En rullande kopieringsapparat
Jenny Göransson
Inom molekylärbiologin arbetar man inte sällan med genetisk information, DNA. Ofta är de
mängder DNA man har tillgång till för små för att kunna utföra analyser av olika slag, och det
finns därför ett behov av att kunna mångfaldiga den genetiska informationen. PCR är en metod
som specifikt kopierar upp DNA. Metoden uppfanns 1983 av en forskare i USA som 20 år
senare erhöll Nobelpriset för sin uppfinning. Men trots att PCR är en så pass väl fungerande
metod behövs fler alternativa tekniker att kopiera DNA med. Det finns till exempel ett behov av
en metod som snabbt frambringar kopior av flera DNA-fragment samtidigt. Detta gäller framför
allt vid storskaliga studier där man exempelvis sekvenserar DNA och försöker finna gener eller
genvariationer. En sådan metod är så kallad "multiplex PCR", där man kopierar flera DNA
fragment samtidigt och i ett och samma rör. Problemet med denna teknik är emellertid att de
startsekvenser som behövs för att initiera processen kan korsreagera med varandra och skapa
kombinationer som ger upphov till fel kopior. För att undkomma detta problem, men ändå lyckas
med uppgiften att snabbt ta fram kopior av flera fragment på ett säkert sätt, har några forskare
tagit fram en ny teknik.
Den nya tekniken baseras på kopiering av cirkulärt DNA. Idén kommer ifrån virus med
cirkulär arvsmassa, och som därför har ett utvecklat system för att kopiera denna. Genom att
cirkularisera ett särskilt fragment kan man alltså kopiera detta på liknande sätt som i dessa virus.
Cirkulariseringen av det genomiska fragmentet kan göras genom att man låter en DNA-sekvens
binda till de båda ändregionerna av fragmentet. Därefter kan ett enzym, ligas, sammanfoga de
båda ändarna till en cirkel. Genom att antingen tillsätta en startsekvens eller använda sig av
sammanfogningssekvensen kan man initiera polymerisering av cirkeln. Ett viralt enzym, 29
DNA-polymeras, används till att kopiera cirkeln. Eftersom detta enzym har en särskild förmåga
att knuffa undan DNA som kommer i vägen för dess framfart, kan det trycka bort den ände som
efter ett varv av polymerisering hamnar framför det. Genom denna typ av kopiering som för
övrigt kallas rullande cirkelamplifiering eller RCA, får man en lång sträng med segment som
vart och ett representerar en kopia av fragmentet man började med. Med en typ av enzym som
klyver DNA kan man därefter klippa upp strängen till de individuella kopiorna.
En hopfogning av dessa kopior till nya cirklar möjliggör en andra RCA som på samma sätt
som tidigare genererar en sträng av kopior. Likadant kan dessa strängar klippas till bitar som
sedan kan cirkulariseras inför en tredje RCA-reaktion. Detta förfarande, att utföra flera på
varandra följande RCA-reaktioner baserat på föregående reaktions DNA-kopior, kallas seriell
cirkelamplifiering, förkortat SCA.
Genom att konstruera sammanfogningssekvensen på ett visst sätt kan man ge utrymme för en
kort sekvens mellan fragmentets båda ändar. Sekvensen kan kilas in vid cirkulariseringen av
olika genomiska fragment, vilket betyder att alla cirklar kommer att ha en liten del som är
gemensam. Därigenom kan också samma startsekvens användas till samtliga RCA-reaktioner på
flera olika genomiska fragment samtidigt.
Hittills har det varit svårt att få RCA och SCA att fungera på genomiskt material. Orsaken till
detta troddes vara DNA som störde processen genom att starta andra polymeriseringar på den
sträng som bildades vid kopieringen. Detta skulle i så fall omöjliggöra cirkularisering av
kopiorna en andra gång. Mitt projekt syftade till att få SCA att fungera med ett genomiskt
fragment. För att lyckas fokuserade jag på att eliminera det DNA som kunde störa reaktionen.
Genom att göra detta har jag lyckats att kopiera ett genomiskt fragment om 550 baser i
storleksordningen miljoner gånger efter tre på varandra följande SCA-reaktioner.
Examensarbete i biologi, 20 p, VT03
Institutionen för biologisk grundutbildning och Institutionen för genetik och patologi
Handledare: Mats Nilsson
