Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
DUGGA
Molekylärbiologi T3 / HT06
2006-09-15
44 p (G = 24 p)
KORTSVARSFRÅGOR
1. Restriktionsenzymet HindIII klyver sekvensen 5´-AAGCTT-3´ och lämnar ett fyra
basers 5´-överhäng. Rita ut hur DNA-ändarna ser ut på ett fragment som klyvts med
HindIII. (2p)
SV:
5’-A
3’-TTCGA 5’
5’-AGCTT-3’
A-5’
2. Vilken enzymatisk aktivitet har Ribonuclease A (RNaseA) och vad är dess
vanligaste användningsområdet? (2p)
SV: Klyver RNA efter pyrimidiner (C och U) och det används ofta för att bryta
ned RNA vid rening av plasmid-DNA.
3. Varför har en PCR-primer med högt GC-innehåll högre smältpunkt än en lika lång
primer med lägre GC-innehåll. (1p)
SV: Guanine och cytosine basparar med tre väte-bindningar medan adenine och
thymine endast med två. Därför binder en primer med högt GC-innhåll starkare
till templatet vilket ger en högre smältpunkt.
4. Why is it important to use an internal control in real time PCR (qPCR) (2p).
För att kunna normalisera olika prover.
5. Ge exempel på två olika reportervektorer, rita gärna figur. (3p)
SV: Promotorlös reportervektor för test av promotorfunktion, reportervektor
med promotor för test av regulatoriskt element eller enhancers.
1
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
DUGGA
Molekylärbiologi T3 / HT06
2006-09-15
44 p (G = 24 p)
6. Vilken är den vanligaste transfektionsmetoden? (1p)
Katjoniska lipider
7. Name 2 ways of detecting gene expression in tissue? (1p)
Either
- Northern blotting
- RT-PCR
- Real time PCR
- Microarray/Affymetrix/cDNA arrays
8. (a) Vad innebär positiv och negativ kontroll av genreglering? (b) Vilken av dessa är
vanligast i eukaryoter respektive prokaryoter? (3p).
SV: (a) positiv kontroll är att specifikt stimulera RNA syntes via en aktivator och
negativ kontroll är att specifikt inhibera RNA syntes via en repressor (b) positiv
kontroll är vanligast i eukaryoter och negativ kontroll i prokaryoter.
9. Hur påverkar co-repressorer med associerande proteiner kromatinstrukturen (1p).
SV: Deacetylerar histoner.
10. Det finns fyra typer av icke-kovalenta interaktioner som är involverade i proteinprotein bindning i celler. Vilka? (2p).
Answer:
• Hydrogen bonds/interactions
• Electrostatic bonds/ Ionic bonds
• Van der Waals attractions
• Hydrophobic Interactions (force)
2
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
DUGGA
Molekylärbiologi T3 / HT06
2006-09-15
44 p (G = 24 p)
11. In which drug development phase is the drug candidate tested in humans for the
first time? (1p)
Answer: Phase I
12. Beskriv kortfattat hur Cre/loxP systemet fungerar. (3p)
SV. Cre/loxP systemet är utvecklat från bakteriofag P1 och används ofta för att
göra konditionella knockouter. Cre är ett enzym, ett recombinase, som orsakar
rekombintion mellan två loxP sites (en 34 bp lång sekvens). Detta resulterar i att
sekvensen mellan två loxP sites avlägsnas och endast ett loxP site blir kvar.
13. Why do you get “footprints” after digestion with DNAse I when proteins are
bound to the DNA. (3p)
Because the proteins protect the DNA from the digestion which results in “holes”
in the fragment ladder.
3
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
DUGGA
Molekylärbiologi T3 / HT06
2006-09-15
44 p (G = 24 p)
BERÄTTARFRÅGOR
14. You have cloned a promoter and identified some protein binding sites using footprinting.
You want to know now which proteins bind to these sites. How do you proceed? (6p)
SV:
•
•
•
•
Comparison of the binding sites with a database for transcription factor binding
sites.
EMSA with the identified labelled binding sites and either cell extracts or purified
suspected proteins. In case of cell extract, the suspected proteins have to be
identified by supershift with specific antibodies.
Specificity can be shown by competition with unlabelled nucleotides and the use of
labelled scrambled sequences.
And/or ChIP assay with antibodies against the suspected protein and primers to
amplify the binding region.
4
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
DUGGA
Molekylärbiologi T3 / HT06
2006-09-15
44 p (G = 24 p)
15. Du ska klona in sekvensen angiven nedan, i EcoRI sitet på plasmiden pBS. Du har
tillgång till cDNA från celler som uttrycker denna sekvens som kan användas som
templat i PCR-reaktioner (både sense och antisense strand ges nedan). EcoRI
klyver sekvensen GAATTC.
Sekvensen som ska klonas:
5’CGCGAATGCGCGAATATGCGCGTATATGCGCGCTATGGGCCCCGTATATTGTGTGAGAGA
3’GCGCTTACGCGCTTATACGCGCATATACGCGCGATACCCGGGGCATATAACACACTCTCT
GGGGAGAGAGGGAGAGAGGGCGCGCGAGAGAGTTTTAGGATGATTAGATAGATGATATGAGA
CCCCTCTCTCCCTCTCTCCCGCGCGCTCTCTCAAAATCCTACTAATCTATCTACTATACTCT
TGTATATTATATATTGGGCGCGCGTATTAGCGCTAGGCTCGATGCTAGCTGATGCGGCT 3’
ACATATAATATATAACCCGCGCGCATAATCGCGATCCGAGCTACGATCGACTACGCCGA 5’
A. Ange DNA-sekvensen på två stycken primers som kan användas för att amplifiera
sekvensen med PCR och samtidigt få den flankerad av EcoRI sites. (4p)
B. Beskriv dessutom vilka steg som måste utföras för att klona in PCR-produkten i
EcoRI sitet i pBS samt rena fram den slutliga plasmiden. (3p)
SV
A.
primer 1 5’ GATCGAATTCCGCGAATGCGCGAATATGCG
primer 2 5’ GATCGAATTCAGCCGCATCAGCTAGCATC
(Röda nucleotider = extra baser för att kunna klyva, kan
vara andra)
B.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Rena PCR produkten
Klyv vektor och PCR-produkt med EcoRI
Defosforylera vektorn
Värmeinaktivera både vektor och klyvd PCR-produkt.
Ligera PCR-produkt + vektor.
Transformera ligering
Plocka bakteriekoloni och starta kultur
Rena plasmid
5
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
DUGGA
Molekylärbiologi T3 / HT06
2006-09-15
44 p (G = 24 p)
16. Du misstänker att ett protein, protein X, kan binda till östrogenreceptor α (ERα)
eftersom det innehåller en sekvens som liknar en NR-box. Beskriv kort två metoder
för att undersöka om protein X kan binda till ERα samt svarar på frågan om
interaktionen är beroende av ligand. Rita gärna figur. (6p)
SV: Exempel på metoder som går att använda. Jäst två-hybrid systemet, två
mammalian-hybrid systemet, GST-pulldown, Biacor analys. Coimmunoprecipitation.
6
