Övningsuppgift PCR-kloning
Du ska klona in en bit av sekevensen angiven nedan, som innehåller en del av en
coaktivator, i plasmiden pVP16. Se till att du får med minst 30 aminosyror från
coaktivatorn och att de kommer i rätt frame, dvs bildar ett fusionsprotein VP16.
A. Ange DNA sekvensen på två stycken primers som kan användas för att
amplifiera sekvensen med PCR och samtidigt få den flankerad av EcoRI och
HindIII sites. Primrarna ska vara designade så att coaktivatorn bildar ett
fusionsprotein med VP16 aktiveringsdomän efter inkloning i EcoRI och HindIII
siten i pVP16.
En plasmidkarta för plasmiden pVP16 finns nedan. Du har tillgång till cDNA
från celler som uttrycker coaktivatorn som kan användas som templat i PCRreaktioner. EcoRI klyver sekvensen GAATTC och HindIII AAGCTT.
Sekvensen som ska klonas:
P V N K D V T L T S P L L V N L L Q
tcccagtcaataaggatgtcacgctaacgagcccattgttggtcaacttattgcag
S D I S A G H F G V N N K Q N N T N A
agtgacatatctgcaggccattttggggtaaacaataagcaaaataataccaacgca
B. Beskriv dessutom moment som måste utföras för att klona in PCR-produkten
i de angivna siten i vektorn.
Plasmidkarta pVP16
SVAR
A
Primer 1 (forward) med EcoRI site:
GATCGAATTCCCAGTCAATAAGGATGTCAC
De två första baserna från coaktivatorsekvesen är inte med i primern för att
coaktivatorn och VP16 aktiveringsdomän ska hamna i samma reading-frame efter
inkloning i pVP16.
Primer 2 (reverse) med HindIII site och ett stoppkodon (rött):
GATCAAGCTTCTATGCGTTGGTATTATTTTGCT
Det finns även stoppkodon i pVP16 så det är inte helt nödvändigt med ett extra i
primern men det gör att inga extra kodon från MCS translateras.
Efter kloning blir sekvensen vid EcoRI sitet följande:
G
E
F
P
V
N
GGG GAA TTC CCA GTC AAT
VP16
AA455
EcoRI
coaktivator
B
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
PCR med primers som ovan och cDNA som templat.
Rena PCR-produkten och klyv den och pVP16 med EcoRI och HindIII.
Defosforylera den klyvda vektorn.
Värmeinaktivera enzymerna.
Ligera klyvd vektor med klyvd PCR-produkt.
Transformera E. coli med ligeringarna och låt växa på LB-AMP plattor.
Starta övernattskulturer.
Rena fram plasmid-DNA från bakteriekulturen.
För att testa om kloningen fungerade kan en del av plasmidpreppen klyvas
med t ex EcoRI och HindIII och analyseras mha agarose gel elektrofores.
