Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
DUGGA
Molekylärbiologi T3 / HT07
2007-09-14
52 p (G = 28 p)
KORTSVARSFRÅGOR
1. Restriktionsenzymet KpnI klyver sekvensen 5´-GGTACC-3´ och lämnar ett fyra
basers 3´-överhäng. Enzymet BamHI klyver sekvensen 5’-GGATCC-3’ och lämnar
ett fyra basers 5’ överhäng. Ange det längsta DNA-fragmentet som bildas efter
klyvning av nedanstående given sekvens (3p).
5’-GATCGGTACCATCGCTATCTCGGGATCCGATC-3’
3’-CTAGCCATGGTAGCGATAGAGCCCTAGGCTAG-5’
SV:
5’CATCGCTATCTCGG-3’
3’-CATGGTAGCGATAGAGCCCTAG-5’
2. Vilken enzymatisk aktivitet har alkaliskt fosfatas och vad är dess vanligaste
användningsområdet? (2p)
SV: defosforylerar 5’-ändan på DNA fragment. Defosforylaring av plasmider
före ligering för att förhindra självligering.
3. Hur många PCR produkter har man efter 3 cykler av PCR om man startar med en
templatmolekyl? (1p)
SV: 1x23=8
4. Fråga: Hur stort är det mänskliga genomet, ungefärligt antal baser, ungefärligt antal
gener? Ungefär hur stor del av människans DNA representeras av proteinkodande
gener? (3p)
Svar: Det humana genomet innehåller ca 3 miljarder baspar,
Ca 22,000-25,000 unika gener (genomet),
endast ~1,5% är alltså proteinkodande sekvens. (och > 50% är repetitivt DNA).
5. Ge exempel på tre olika reportergener (3p)
SV: Luciferase, LacZ, GFP, alkaline phosphatase, CAT (chloramphenicol acetyl
transferase)
1
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
DUGGA
Molekylärbiologi T3 / HT07
2007-09-14
52 p (G = 28 p)
6. Nämn tre vanliga transfektionsmetoder? (3p)
Katjoniska lipider, Electroporering, CaPO4 metoden, DEAE-dextran metoden,
virus och mikroinjektion.
7. Vad är skillnaden mellan en promotor och en enhancer i en gen? (2p).
SV: Promotorn ligger vid transkriptionsstartsitet och binder RNA polymeras
medan en enhancer kan ligga långt från startsitet (både före i och efter genen)
och påverkar aktiviteten av promotorn. .
8. Ge 3 experimentella metoder för att studera protein-protein interaktioner. (3p)
SV:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Mammalian två-hybrid
jäst två-hybrid
GST pull-down assay
Biacore system (Surface plasmon resonance)
co-immunoprecipitation
Phage display
FRET
Protein microarrays
ChIP med reChIP
9. Beskriv kortfattat hur Cre/loxP systemet fungerar. (3p)
SV. Cre/loxP systemet är utvecklat från bakteriofag P1 och används ofta för att
göra konditionella knockouter. Cre är ett enzym, ett recombinase, som orsakar
rekombintion mellan två loxP sites (en 34 bp lång sekvens). Detta resulterar i att
sekvensen mellan två loxP sites avlägsnas och endast ett loxP site blir kvar.
2
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
DUGGA
Molekylärbiologi T3 / HT07
2007-09-14
52 p (G = 28 p)
10. Vad är cDNA? Hur framställs det? Vad är ett cDNA bibliotek?(3p)
SV: cDNA är DNA komplementär till mRNA. Det framställs med hjälp av
mRNA som template samt enzymet reverse transcriptas och antingen random
primers eller oligo dT primer. Ett cDNA bibliotek är cDNA från en cell linje
eller vävnadstyp inklonat i en vektor. cDNA bibliotek kan användas för att leta
efter gener som är uttryckta i en viss vävnad.
11. Why is EMSA also called gel shift assay?(2p)
SV: When a protein is bound to the DNA, the DNA is a lot heavier, resulting in
retardation of the DNA in a non-denaturing gel. This results in a shift of the
DNA band in the gel.
12. Why can we say that ChIP is an in vivo method, even though most of the
experimental procedure is in vitro?(2p)
SV: Because we cross-link the proteins to DNA while the cells are alive or
directly in the tissue. The resulting binding is so stable that it survives all the in
vitro treatments. So what we get in the end is a “snap-shot” of what happened in
a living cell.
