IMAGEN Herpes Simplex Virus (HSV) K610611-2 SV Direkt immunofluorescenstest för detektion av HSV 1 och HSV 2. 1. AVSEDD ANVÄNDNING IMAGEN™ Herpes Simplex Virus typningstest är ett kvalitativt direkt immunofluorescenstest för detektion och typning av HSV 1 och HSV 2 i cellkulturer. 2. SAMMANFATTNING Herpes simplex virus är ett DNA-virus som innehåller en ikosaedral nukleokapsid omgiven av ett hölje som innehåller lipider. Humant HSV klassificeras inom familjen Herpesviridae och tillhör underfamiljen Alphaherpesvirinae. Genuset Simplexvirus innefattar två typarter av humant herpes simplex virus, HSV 1 och HSV 21. HSV är en vanlig och universell infektion hos människor och associeras med ett stort antal kliniska sjukdomar hos både immunokompetenta och immunokomprometterade individer. Både HSV 1 och 2 påträffas ofta i lokala vesikulära infektioner på hud, bindhinnor och slemhinnor i munnen och på könsorganen2,3,4. När den primära infektionen har upplösts kan viruset fortsätta att existera i latent form i nervvävnader och kan återuppträda under vissa förhållanden så att symtomen återkommer. Primära infektioner i det centrala nervsystemet kan leda till herpes encefalit som kan ha dålig prognos om de inte behandlas tidigt4,5. Primär infektion under sen graviditet kan leda till svår neonatal infektion. Dessa infektioner har hög morbiditetsoch mortalitetsfrekvens4,5. Direkta immunofluorescenstester, t.ex. IMAGEN Herpes Simplex Virus, som använder specifika monoklonala antikroppar utgör en snabb, sensitiv och specifik metod för detektion och differentiering av HSV 1- och HSV 2-isolat i cellkulturens monolager. IMAGEN Herpes Simplex Virus använder specifika monoklonala antikroppar för att detektera epitoper av HSVglykoproteiner som är specifika för antingen HSV 1 eller HSV 2. 3. TESTPRINCIP IMAGEN HSV-reagenser innehåller monoklonala antikroppar som konjugerats till fluoresceinisotiocyanat (FITC). Konjugerade antikroppar binds specifikt till konserverade epitoper av antingen HSV 1 eller HSV 2. Reagenserna används i en enstegig, direkt immunofluorescensteknik. Prov inkuberas med FITCkonjugerade antikroppsreagenser i 30 minuter. Sedan tvättas överflödig reagens av med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). De färgade områdena monteras och visas i mikroskop med hjälp av epifluorescensgenomlysning. Om Herpes Simplex Virus av typ 1 eller 2 är närvarande, syns en karakteristisk starkt äppelgrön fluorescens i kulturceller, i kontrast till den röda bakgrundsfärgningen av oinfekterade celler. Reagensen med vilken specifik fluorescens observeras indikerar om viruset är HSV 1 eller HSV 2. Tillkännagivanden De monoklonala antikroppar som användes i detta test tillverkades av Department of Pathology, University of Cambridge, Cambridge, Storbritannien. 4. DEFINITIONER Följande symboler produktinformationen. använts genomgående i Katalognummer Se bruksanvisningen N Hos immunokomprometterade patienter kan svåra och livshotande systemiska infektioner uppstå, ibland på flera organ5. Innehållet räcker till <N> tester Tillverkare Säker och effektiv antiviral terapi används vanligtvis för behandling av primär och återkommande HSV-infektion3,6. Därför är en snabb laboratoriediagnos av HSV viktig för att stödja vård och behandling av smittade patienter. Identifikation av HSV-typer spelar en viktig roll i undersökning och övervakning av smittade patienter4. De huvudsakliga diagnosmetoder som används innefattar isolering av livskraftiga virus i cellkulturlager som inokuleras med kliniska prov eller direkt detektion av virus eller virusproteiner i kliniska prov4,7. har Medicinsk apparat för in vitro-diagnostik Använd före Batchkod Temperaturbegränsning 5. MEDFÖLJANDE REAGENSER Isolering av HSV från kliniska prov kan genomföras i ett antal olika cellinjer inklusive diploida fibroblast, njurceller från kanin, veroceller och humana amniotiska celler, i vilka HSV replikerar snabbt och uppvisar en cytopatisk effekt7. 