Laboration i genteknik - IFM

IFM/Kemi
Linköpings Universitet
September 2007/LGM
Laboration i genteknik
Restriktionskarta av pCANTAB
Restriktionsklyvning samt separation av DNA-fragment mha agarosgelelektrofores
Material:
 pCANTAB (minst 35 L med konc. 100 ng/L)
 Restriktionsenzymer: EcoRI, BamHI samt HindIII med konc. 2U/L.
OBS! Förvaras hela tiden på is.
 10x Multi-Core restriktionsbuffert (M-C buffert)
 6x Laddningsbuffert (50 glycerol, 50 10xTBE + 0.25 BFB)
 Sterilt avjoniserat/destillerat vatten
 Molekylviktsstandard (Pharmacia: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 8, 10 kilobaspar)
 Sterila eppendorfrör samt automatpipettspetsar
 70 etanol
 Skyddshandskar
 Värmeblock
 Bordscentrifug
 Agaros
 10xTBE (1 L:108 g Tris, 7.2 g EDTA, 55 g Borsyra, pH 8.4)
 Etidiumbromid (0.5 g/mL i vatten) OBS! cancerogent, använd handskar!
1. Provberedning för restriktionsklyvning (totalvolym 20 L):
Prov nr.
1
Vatten
M-C buffert
p-CANTAB
Enzym



2
3
4
5
6
BamHI
EcoRI
HindIII
BamHI+EcoRI
BamHI+HindIII
HindIII+EcoRI
12 L
2 L
5 L
1 L
12 L
2 L
5 L
1 L
12 L
2 L
5 L
1 L
11 L
2 L
5 L
1 +1 L
11 L
2 L
5 L
1 +1 L
11 L
2 L
5 L
1 +1 L
Tillsätt lösningarna uppifrån och ner i tabellen samt blanda vid varje tillsats. Märk rören
väl!
Blanda och centrifugera i 15 sek.
Inkubera vid 37 C i 1 h.
Gjutning av agarosgel:
1. Väg upp 1 g agaros och lös i 100 mL 1xTBE.
2. Värm försiktigt i mikrovågsugnen tills lösningen är helt flytande (1 - 1½ min).
3. Låt lösningen svalna till ca 60 C och gjut agarosgelen ( ca 5 mm tjock).
4. Låt gelen svalna i minst 30 min.
Nu är det dags att börja med plasmidpreparationen!
Elektroforetisk separation av DNA-fragmenten
Provberedning för elektroforetisk separation på agarosgel:

Blanda 2 L laddningsbuffert med 10 L klyvd plasmid.

Blanda 2 L laddningsbuffert 2 L oklyvplasmid och 2 μL H2O.

Blanda 2 L laddningsbuffert med 5 μL molekylviktstandard och 5 L H2O.

