difficult with rare populations
Test Panel- Standard Basic Panel
T cell
FITC
Treg
B cell
CD39
CD10
DC/mono/NK
Th1/2/17 (optional)
CXCR5
PE
CCR7
CD25
CD24
CD56
CXCR3
PE-Texas Red
Live/dead
Live/dead
Live/dead
Live/dead
Live/dead
PerCP-Cy5.5
CD4
CD4
CD19
CD123
CD4
PE-Cy7
CD45RA
CCR4
CD27
CD11c
CCR6
APC
CD38
CD127
CD38
CD16
CD38
APC-H7
CD8
CD45RO
CD20
CD3+19+20
CD8
V450
CD3
CD3
CD3
CD14
CD3
V500
HLA-DR
HLA-DR
IgD
HLA-DR
HLA-DR
Alexa 700
Red=not in Lyoplate
8-color cocktail would use Green Live/dead dye in FITC channel; 9+ color cocktail would use reagents in
red and/or other additions.
Lyophilized reagents
PBMC
isolation
Stimulation
lyoplate
Surface marker
stainining
lyoplate
• Standardization
• Reproducibility
• Highthroughput
Intracellular marker
staining lyoplate
Single-Cell Mass Cytometry of Differential
Immune and Drug Responses Across
a Human Hematopoietic Continuum
Sean C. Bendall, Erin F. Simonds, Peng Qiu, El-ad D. Amir, Peter O. Krutzik, Rachel
Finck,Robert V. Bruggner, Rachel Melamed, Angelica Trejo, Olga I. Ornatsky, Robert S.
Balderas, Sylvia K. Plevritis, Karen Sachs, Dana Pe’er, Scott D. Tanner, Garry P. Nolan.
SCIENCE VOL 332 6 MAY 2011
Next Generation Flow Cytometry
Idag: Fluorescens-baserad separation
Imorgon: Mass
spektrometri
Överlappning av emissionsspektra
Tydligt separerade markörer
Relativ kvantifiering
Absolut kvantifiering
MS-baserad immunfenotypning
Antikroppar
märkta med
specifika
metallisotoper
Nebulisera singel-cell droppar i masspektrometer
Analys av isotop-specifika m/z-värden för varje cell
13 biologiska X 24 cell populationer
stimuli
X 18
intracellulära
signalmolekyler
Celltyps-specifika
signaleringsmönster
Fosforylering av STAT-5 vid IL-7 stimulering
Framtidens analyser Cellulär Immunologi
Standardiserat
Evidens baserad
Multiplex
Snabbare
Sekvensning
Mindre prov volym
Billigare
Bioinformatik
Tolkningsstöd
Status
Funktionellt
Patogen specifikt