50 - Varje sats innehåller tillräckligt mycket material för att testa 50 förberedda cellkulturer. Flera tekniker har använts för att detektera och bekräfta identifiering av isolat och för att skilja mellan HSV 1 och HSV 2. Dessa innefattar DNA-hybridisering, restriktionsenzymanalys, neutraliseringstester och kultur i embrioniserade ägg4,7. Dessa tekniker kan vara komplexa, krävande och ofta illa anpassade för rutinmässig användning. 5.1. Immunofluorescenstester med HSV 1- eller HSV 2-specifika monoklonala antikroppar har beskrivits för identifiering och typning av HSV-isolat och för detektion av HSV i cellkulturer innan cytopatisk effekt (CPE) visar sig7,8,9. - Satsens hållbarhet står på etiketten på ytterförpackningen. INNEHÅLL I IMAGEN HSV-TEST Instruktion för användning 2 x 2 brunnpositiva kontrollobjektglas som innehåller acetonfixerade humana fibroblastceller som infekterats med antingen HSV 1 eller HSV 2. En flaska av var och en av följande: 3mL monteringsvätska. Monteringsvätskan innehåller en fotoblekningshämmare i glycerollösning (pH 10,0). 1,4mL IMAGEN HSV typ 1 reagens. Reagensen innehåller renade murinmonoklonala antikroppar specifika för HSV 1, konjugerade till FITC. Konjugaten förbereds i en proteinstabiliserad buffertlösning (pH 7,5) som innehåller Evans Blue färgämne som kontrastfärg och 15mmol/L natriumazid som konserveringsmedel. 1,4mL IMAGEN HSV typ 2 reagens. Reagensen innehåller renade murinmonoklonala antikroppar specifika för HSV 2, konjugerade till FITC. Konjugaten förbereds i en proteinstabiliserad buffertlösning (pH 7,5) som innehåller Evans Blue färgämne som kontrastfärg och 15mmol/L natriumazid som konserveringsmedel. 5.2. FÖRBEREDELSE, FÖRVARING OCH ÅTERANVÄNDNING AV SATSENS INNEHÅLL Alla oanvända komponenter i satsen bör förvaras i enlighet med nedanstående instruktioner för att säkerställa optimal prestanda. 5.3. POSITIVA KONTROLLOBJEKTGLAS Positiva kontrollobjektglas är individuellt förpackade i förseglade aluminiumförpackningar fyllda med kväve. Förvara oanvända objektglas vid 2-8°C. Objektglasförpackningar ska lämnas i rumstemperatur (15-30°C) i 5 minuter innan de öppnas. Färga objektglaset omgående efter öppning av förpackningen. 5.4. MONTERINGSVÄTSKA Klar för användning. Förvara oanvänd monteringsvätska vid 2-8°C. Monteringsvätska ska stå i rumstemperatur (15-30°C) i 5 minuter innan den används. / 5.5. REAGENS 1 OCH 2 Klar för användning. Förvara oanvänd reagens 1 och 2 vid 2-8°C. Reagenser 1 och 2 bör förvaras i mörker vid 2-8°C och ska stå i rumstemperatur (15-30°C) i 5 minuter före användning. 6. YTTERLIGARE REAGENSER 6.1. REAGENSER Aceton (för fixering). Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) pH 7,5 för tvätt av färgade prov och för provförberedelse. 