Tentamen i Genteknik, TFKE38 2008-10-15
1) Vid all kloning gäller det att ha en lämplig vektor, de vektorer som främst används är
plasmider, fager och fagimider.
a) Ge några exempel på vad man bör tänka på i valet av vektorer.
(2p)
S: Antibiotikaresistens, möjlighet att få ss_DNA, storlek på fragment man kan
klona in, möjlighet att uttrycka proteinet
b) Redogör för vad som kännetecknar de olika vektorerna och hur man selekterar fram
rekombinanter från dessa vektorer.
(6p)
S. plasmider kan användas som förvaring eller för expression, selektion sker mha av
antibiotikaresistens. Fagmider samma förfarande som med plasmid, kan även
erhålla ss-DNA då man infekterar med hjälparfag. Fager, ingen antibiotikaselektion
har fördelen att den kan lätt renas fram fram utsöndras till mediet, ger plaques.
Kan klona in större fragment an i en plasmid.
c) Reningen av dessa vektorer skiljer sig en del åt, redogör kortfattat hur man renar dessa
vektorer.
S: plasmider/fagmider renas genom att slå sönder cellväggen och upprening med
t.ex plasmidprepkit. Fager renas från odlingsmediet med speciella kit eller
utfällning av fagen i PEG och fenolextraktion
(2p)
2) Många eukaryota proteiner går att uttrycka i främmande värdorganismer tex E.coli
a) Ge några exempel på problem som man kan stöta på i samband att man försöker
uttrycka ett eukaryot protein i E.coli
(6p)
S: Proteinet giftigt för värdcellen, proteinet behöver glykosyleras för att vara aktivt
b) Vid rening av eukaryota proteiner från E.coli renas ofta det önskade proteinet som ett
fusionsprotein, vad menas med detta och vad för fördel kan detta förfarande ha?
(2p)
S: Med att fusionsprotein utnyttjar egenskaper till exempel för rening eller löslighet,
c) Du har renat fram det önskade fusionsproteinet och vill därefter klyva bort det fuserade
proteinet för att få ett korrekt protein, hur ska du gå tillväga och vad bör du tänka på vid
valet av vektor?
(2p)
S: Proteinet renas fram t.ex. Histag och klyvs sedan med proteas för att få ett
korrekt protein . Man bör alltså tänka på vid valet av vektor att man har möjlighet
att klyva bort fusionsproteinet (proteassite)
3) Du har fått till uppgift att skapa ett cDNA bibliotek från bukspottskörteln.
a) Vad menas med cDNA bibliotek och vad skiljer detta från ett genomiskt bibliotek?
(2p)
S: Ett cDNa bibliotek utgår från mRNA som uttrycks i en specifik vävnad medan ett
genomiskt bibliotek innehåller allt DNA (inttroner och exoner)
b) Beskriv kortfattat hur du går tillväga för att konstruera ett cDNA bibliotek.
(6p)
S: Total RNA prepareras innehållande bl.a mRNA oligo med med tymin (5’TTTTTTT....-3’) binder till poly-A svansen på mRNA och mha reversed
transcriptas görs en hybrid RNA/DNA, RNA bryts med RNAse och DNA polymeras
tillsätts för att fylla i luckorna (se även gene cloning boken s 167)
c) Nämn några olika sätt att isolera en specifik gen från detta cDNA bibliotek
(2p)
S: hybridisering ( se boken s 169) eller PCR)
4) Du har isolerat ett DNA fragment och ligerat in det i vektorn pBR322.
Med hjälp av två olika restriktionsenzymerBamHI och EcoRI
a) Restriktionsenzymer används ofta vid kloning, vad bör man laborativt tänka på då man
ska göra ett restriktionsklyvningsexperiment.
(3p)
S: Val av buffert så att de är kompatibla med bägge restriktionsenzymer, använda
lämplig koncentration (Units) av enzymet, inaktivera enzymet efter reaktionen
(värme)
b) Vad är orsaken till att man oftast använder två olika restriktionsenzymer vid kloning?
(2p)
S: Genom att använda två olika restriktionsenzymer kommer det inklonade
fragment alltid ha samma riktning speciellt viktigt då man klonar in i en
expressionsplasmid
c) För att analysera resultaten av en restriktionsklyvning används ofta
agarosgelelektrofores. Vad bör man laborativt tänka på vid agarosgelelektrofores och hur
detekteras banden på agarosgelen
(3p)
S: Använda agaroskoncentration med avseende på det man vill kunna separera på
gelen , lätta band t.ex PCR fragment (hög agaroskonc 1-1.5%) tyngre band lägre
agaroskoncentration . Infärgning sker med etidiumbromid som fluorescerar då det
belyses med UV ljus.
d) Som kontroll använde du den okluvna plasmiden pBR322 och erhöll ett flertal band på
agarosgelen , ange någon rimlig orsak till detta och hur bör du göra för att kunna använda
pBR322 som kontroll?
(2p)
S: Flera band tyder på olika grad av supercoiling för att kunna använda som
kontroll måste plasmiden först linjariseras med att klyva plasmider på ett ställe.
5 ) I figuren nedan ses DNA sekvensen för protein X. Detta protein har visat sig ha dålig
löslighet troligen pga en membran bindande region i C-terminalen på 20 aminosyror.
För att öka vattenlösligheten har du beslutat dig för att göra en deletionsmutant där de 20
sista aminosyrorna är borttagna.
a) Beskriv detaljerat hur du går tillväga för att göra proteinet 20 aminosyror kortare.
(8p)
S: Amplifiera sekvensen med primer som passar motsvarande 20 aminosyror
kortare (dvs 60 baser in i genen) regionen markerad i fet stil i sekvensen, sätt på
restriktionsenzymer i ändarna och klona in den i en vektorn på nytt.
b) Nämn någon metod för att bekräfta att du lyckats med att göra deletionsmutanten.
(2p)
S: Det bästa sättet att kolla att man lyckats att göra plasmidsekvensning av genen
Figur. DNA sekvens för protein X
5´-atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggt
gatgttaatgggcacaaattctctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacgga
aaacttacccttaaatttatttgcactactggaaagctacctgttccatggccaacactt
gtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaaacag
catgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatattttac
aaagatgacgggaactacaaatcacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgataccctcgtt
aatagaattgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaa
atggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatgga
atcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagac
cattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattac
ctgtccacacaatctgccctttccaaagatcccaacgaaaagagagatcacatgatcctt
cttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataa-3´
