2012-04-27
Översikt
DNA-labb / Plasmidlabb
• Varför är vi här idag?
Preparation och analys av
plasmid-DNA från Escherichia coli
• Vad skall vi göra idag?
– Kort introduktion till biokemi och rekombinant
DNA- teknologi
– Genomgång av protokollet
• Hur skall vi lära oss något?
– Genomgång av hur resultaten analyseras.
/
Biokemi och biofysik
• Vi försöker få molekylär förståelse för
biologiska system.
– Ex: DNA/RNA, proteiner, små molekyler (ATP).
• En viktig del är proteiners funktion och
struktur. Varför?
• Både akademi och industri.
– Grundforskning; fundamentala frågor.
– Koppling till fysiologiska tillstånd.
– Läkemedel.
Vanlig bakterie för produktion av proteiner:
Escherichia coli
Bakterier – vad har de med oss att
göra?
• Ger oss sjukdomar, men vi klarar oss inte utan
dem.
• Senaste decennierna: Bakterier är i vår tjänst
som proteinfabriker.
• Plasmid-DNA
– Kan modifieras av oss och tas upp av bakterien.
– Möjligt att göra förändringar i proteinet, byta ut
aminosyror.
– Produktion av det protein som plasmidgenen
kodar för.
Några bilder av E. coli
Medsols, från ö.v: Odling på platta; elektronmikroskopi (EM); genom; EM, tillsammans med Bacillus megaterium.
• Finns naturligt i
mag/tarmkanalen
• Vissa varianter kan orsaka
diarre & urinvägsinfektion
• Enkel att jobba med, växer
snabbt
• Enkel att modifera
genetiskt, plasmider
• Uttrycker stora mängder
protein
1
2012-04-27
Från DNA till protein
Transkription: En gen i
DNA-molekylen skrivs
om till RNA.
Translation: I ribosomen
byggs ett protein upp
efter RNA-ritningen.
Vad är plasmider?
Vad ska vi göra idag?
• Isolera och analysera plasmid-DNA från E. coli
genom att:
– Extrahera plasmid-DNA från E.coli celler
– Klyva plasmiden med restriktionsenzymer
– Analysera de kluvna fragmenten med agarosgelelektrofores
Hur uttrycker man ett främmande
protein i en bakterie?
• plasmider är en sorts DNA-molekyler som är
separata från bakteriens egen kromosom
•Klona/kopiera genen
• cirkulära och icke-essentiella (inte nödvändiga
för bakteriens överlevnad)
•Klyv plasmiden
•PCR (Polymerase Chain Reaction).
• små
-några tusen baspar långa
-fåtal gener
•Restriktionsenzymer (så att genen kan
sättas in i plasmiden).
•Ligera (klistra ihop) ihop fragmenten
•Enzymet Ligas
• när vi använder dem innehåller plasmiden
(oftast):
•Sätt in plasmiden med genen i en bakterie
•Analysera
-gen som kodar för det protein vi vill ha
-gen/gener som kodar för
antibiotikaresistens
•Rätt plasmid med rätt gen i bakterien?
•men plasmider finns också naturligt i bakterier
Först: Innehåller alla bakterier i
odlingen en plasmid?
Ja! Bakterien växer i närvaro av
antibiotikan ampicillin, och i
plasmiden finns en gen som kodar
för antibiotikaresistens.
•Alltså: Bara de bakterier som har en
plasmid överlever...
Vi måste isolera plasmiden och analysera
den.
Restriktionsenzymer
• Känner igen och klyver DNA
• specifika symmetriska sekvenser
• Finns i bakterier
•försvar mot främmande DNA (virus).
• Ger upphov till,
a) blunt ends (ex AluI)
b) sticky ends (ex BamHI)
...men sitter genen vi vill titta på i
plasmiden?
2
2012-04-27
Agarosgelelektrofores
Hur ska vi kunna se vårt DNA?
Traditionellt: etidiumbromid
• Agaros
Major groove
– Socker från alger som bildar polymer så att gelen
stelnar
Ladda proverna i varsin
brunn. DNA har en
nettoladdning på minus.
Lägg på elektrisk spänning.
DNA:t kommer att vandra
mot pluspolen.
Efter ca 45 minuter har
DNA-fragmenten rört sig
lagom långt genom gelen.