6.2. TILLBEHÖR Allmänt Teflonbelagd glas objektglas med enkel 6mm diameter och (100 bilder per låda) kan erhållas från din lokala återförsäljare (kodnummer S611430-6). IMAGEN HSV Positive Control Slide (kodnummer S611030-2). För kulturbekräftelse Sterila bomullstoppar, virustransportmedium och en behållare för provtagning, transport och odling av HSV. Cellkulturlinjer rekommenderade för odling och isolering av HSV. 7. Erforderlig utrustning som ej medföljer Precisionspipett och engångsspetsar för tillförsel av 25µL Tvättbad Täckglas som täcker brunnen med 6mm diameter Icke-fluorescerande immersionsolja Epifluorescensmikroskop med filtersystem för FITC (max. exciteringsvåglängd 490nm, genomsnittlig emissionsvåglängd 520nm) och linser för x200 - x500 förstoring Inkubator inställd på 37 °C 8. FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER - För in vitro-diagnostik. Den som utför en analys med denna produkt måste vara utbildad i dess användning och ha erfarenhet av laboratorieprocedurer. 8.1. SÄKERHETSÅTGÄRDER 8.1.1 IMAGEN HSV reagenser innehåller 15 mmol/L natriumazid, som är ett gift. Natriumazid kan reagera med bly- och kopparinstallationer och bilda högexplosiv metallazid. Kassera alltid material som innehåller azid genom att spola med stora mängder vatten. 8.1.2 HSV på det positiva kontrollobjektglaset har befunnits vara icke-smittsamt i cellkultur. Objektglaset bör dock hanteras och kasseras som potentiellt smittsamt. 8.1.3 Evans Blue färgämne finns i reagensen. Ämnet kan vara cancerframkallande och kontakt med huden bör undvikas. 8.1.4 Var försiktig när du använder monteringsvätskan eftersom den kan orsaka hudirritation. Om kontakt sker, bör huden tvättas med vatten. 8.1.5 Du bör inte äta, dricka, röka, förvara eller laga mat eller sminka dig inom arbetsområdet. 8.1.6 Pipettera inte material med munnen. 8.1.7 Bär engångshandskar när du hanterar kliniska prov och infekterade celler och tvätta alltid händerna när du har arbetat med smittsamma material. 8.1.8 Kasta alla kliniska prov och reagenser i enlighet med lokal lagstiftning. 8.1.9 Ett datablad om säkerhet finns tillgängligt för professionella användare. 8.2. TEKNISKA FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER 8.2.1 Komponenter får inte användas efter det Använd före-datum som står på etiketterna. Blanda inte olika reagenssatser. 8.2.2 Reagenserna tillhandahålls med fasta arbetskoncentrationer. Testprestanda påverkas negativt om reagenser modifieras eller förvaras under andra förhållanden än de som anges i avsnitt 5. 8.2.3 Förbered ny fosfatbuffrad saltlösning (PBS) efter behov samma dag som den ska användas. 8.2.4 Undvik mikrobkontaminering av reagenser. 8.2.5 Reagenserna får inte frysas. 9. PROVTAGNING OCH FÖRBEREDELSE AV PROV Provtagning och förberedelse av prov är av fundamental vikt vid diagnos av HSV-infektion hos cellkultur. Prov måste tas från infektionsplatsen så att de innehåller så mycket infekterat material som möjligt. 9.1. KLINISKA PROV Provtagning Ta kliniska prov från infektionsplatsen. Sår och lesioner ska gnidas ordentligt med en vanlig bomullstopp för att få upp infekterade celler och exsudat från sårets eller lesionens bas. Blåsor ska öppnas försiktigt, vätskan sugas upp på bomullstoppen och lesionens bas gnidas med bomullstoppen. Bomullstopparna placeras i det virustransportmedium som används normalt och skickas till laboratoriet för bearbetning så snart som möjligt. Inokulering av cellkulturer Prov som tagits för diagnos av HSV-infektion ska inokuleras i de cellinjer som normalt används i laboratoriet i enlighet med etablerade laboratoriemetoder och regelbundet undersökas för cytopatisk effekt (CPE). Förberedelse av objektglas Om CPE som är förenlig med HSV-infektion observeras, ska cellkulturens monolager skördas när ca. 70% av cellerna är angripna. Skrapa ned cellagret i flytande odlingssubstrat med en steril pipett. Avlagra cellerna genom centrifugering vid 200g i 10 minuter vid rumstemperatur (15-30°C) och ta bort