TFKE32/TFKI09/LSKEC3
Laboration i Genteknik
Denna laboration består av tre delar:
A.
Restriktionsklyvning av plasmiden pCANTAB samt konstruering av
restriktionskarta.
B.
Preparation av plasmiden pCANTAB
C.
Transformering av β-galactosidas innehållande plasmid till E. Coli
A. Restriktionskarta av pCANTAB
Restriktionsklyvning samt separation av DNA-fragment
Material:
pCANTAB (minst 35 μL med konc. 100 ng/μL)
Restriktionsenzymer: EcoRI
BamHI
HindIII
Samtliga med konc. 2 U/μL. OBS! Förvara på
is hela tiden!
NEB buffert
Laddningsbuffert med färgmarkörer
Sterilt avjoniserat/destillerat vatten
Molekylviktsstandard (10, 8, 6, 5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5,
0.25 kilobaspar)
Sterila eppendorfrör och pipettspetsar
70 % etanol
Skyddshandskar
Värmeblock
Bordscentrifug
Agaros
10x TBE (1 L: 108 g Tris, 7.2 g EDTA, 55 g Borsyra, pH 8.4)
Etidiumbromid (0.5 μg/mL i vatten) OBS! Cancerogent! Använd
handskar.
1. Provberedning för restriktionsklyvning
Totalvolym: 20 μL
Prov nr
1
BamHI
Vatten
NEB buffert
pCANTAB
Enzym
12 μL
2 μL
5 μL
1 μL
2
3
4
5
6
EcoRI
HindIII
BamHI+EcoRI
BamHI+HindIII
HindIII+EcoRI
12 μL
2 μL
5 μL
1 μL
12 μL
2 μL
5 μL
1 μL
11 μL
2 μL
5 μL
1 + 1 μL
11 μL
2 μL
5 μL
1 + 1 μL
11 μL
2 μL
5 μL
1 + 1 μL
-
Tillsätt lösningarna uppifrån och ner i tabellen samt blanda vid varje
tillsatts. Märk rören väl!
-
Blanda och centrifugera i 15 sek.
-
Inkubera i 37ºC, 1 h.
2. Gjutning av agarosgel
-
Väg upp 1 g agaros och lös i 100 mL 1xTBE
-
Värm försiktigt i mikrovågsugn tills lösningen är helt flytande (1-1½ min).
-
Låt lösningen svalna till ca 60ºC och gjut sedan agarosgelen (ca 5 mm
tjock).
-
Låt gelen svalna i minst 30 min.
Nu är det dags att börja med plasmidpreparationen!
3. Provberedning för elektroforetisk separation på agarosgel
-
Blanda 2 μL laddningsbuffert med 10 μL klyvd plasmid.
-
Blanda 2 μL laddningsbuffert, 2 μL oklyvd plasmid och 2 μL H2O.
-
Blanda 2 μL laddningsbuffert med 5 μL molekylviktstandard och 5 μL H 2O.
-
Blanda 2 μL laddningsbuffert med 5 μL av den preparerade plasmiden.
4. Elektroforetisk separation av DNA-fragmenten
-
Lägg agarosgelen i elektroforesapparaten och fyll på med 1xTBE så att
det täcker gelen.
-
Applicera sakta och försiktigt proverna i provbrunnarna med en
automatpipett.
-
Separera DNA-fragmenten genom att lägga på en spänning motsvarande
ca 10 V/cm. (Kom ihåg att DNA är negativt laddat).
-
Avbryt separationen när färgmarkörerna är separerade på gelen.
-
Färga in DNA-fragmenten med etidiumbromid (ca 15 min). Avfärga sedan
gelen i vattenbad (ca 15 min) Etidiumbromid som interkalerar med DNA
kan ses genom att belysa gelen med 300-360 nm ljus på en
transluminator.
-
Fotografera gelen och mät vandringen av DNA-fragmenten med linjal.
Redogörelse
Rita en graf där log baspar är avsatt mot vandringslängden för
molekylviktsstandard-fragmenten. Bestäm storleken (antal baspar) på
fragmenten från klyvningen av pCANTAB samt bestäm storleken på den
olkyvda plasmiden. Sammanställ en restriktionskarta för pCANTAB med
klyvningsställenas relativa positioner.
B. Preparation av plasmid
Material: Falconrör med bakteriepellet
Qiaprep skinkolonnkit
Autoklaverade eppendorfrör och pipettspetsar
Sterilt vatten
Utförande
För preparationen av plasmid kommer ett färdigt kit att användas (Qiaprep
spinnkit). Detta kit bygger på att plasmid DNAt renas på en minikolonn där DNAt
binds upp på en silicagel.
