Daniel Sehic
Vårt DNA mestadels skräp
Vårt DNA består till stor del av skräp-DNA som kallas introner. Dessa introner tycks
inte ha någon som helst funktion och redigeras bort av cellen innan DNA används av
kroppen. Resterande del består av DNA som kodar för gener, så kallade exoner. För
att framställa sådant ”rent” kodande DNA måste man först omvandla DNA till RNA. I
denna process tas alla introner bort. RNA består därför bara av kodande gener som
cellerna har användning för. När man vill ta ut generna utan att få med skräpet
används RNA som en mall för DNA-tillverkning. DNA som har tillverkats från RNA
är därför fritt från skräp och kallas komplementärt DNA (cDNA). När man sedan tar
ut flera olika geners cDNA får man ett bibliotek av cDNA. Mitt examensarbete har
gått ut på att undersöka och förbättra framställningen av cDNAbibliotek.
När cDNA:t väl framställts är nästa steg att klippa det med restriktionsenzym. Detta
gör att det blir lättare att hantera fragmenten och sedan läsa av cDNA-koden genom
olika sekvenseringsmetoder. Bitarna av cDNA klistras sedan in i en vektor som sedan
sätts in i en bakteriecell. Vektorn är en DNA-bit som binder till cDNA:t i båda
ändarna och på så sätt bildar en cirkel. Anledningen till detta är att bakterien bara kan
kopiera DNA:t om det är cirkulärt. Bakterierna odlas och eftersom de förökar sig
genom delning blir alla bakterieceller som tagit upp cDNA-plasmiden identiska med
varandra. För att kunna ta ut cDNA-generna man är intresserad av märks de med
radioaktivitet. När man sedan framkallar cDNA:t på film kan man tydligt se vilka
områden som har högst radioaktivitet och som består av de intressanta generna. Sedan
är det bara att ta ut de bakterieceller som innehåller generna och fastställa cDNAkoden via sekvensering.
Stegen som undersöktes mera utförligt var steget när vektor och cDNA klistrades ihop
(ligationen) och när dessa togs upp av bakteriecellen (transformering).
Dessutom gjordes ett cDNA-bibliotek av en dunnart
(Sminthopsis crassicaudata) som är ett litet pungdjur (bild
till höger). Hopklistringen av vektor och cDNA visade sig
vara mest effektiv vid temperaturer på 16°C.
Bakteriecellens upptagning av den hopklistrade vektorn
och cDNA:t visade sig fungera bäst när det
transformerades via elektroporering. Elektroporering är
precis vad det låter som, med hjälp av en elektrisk
urladdning poreras cellen och hål bildad i cellens yttermembran. Genom hålen kan
sedan cDNA:t ta sig in i cellen.
E. coli bakteriestammen som gav bäst resultat var JM109. Den effektivaste
cellkoncentrationen visade sig vara något lägre än vad som sades i protokollet och
elektroporeringsstyrkan var mest optimal mellan 1,8 och 2,2kV. Elektroporerade
celler kunde förvaras på is i ett par dagar.
De största förbättringarna som gjordes var transformeringssteget som förbättrades så
att det blev 10 gånger så effektivt.
Handledare: Axel Janke
Examensarbete 20 p i Molekylärgenetik. Vt 2004.
Institutionen för cell- and organismbiologi, Lunds universitet.
Improving cDNA library techniques and establishing a cDNA
library from the dunnart (Sminthopsis crassicaudata)
Abstract
The aim of this study was to investigate the parameters for the successful construction
of cDNA libraries and to improve the efficiency in cDNA library constructions.
Steps in the construction process were investigated, such as the transformation by
electroporation, the ligation and the digest of both the vector and the insert. Different
cells were also tested. To produce cDNA, the CreatorTM SMARTTM cDNA Library
Construction Kit was used. It was concluded that using mRNA instead of total RNA
gives a better result. The downside of mRNA is the high amount of RNA that is
needed in the process.
The first crucial step that was investigated was the ligation of vector and cDNA insert.
The ligation temperature of the protocol was 16°C and my experiments showed this
temperature was actually best of those that were tested. The ligase concentration and
the time factor of the ligation are still unclear and will have to be examined more
closely at some other stage.
The second step that was investigated was the efficiency of the transformation by
electroporation. The electroporation method proved to be a good method for
transformation of plasmids into cells. The best E. coli cell strain tested for
transformation by electroporation was JM109. It had the highest efficiency at cell
concentrations between 175-225 U/ml (OD600). The optimum voltage setting on the
electroporator was between 1.8 and 2.2kV. The transformed cells could also be stored
for 2 days on ice without any significant reduction of the surviving transformants.
After 3 days however the number of transformed cells were reduced to 50%. The
results also show that one does not get more transformed cells when electroporating
multiple times and that the effect on time delay when adding SOB-medium to the
transformed cells are crucial and should not take longer than 15 sec before the number
of transformations decrease.
The last step was making a cDNA library of Sminthopsis crassicaudata, the dunnart
(a marsupial) with the SMARTTM kit. However no useful sequences could be obtained
during the final stage of the project. Probably because of the selected sequencing
method.
Many different factors was investigated and improved. For example the
transformation step was improved 10 fold!