supernatantet. Tvätta cellerna genom att resuspendera cellavlagringen i PBS (se avsnitt 6.1) och upprepa centrifugeringen. Ta bort supernatantet och resuspendera cellavlagringen i en liten mängd ny PBS för att upprätthålla hög celldensitet. Placera 25µL alikvot av suspensionen i brunnar på teflonbelagda objektglas. Det krävs två brunnar per patientprov. Låt torka vid rumstemperatur (15-30°C) och fixera i ny aceton i 10 minuter vid rumstemperatur (15-30°C). Om provet inte färgas omedelbart, ska det sparas över natten vid 4°C eller frysas vid –20°C för längre perioder. 10. TESTPROCEDUR SE AVSNITT 8.2 TEKNISKA FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER INNAN DU UTFÖR TESTPROCEDUREN. 10.1. TILLSÄTTNING AV REAGENS 1 OCH 2 Tillsätt 25µL HSV 1-reagens till en 6mm diameter brunn med det fixerade cellpreparatet och 25µL HSV 2-reagens till den andra 6mm diameter brunnen med fixerat preparat (se avsnitt 9) eller tillsätt på det positiva kontrollobjektglaset. Se till att reagenserna täcker hela brunnområdet. 10.2. FÖRSTA INKUBERINGEN Inkubera objektglasen med reagens i en fuktig kammare i 30 minuter vid 37°C . Låt inte reagensen torka på provet, eftersom detta orsakar icke-specifik färgning. 10.3. TVÄTTNING AV OBJEKTGLAS Tvätta av överflödig reagens med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (se avsnitt 6.1) och tvätta sedan försiktigt objektglaset i ett omrörande bad som innehåller PBS i 5 minuter. Tappa av PBS och låt objektglaset lufttorka vid rumstemperatur (15-30°C). 10.4. TILLSÄTTNING AV MONTERINGSVÄTSKA Häll en droppe IMAGEN monteringsvätska i mitten av varje brunn och placera ett täckglas över monteringsvätskan och provet. Se till att inga luftbubblor förekommer. 10.5. AVLÄSNING AV OBJEKTGLAS Undersök hela 6mm diameter brunnområdet som innehåller färgade cellpreparat med hjälp av ett epifluorescensmikroskop. Fluorescens enligt beskrivningen i avsnitt 11 ska kunna ses vid x200-x500 förstoring. (För bästa resultat bör objektglas undersökas omgående efter färgning, men kan sparas vid 2-8°C, i mörker, i högst 24 timmar). 11. TOLKNING AV TESTRESULTAT 11.1. KONTROLLER 11.1.1 Positivt kontrollobjektglas Vid färgning och visning så som beskrivs i avsnitt 10 ska det positiva kontrollobjektglaset uppvisa fluorescerande celler med intracellulär äppelgrön fluorescens mot en bakgrund av kontrastfärgat material. Positiva kontrollobjektglas används för att kontrollera att färgningsproceduren har utförts korrekt. 11.1.2 Negativ kontroll Om ett negativt kontrollobjektglas behövs, rekommenderas oinfekterade celler av samma typ som användes för odling och isolering av HSV. Cellerna bör förberedas och fixeras så som beskrivs i avsnitt 9.1 och färgas så som beskrivs i avsnitt 10. 11.2. KLINISKA PROV 11.2.1 HSV-infekterade cellers utseende Infekterade celler uppvisar äppelgrön fluorescerande intracellulära cytoplasmiska granulat. Hos vissa infekterade celler kan denna karakteristiska cytoplasmiska fluorescens åtföljas av en “kanteffekt” som orsakas av färgning av cellmembranet. Oinfekterade celler färgas röda med Evans Blue kontrastfärg. 11.2.2 Tolkning En positiv diagnos görs när minst en fixerad färgad cell uppvisar det fluorescensmönster som beskrivs i avsnitt 11.2.1 med antingen HSV typ 1- eller HSV typ 2-reagens. Minst 50 celler i den cellkultur som testas bör kunna ses i varje objektglasbrunn innan ett negativt testresultat rapporteras. Se avsnitt 11.2.3 om det inte finns tillräckligt många celler. 