Blanda 2 μL laddningsbuffert med 5 μL av den preppade plasmiden.
- Lägg agarosgelen i elektroforesapparaten och fyll på med 1xTBE, så att det täcker gelen.
- Applicera sakta och försiktigt proverna i provbrunnarna med en automatpipett. Kom ihåg att
notera var på gelen vilket prov appliceras.
- Separera DNA-fragmenten genom att lägga på en spänning motsvarande ca 10 V/cm.
(Kom ihåg att DNA är negativt laddat.)
- Avbryt separationen när BFB-markören har vandrat ca 2/3 ner på gelen.
- Färga in DNA-fragmenten med etiduimbromid (ca 10 min). Etidiumbromid som
interkalerar med DNA kan ses genom att belysa gelen med 300-360 nm ljus på en
transluminator.
Skydda ögonen genom att använda skyddsglasögen för att undvika grå starr i förtid! EtBr
cancerogent, använd handskar!
- Fotografera av gelen och mät vandringen av DNA-fragmenten med linjal.
Redovisning: Rita en graf där log baspar är avsatt mot vandringslängden för
molekylviktsstandardfragmenten.
Bestäm storleken (antal baspar) på fragmenten från klyvningen av pCANTAB samt bestäm
storleken på den oklyvda plasmiden
Sammanställ en restriktionskarta för pCANTAB med klyvningställenas relativa positioner.
Varför uppför sig inte oklyvd plasmid och enkelklyvd plasmid likadant på agarosgelen?
Preparation av plasmid
Material:
 25 ml Odlingskolvar
 LB-medium
 Ampicillin (stamlösning)
 Qiaprep spinnkolonnkitts
 Autoklaverade eppendorfrör och pipettspetsar
 Sterilt vatten
Utförande
Preparation av plasmid
För preparationen av plasmid kommer ett färdigt ”kit ” att användas (QiaPrep spinnkit). Detta
”kit” bygger på att plasmid DNA:t renas på en minikolonn där DNAt binds upp på en scilicagel.
Dagen innan plasmidpreparationen har övernattskulturer av E. Coli med den önskade plasmiden i
iordningställs. Odlingskolvar innehåller 10ml odlingsmedium och ampicillin. Till detta har satts
en bakteriekoloni, innehållande önskad plasmid, från en LB-Amp platta från en tidigare
transformation. Odlingarna har fått växa över natt i 37 C med skak. Den plasmid som preppas på
denna kurs kommer att användas till liknande laborationer på andra kurser längre fram!
1) Varje grupp fyller två 1,5 ml eppendorfrör med övernattskultur av E. coli med den plasmid
som ni ska preparera.
2) Centrifugera i bordcentrifug 10 000 rpm i 5 min
3) Sug av all supernatant med pasteurpipett alternativt dekantera.
4) Resuspendera pelleten i totalt 250 l (125 l i varje epp.rör) Buffer 1. Lös upp cellerna helt
och för samman de båda rören till ett.
5) Sätt till 250 l Buffer 2.
6) Blanda genom att vända röret ett par gånger, cell suspensionen ska klarna nästan omedelbart.
7) Tillsätt 350 l N3 buffer och blanda genast genom att vända röret några gånger. Det ska bildas
vita ”moln” i röret.
8) Centrifugera 13 000 rpm 10 minuter för att samla molnet på rörväggen.
9) Dekantera supernatanten ner i kolonnen. Inget vitt får följa med. (Det går också bra att använda
en pipett med steril pipettspets för att föra över supernatanten.) Se till att kolonnen sitter i ett
plaströr.
10) Centrifugera 13 000 rpm i 1 minut.
11) Tillsätt 750μl PE-buffer och centrifugera 13 000 rpm 1 min.
12) Häll bort bufferten från röret och centrifugera en gång till.
13) Flytta över kolonnen till ett rent (sterilt) eppendorfrör.
14) Tillsätt 50 l EB (elution buffer) och låt stå 1 minut.
15) Centrifugera 13 000 rpm 1 min. Glöm inte att använda skyddslocket på centrifugen, ifall
locket på epp. röret flyger av!
Plasmiden är nu eluerad och finns i epp.röret!
Återvänd till restriktionsklyvningen!
Renhet och kvalite på plasmiden anlyseras på agarosgel tillsammans med klyvningsprodukterna.
Redovisning: Enkelt flödesschema som visar vad som händer i de olika stegen och var de olika
komponenterna (celler, cellrester, kromosomalt DNA och plasmid) befinner sig.
Transformation av plasmid
Material:






Agarplattor med ampicillin
NZY+Broth
IPTG
X-Gal löst i DMF (Obs! Om du är gravid, låt någon annan hantera detta!)
Plasmid (färdig mutagenesprodukt)
Epicurian Coli XL1-Blue supercompetent cells
Utförande, värmechock:
1) Tina de superkompetenta XL1-blue cellerna portionerade i 50l:s portioner i fyra rör.
2) Till varje 50l:s portion av superkompetenta celler tillsätts 1l plasmid
3) Blanda försiktigt med pipetspetsen och inkubera på is 30 minuter.
4) ”Värmechocka” cellerna genom att placera rören i värmeblock 45 sekunder vid 42C, placera
sedan rören på is i 2 minuter.
5) Tillsätt 200l av förvärmt (42C.) NZY+Broth odlingsmedium och inkubera
transformationsreaktionen 1 timme i 37C.
6) Tillsätt 20μl 10%(w/v) X-gal och 20 μl 100nM IPTG till odlingen och sprid den på varm LBagar-amp-platta.
7) Dagen efter transformation (ca 16 timmar) kontrolleras mutagenesgraden. Beäkna (eller
uppskatta) andelen blå och vita kolonier på agarplattan.
Utförande, elektroporering:
1) Tina de elektrokompetenta cellerna på is och portionera upp 50μl i kylda eppendorfrör (ett rör
per grupp).
2) Tillsätt 1μl plasmid till varje portion.
3) För över cell-Plasmidblandningen till en kyld elektroporeringskyvett.
4) Elchocka cellerna genom att använda Ec2-programmet på elektroporatorn.
5) Tillsätt omedelbart 300μl förvärmt NZY+ - medium, för över till nytt eppendorfrör
inkubera i 37°C i 1h.
och
6) Sprid odlingen på LB-agar-amp-platta och låt växa över natt.
Redovisning: Beskriv hur de blå kolonierna uppkommer samt beräkna fraktionen blå/(blå+vita).
Vad säger detta om mutagenesens effektivitet?
Appendix
Restriktionsenzymer typ II
Hind III (Haemophilus influenzae Rd, 3:e)
Igenkänningssekvens (Palindromsekvens) samt klyvningsställe (▼)
5´A▼A G C T T 3´
3´T T C G A▼A 5´ (komplementära strängen)
BamHI
5´G▼ G A T C C 3´
3´C C T A C▼C 5´ (komplementära strängen)
EcoRI
5´G▼ A A T T C 3´
3´C T T A A▼C 5´
Samtliga enzym ger klyvning med "sticky ends" (single stranded overhang). Om
klyvningen sker på samma ställe bildas ”blunt ends” (utan single stranded overhang).