Dagen innan plasmidpreparationen har övernattskulturer av E. Coli med den
önskade plasmiden i iordningställts. Odlingsrör innehåller 10 mL LB-medium och
ampicillin. Till detta har satts en bakteriekoloni, innehållande önskad plasmid från
en LB-Amp-agarplatta från en tidigare transformation. Odlingarna har fått växa
över natt i 37 ºC med skak. Den plasmid som preppas på denna kurs kommer att
användas till liknande laborationer på andra kurser längre fram!
1. Varje laborationsgrupp erhåller ett falconrör med bakteriepellet.
2. Resuspendera pelleten i totalt 250 μL Buffer P1. Lös upp cellerna helt och
för över suspensionen till ett eppenforfrör.
3. Sätt till 250 μL Buffer P2.
4. Blanda genom att vända röret ett par gånger, cellsuspensionen blir blå
och ska klarna nästan omedelbart.
5. Tillsätt 350 μL Buffer N3 och blanda genast genom att vända röret
försiktigt några gånger. Det ska bildas en vit fällning i röret och lösningen
ska bli färglös.
6. Centrifugera 13 000 rpm 10 min för att samla fällningen på rörväggen.
7. Dekantera supernatanten ner i kolonnen. Inget vitt får följa med, (det går
också bra att använda en pipett med steril pipettspets för att föra över
supernatanten) se till att kolonnen sitter i ett plaströr.
8. Centrifugera 13 000 rpm i 1 min.
9. Häll bort vätskan från röret. Tillsätt 750 μL PE Buffer och centrifugera 13
000 rpm i 1 min.
10. Häll bort bufferten från röret och centrifugera en gång till.
11. Flytta över kolonnen till ett rent (sterilt) eppendorfrör.
12. Tillsätt 50 μL sterilt vatten och låt stå 1 min.
13. Centrifugera 13 000 rpm 1 min. Glöm inte att använda skyddslocket på
centrifugen, ifall locket på eppendorfröret flyger av!
Renhet och kvalitet på plasmiden analyseras på agarosgel tillsammans med
klyvningsprodukterna.
Återvänd till restriktionsklyvningen!
Redogörelse
Enkelt flödesschema som visar vad som händer i de olika stegen och var de
olika komponenterna (celler, cellrester, kromosomalt DNA och plasmid) befinner
sig.
C. Transformation av plasmid
Material:
LBA-agarplattor
LBAX-agarplattor
LBAI-agarplattor
LBAXI-agarplattor
LB-medium
IPTG
Plasmid (innehålland genen för β-galactosidas)
Epicurian Coli XL1-Blue competent cells
Utförande, värmechock
1. Tina de superkompetenta XL1-Blue cellerna.
2. Till en 50 μL portion av superkompetenta celler tillsätts 1 μL plasmid.
3. Blanda försiktigt med pipettspetsen och inkubera på is 30 min.
4. ”Värmechocka” cellerna genom att placera rören i ett värmeblock 45 sek
vid 42ºC, placera sedan rören på is i 2 min.
5. Tillsätt 200 μL av förvärmt (37ºC) LB odlingsmedium och inkubera
transformationsreaktionen 1 timme i 37ºC.
6. Sprid ut transformationsreaktionen på varm en agarplatta.
7. Dagen efter transformationen (ca 16 h) kontrolleras plattorna. Uppskatta
andelen blå och vita kolonier på agarplattorna.
Redogörelse
Beskriv varför ni ser kolonier och även hur de blå kolonierna uppkommer samt
kortfattat principen för ”värmechockning”.
Appendix
Restriktionsenzymer typ II
Igenkänningssekvens (palindromsekvens) samt klyvningsställe (▲▼)
HindIII (Haemophilus influenzae Rd, III)
▼
5'
3'
A
T
A
T
G
C
C
G
T
A
T
A
3'
5'
▲
BamHI
5'
3'
▼
G G
C C
A
T
T
A
C C
G G
▲
3'
5'
A
T
T
A
T
A
3'
5'
EcoRI
5'
3'
▼
G A
C T
C
G
▲
Samtliga enzymer ger klyvning med “sticky ends” (single stranded overhang).
Om klyvningen sker på samma ställe bildas ”blunt ends” (utan single stranded
overhang).
Laborationsredogörelsen ska innehålla inledning, metodbeskrivning, resultat,
diskussion och felkällor. Häfta fast försättsbladet på rapporten och lämna den i
angiven låda på kurslabb Svedberg. Rapporterna återfås på samma ställe.
Redogörelsen ska vara inlämnad senast dagen innan tentamen och vara
godkänd två veckor senare.