11.2.3 Otillräckligt antal celler Om det inte finns tillräckligt många celler i objektglaspreparatet, ska återstoden av cellkulturen centrifugeras vid 200g i 10 minuter vid rumstemperatur (15-30°C). Resuspendera i en mindre volym PBS innan preparatet (25µL) fördelas igen på 6 mm diameter brunnen på ett teflonbelagt objektivglas enligt beskrivningen i avsnitt 9.1. Alternativt kan ett nytt kliniskt prov tas. 12. Begränsningar i utförandet 12.1. Använd endast monteringsvätskan IMAGEN HSV-testet. som medföljer 12.2. Fluorescensbildens utseende kan variera beroende på den typ av mikroskop och ljuskälla som används. 12.3. Alla reagenser tillhandahålls med fasta arbetskoncentrationer. Testprestanda kan påverkas om reagenserna ändras på något sätt, eller om de inte förvaras i enlighet med rekommendationerna i avsnitt 5. 12.4. 25 µL reagens bör användas för att täcka en 6mm diameter brunn. En mindre volym kan göra det svårt att täcka provområdet och kan minska sensitiviteten. 12.5. Om HSV inte detekteras, kan detta bero på faktorer som t.ex. provtagning vid fel tidpunkt under sjukdomens lopp, felaktig provtagning och/eller hantering av prov, misslyckande med cellodling, o.s.v. Ett negativt resultat utesluter inte möjligheten av HSV-infektion. 12.6. Testresultat bör tolkas tillsammans med information från epidemiologiska studier, klinisk utvärdering av patienten och andra diagnostiska procedurer. 13. FÖRVÄNTADE VÄRDEN Herpes simplex virus förekommer hos människor världen över och över 80% av den vuxna befolkningen i västländerna har haft en primär infektion som hos de flesta varit asymtomatisk10. Efter primär infektion får cirka 45% av individer med oral infektion och 60% av patienter med genital infektion återkommande herpesinfektioner3. HSV har isolerats från genitalområdet hos 0,3–5,4 % av män och 1,0–8,0% av kvinnor som har besökt en klinik för sexuellt överförda sjukdomar11,12. Patienter med okulär herpes simplex-infektioner är en av de största anledningarna till remittering till oftalmologiska kliniker.3 Vid symtomatisk primär eller återkommande infektion kan HSV-lesioner synas på huden, på slemhinnor i munnen, svalget, könsorganen eller ögat. Vid infektion hos spädbarn eller immunokomprometterade individer kan infektionen spridas till många områden, inklusive organ som lungor, hjärna, lever, mjälte, o.s.v. HSV kan odlas från vätska i vesikulära lesioner eller utsöndringar från infekterade områden (t.ex. ögon, svalg eller könsorgan). Dessutom kan HSV odlas från infekterad vävnad i disseminerad herpes, t.ex. hjärnbiopsi från patienter med herpes simplex encefalit. 14. SPECIFIK PRESTANDAKARAKTERISTIK 14.1. MONOKLONAL ANTIKROPPSREAKTIVITET MED HSV TYP 1 OCH 2 De monoklonala antikroppar som används i testet har visat sig reagera med typspecifika konserverade epitoper av antingen HSV 1 antigen eller HSV 2 antigen. 14.2. Specifika egenskaper IMAGEN HSV typningstest utvärderades vid ett kliniskt studiecentrum och resultaten jämfördes med restriktionsendonukleaslokalisering. Vid detta sjukhuscentrum togs prov från olika områden inklusive näsa, hals, tunga, mun, hud, bindhinnor, perineum, urinrör, penis, vulva, blygdläppar, vagina och äggstock från 187 patienter som besökte sjukhuset. Prov (bomullstoppar) placerades i transportmediet och transporterades till laboratoriet för cellodling och isolering av HSV. Vid studiecentret observerades alla 187 cellkulturer med mikroskop för typisk HSV-cytopatisk effekt och utvärderades med IMAGEN HSV-reagenser för att fastställa om HSV 1 eller HSV 2 var närvarande. HSV 1 bedömdes vara närvarande om en eller fler celler uppvisade typisk fluorescens med HSV 1-reagens. HSV 2 bedömdes vara närvarande