Etidiumbromid
•binder till DNA
•fluorescerar i UV-ljus
•starkare när det är bundet till DNA
MEN: Etidiumbromid är mycket
mutagent och binder till allt DNA!
Dessutom: Kan ta sig igenom
cellmembran.
Därför använder vi GelRed, en
molekyl (hemlig struktur) med
liknande fluorescensegenskaper,
men passerar inte cellmembran.
Vi blandar GelRed direkt i agarosgelen.
/
Hur ska vi kunna analysera vårt DNA?
Referens – DNA-stege
DNA-fragment med kända storlekar
•körs bredvid prov
Labben
•se ungefärlig storlek av vårt DNA
DNA-storlek anges i baspar (bp) eller i kilobaspar (Kb)
B
Storleks
Referens
Utförande
Vandringssträcka (mm)
-
A
+
”Plasmidprepp” dvs isolering av plasmid
P1
1
2
Skaka
• Buffert
• Tillsätts i ett eppendorf rör med E. coli
• RNAser
– RNA bryts ner
3
Centrifugera
Sup
Pellet
4
Pellet av bakterier som
innehåller plasmiden
/
3
2012-04-27
P2
• Lyseringsbuffert
N3
• Ättiksyra
– NaOH, Natriumhydroxid
• Basiskt
– Neutraliserar pH
• Salt
– Sodium Dodecyl Sulfat
• Löser upp membranet
• Tillsätt P2 i eppendorfröret som
innehåller E. Coli och P1. Blanda!
– Fäller ut proteiner, genomiskt (E. colis eget) DNA
och det nedbrutna RNAt från P1
• Tillsätt N3 i eppendorfröret som innehåller E.
Coli, P1 och P2. Blanda!
/
/
Separera plasmiden
Centrifugera
• Balansera rören
• Flera grupper kör tillsammans
• Spara supernatant (Sup) = lösningen ovanpå
– DÄR FINNS PLASMIDEN!
• Pellet = det fasta i botten (Vit)
– Fällda proteiner
– Genomiskt DNA
– Nedbrutet RNA
/
/
Tvätta kolonnens filter
Eluera plasmiden
• Centrifugera kolonnen
– Plasmiden fastnar i filtret i kolonnen
– Släng vätskan som gått igenom
• Buffert PB
– Tvättar bort proteiner
– Centrifugera
– Släng vätskan som gått igenom
• Vatten (för eluering)
–
–
–
–
Byt kolonnens uppsamlings rör till ett nytt eppendorf rör med lock
Tillsätt vatten och låt stå/inkubera 1 min
Centrifugera
Plasmiden finns nu i eppendorfröret, löst i vatten. SPARA DENNA
LÖSNING!
• 4 mikroliter (ml) eluerad plasmid förs över till
restriktionsenzym-mixer A, B och C
• Buffert PE
– Centrifugera
– Tvättar bort salt
– Centrifugera
– Släng vätskan som gått igenom
• Inkubera 5 minuter i vattenbad
– Klyvning av plasmiden
/
/
4
2012-04-27
BglII
Klyvning av plasmid-DNA
Restriktionsenzym-mix A, BglII:
gen
gen
plasmid
BglII
Klyvning av plasmid-DNA
gen
plasmid
plasmid
5´GAATTC3´
3´CTTAAG5´
gen
BglII
EcoRI
plasmid
gen
EcoRI
5´AGATCT3´
3´TCTAGA5´
Restriktionsenzym-mix C, BglII och EcoRI:
gen
5´GAATTC3´
3´CTTAAG5´
Restriktionsenzym-mix B, EcoRI:
BglII
plasmid
EcoRI
Klyvning av plasmid-DNA
5´AGATCT3´
3´TCTAGA5´
gen
EcoRI
plasmid
Tillsätt provpåsättningsbuffert
Analysera med gelelektrofores.
Separerar DNA fragment med avseende på storlek.
plasmid
gen
EcoRI
gen
EcoRI
plasmid
plasmid
Analys med agarosgelelektrofores
• Fluorescerande band i
UV ljus är GelRed
bundet till DNA
• Foto av gelen
• Stege med kända
storlekar av DNA
• Jämför era band med
stegens band.
A
B
DNADNA- stegeC stege mall
/
5
