Examensarbete i kemi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
En ny uppreningsmetod för DNA
Jenny Rhodin
Tänk att du ska blanda till en dressing. Du tar olja, vatten och någon krydda, men även om du
blandar ordentligt kommer oljan och vattnet dela upp sig. Det har bildats ett två-fassystem.
Vissa av kryddorna kommer att vilja blanda sig med oljan och andra föredrar vattnet.
I mitt projekt har jag använt mig av andra vätskor som bildar två faser för att rena upp
genetiskt material från bakterier. Det genetiska materialet jag vill rena fram kallas plasmidDNA. Detta är en kedja av genetiskt material som sitter ihop som en ring och som bara finns i
bakterier. När man tar sönder bakteriecellerna kommer plasmid-DNA att blandas tillsammans
med allt annat som finns i cellerna. I mitt två-fassystem vill jag att plasmid-DNA ska fördela
sig till toppfasen och att alla andra cell komponenter ska fördela sig till bottenfasen.
Det är viktigt att kunna få fram rent plasmid-DNA eftersom det kan användas vid genterapi.
En person som lider av en sjukdom som beror på ett fel i en gen kan få behandling genom att
den korrekta genen förs in i kroppen och ersätter den skadade. Plasmid-DNA kan tillverkas så
att den innehåller den speciella genen. Det är viktigt att plasmiderna som förs in i kroppen är
rena, så att inga andra delar från bakteriecellen följer med, eftersom dessa kan vara skadliga
för hälsan.
I mitt projekt har jag visat att det är möjligt att effektivt kunna rena upp plasmid-DNA med
hjälp av två-fassystem.
Swedish official title: Primär upprening av plasmid DNA i termoseparerande två-fas system
Swedish credits: 20p
E-mail address of first author: [email protected]
Supervisor: Folke Tjerneld, Cecilia Kepka, Per-Olof Larsson, Per-Erik Gustavsson,
Biochemistry, Pure and Applied Biochemistry
Submission date/time: 2003-03-07
Examensarbete i kemi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Primary Purification of Plasmid DNA in Thermoseparating Aqueous
Two-Phase systems
Jenny Rhodin
Chemistry, Biochemistry
Autumn 2002
Abstract in English
The rapid development of gene therapy and DNA vaccination has increased the need for
production of large quantities of plasmid DNA with high purity. In this work a 6 kb plasmid
has been partitioned in an aqueous two phase system composed of the thermoseparating top
phase co-polymer ethyleneoxide-propyleneoxide (EO50PO50) and the bottom phase polymer
dextran. To get an optimal partitioning the polymer concentrations were varied and different
salt additives were tested. The best system evaluated was 4.5% EO50PO50 / 4.5% dextran with
50 mM Na2HPO4 as salt additive. The plasmid DNA partitioned to the thermoseparating top
phase in the first system. When the top phase was heated over its cloud point (55ºC) the
EO50PO50 becomes insoluble in water and a polymer enriched bottom phase and a water top
phase is formed. All plasmid DNA partitioned to the water phase. The different phases were
analysed using chromatography and fluorescence with PicoGreen, a double stranded DNA
binding fluorescence dye. The calculated yield, using different methods, was 90-100 % in the
thermoseparated top phase. About 40% of the proteins were removed as well as half of the
RNA.