om en eller fler celler uppvisade typisk fluorescens med HSV 2-reagens (se avsnitt 11). Detektion av HSV Av de 187 prov som utvärderades var 60 (32,1%) positiva enligt både referenskulturen och IMAGEN HSV-typningstestet (tabell 14.2.1). Av de positiva resultaten kom 55,0% från kvinnor och 45,0% från män. Fördelningen av positiva resultat enligt isoleringsområde för HSV var 83,3% genital, 13,3% oral och 3,4% från andra anatomiska områden. Av de positiva genitalproven var 40,0% HSV 1 och 60,0% HSV 2. Alla positiva orala prov var HSV 1. Positiva resultat uppnåddes med båda metoder i alla fall, vilket gav ett värde på 100% för korrelation, specificitet, sensitivitet samt positiva och negativa prediktionsvärden. Tabell 14.2.1 Jämförelse av testresultat från IMAGEN HSVtest och standardmetoder för cellkultur TEST Cellkultur IMAGEN HSV Antal prov RESULTAT Pos Neg Neg Pos Neg Pos 60 127 0 (32,1) (67,9) (0) ( ) Uttryckt som procent av alla analyserade prov. Pos Neg 0 (0) Typning av HSV 1 och HSV 2 Totalt 43 kulturisolat av HSV var tillgängliga för testning med IMAGEN HSV-testet och restriktionsendonukleaslokalisering (tabell 14.2.2). Positiva resultat uppnåddes med båda metoder i alla fall, vilket gav ett värde på 100% för korrelation, sensitivitet och specificitet. Tabell 14.2.2 Jämförelse av typning av HSV 1 och HSV 2 med IMAGEN HSV och restriktionsendonukleaslokalisering (REM) TEST REM IMAGEN HSV Antal prov RESULTAT HSV 1 HSV 2 HSV 1 HSV 1 HSV 2 HSV 2 23 20 0 (53,5) (46,5) (0) ( ) Uttryckt som procent av alla analyserade prov. HSV 2 HSV 1 0 (0) 14.3. KORSREAKTIVITET IMAGEN HSV-typningstest utfördes mot andra virus som lämpade sig för isolering i cellkultur från humanprov. Alla organismer som testades (tabell 14.3) var negativa med både IMAGEN HSV 1- och IMAGEN HSV 2-reagens. Tabell 14.3 Virus som testats med IMAGEN HSV-test och befanns vara icke-reaktiva Adenovirus 2,3,4 Cytomegalovirus Echo-virus 11 Epstein Barr-virus Herpes zoster Parainfluensa 1 Respiratorisk syncytialvirus 15. REFERENSER 1. Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L. and Brown F Classification and nomenclature of viruses. Fifth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Archives of Virology, Supplement 2, Spurger Velacy, New York, pp 103-106. Adams E. (1982) 2. 3. Herpes Simplex Virus infections. In Herpes virus infections: clinical aspects (ed. Glaser, R.) Marcel Dekker Inc., New York, pp 1-55. Longson M. (1990) 4. Herpes simplex. In principles and practice of clinical virology (eds. A.J. Zuckerman et al) John Wiley and Sons Ltd, pp 3-42. Corey L. and Spear P.G. (1986) 5. Infections with Herpes Simplex Virus Part 2. New England Journal of Medicine 314: No 12: 749 757. Peterslund N.A. (1991) 6. Herpes virus infection: An overview of the clinical manifestations. Scand. J. Infect. Suppl. 78: 15 20. Balfour H.H. (1987) 7. Acyclovir. In antimicrobial agents annual 2 (eds. Peterson, P.K. and Verhoef. J.) Elsevier Science Publishers, pp 315-329. Corey L. (1986) 8. Laboratory diagnosis of Herpes Simplex Virus infections. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 4: 1115 1195. Gleaves C.A., Wilson D.J., Wold A.D. and Smith T.E. (1985) Detection and serotyping of Herpes Simplex virus in MRC-5 cells using centrifugation and monoclonal antibodies 16 hours post inoculation. J. Clin. Microbiol. 21: pp 29. IFU X7851 reviderad oktober 2012 OXOID Limited, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, RG24 8PW, Storbritannien TEKNISK RÅDGIVNING OCH KUNDTJÄNST Ställ alla frågor till Oxoid lokala dotterbolag eller distributör.