13. How does ligand-binding to nuclear receptors influence their transcriptional
activity? (2p)
SV: cytoplasmic-nuclear transport, coactivator (coregulator) recruitment,
corepressor release
3
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
DUGGA
Molekylärbiologi T3 / HT07
2007-09-14
52 p (G = 28 p)
BERÄTTARFRÅGOR
14. Du ska klona in sekvensen angiven nedan, i EcoRI sitet på plasmiden pBS. Du har
tillgång till cDNA från celler som uttrycker denna sekvens som kan användas som
templat i PCR-reaktioner (både sense och antisense strand ges nedan). EcoRI klyver
sekvensen GAATTC.
Sekvensen som ska klonas:
5’CGCGAATGCGCGAATATGCGCGTATATGCGCGCTATGGGCCCCGTATATTGTGTGAGAGA
3’GCGCTTACGCGCTTATACGCGCATATACGCGCGATACCCGGGGCATATAACACACTCTCT
GGGGAGAGAGGGAGAGAGGGCGCGCGAGAGAGTTTTAGGATGATTAGATAGATGATATGAGA
CCCCTCTCTCCCTCTCTCCCGCGCGCTCTCTCAAAATCCTACTAATCTATCTACTATACTCT
TGTATATTATATATTGGGCGCGCGTATTAGCGCTAGGCTCGATGCTAGCTGATGCGGCT 3’
ACATATAATATATAACCCGCGCGCATAATCGCGATCCGAGCTACGATCGACTACGCCGA 5’
A. Ange DNA-sekvensen på två stycken primers som kan användas för att amplifiera
sekvensen med PCR och samtidigt få den flankerad av EcoRI sites. (4p)
B. Beskriv dessutom vilka steg som måste utföras för att klona in PCR-produkten i
EcoRI sitet i pBS samt rena fram den slutliga plasmiden. (3p)
SV
A.
primer 1 5’ GATCGAATTCCGCGAATGCGCGAATATGCG
primer 2 5’ GATCGAATTCAGCCGCATCAGCTAGCATC
(Röda nucleotider = extra baser för att kunna klyva, kan
vara andra)
B.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Rena PCR produkten
Klyv vektor och PCR-produkt med EcoRI
Defosforylera vektorn
Värmeinaktivera både vektor och klyvd PCR-produkt.
Ligera PCR-produkt + vektor.
Transformera ligering
Plocka bakteriekoloni och starta kultur
Rena plasmid
4
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
DUGGA
Molekylärbiologi T3 / HT07
2007-09-14
52 p (G = 28 p)
15. Du jobbar på ett läkemedelsbolag där kemisterna har framställt några substanser
som är tänkta att vara ligander till östrogenreceptorerna. Hur kan du undersöka om
detta är fallet? (6p)
SV: Genom att använda mammalian två hybrid system bestående av Gal4DBD
fuserad co-activator och ligandbindande domän av någon av
östrogenreceptorerna fuserad till VP16 aktiveringsdomän. Som reporter
används en plasmid med Gal4 bindningssites framför en promotor som driver en
reportergen.
Alternativt använd en reporter med östrogenresponse element framför en
minimal promotor drivande en reportergen.
5
Namn
Personnummer
_____________________________________________________________________
DUGGA
Molekylärbiologi T3 / HT07
2007-09-14
52 p (G = 28 p)
16. Du studerar ett protein, Callas2. Hur kan du identifiera proteiner som interagerar med detta
protein? (6p) (rita gärna figur)
SV: Använd jäst två-hybridsystemet klona in Callas2 i en vektor med en Gal4DBD.
Transformera vektorn och ett cDNA-bibliotek bestående av cDNA fuserat till en Gal4AD
från en celltyp där du tror att det finns interagerande proteiner. Odla den transformerade
jästen på agarplattor som saknar Trp, Leu och His. Isolera plasmid DNA från jästkolonier
som bildas på plattorna och sekvensera dessa. Sekvensen du erhåller borde innehålla
cDNA sekvensen för ett protein som kan binda till Callas2.
Allternativt svar: Det går även att använda metoder som bygger på
proteinrening och proteinsekvensning.
6
