Malin Johannesson
Människa och apa – hur lika är vi?
Alla cellmembran i vår kropp är uppbyggda av fosfolipider till vilka olika fettsyror är bundna.
En av dessa fettsyror är arakidonsyra som är uppbyggd av 20 kolatomer med 4
dubbelbindningar (se bilden). När en cell stimuleras kan arakidonsyran frisättas från
fosfolipiderna och kan då omvandlas till olika biologiskt aktiva föreningar.
O
OH
Arakidonsyra
Enzymet 5-Lipoxygenas (5-LOX) finns i blodceller och omvandlar arakidonsyra till
leukotriener genom att koppla på en O2-molekyl till kolatom nummer 5 i kolskelettet.
Leukotrienerna kan sedan aktivera olika inflammatoriska celler samt ge upphov till astma och
andra respiratoriska sjukdomar. Lipoxygenaser finns i många olika varianter och detta
examensarbete handlar främst om den variant som heter 12/15-LOX. Detta enzym kan koppla
på syre både vid kolatom nummer 12 och 15. Det är fortfarande oklart vad som är dess
biologiska funktion, men man tror att det är inblandat i bland annat celldifferentiering,
inflammation, astma och cancer. Fram tills nu har genen som kodar för detta protein hittats i
människa, gris och olika gnagare såsom mus och råtta.
Syftet med arbetet var att med hjälp av olika molekylärbiologiska metoder undersöka ifall
genen för 12/15-LOX också finns i lungvävnad från Rhesus apa. Detta är intressant eftersom
man då kan jämföra ap-enzymet med det mänskliga enzymet och på så sätt få mer kunskap
om dess funktion. Förhoppningsvis kan det också underlätta utvecklingen av nya antiinflammatoriska läkemedel.
Man vet sedan tidigare att generna som kodar för de olika lipoxygenaserna är väldigt lika
varandra arter emellan. Detta har jag utnyttjat för att, ifall de fanns i lungvävnaden, fånga upp
just de gener som kodar för dessa proteiner. Första steget var att isolera RNA
(ribonukleinsyra) från vävnaden och omvandla det till cDNA (komplementärt DNA), som
bara innehåller det kodande DNAt. Sedan användes en metod som heter PCR (polymerase
chain reaction) där man använder genspecifika DNA-bitar (oligonukleotider) som kan binda
in till motsvarande sekvenser i cDNAt. Detta cDNA kopieras till miljontals kopior som sedan
separeras från övrigt DNA, renas och sekvenseras.
De oligonukleotider som användes i PCR-reaktionerna binder in till mittenpartiet av 12/15LOX-genen i cDNAt från apa. Detta medför att ungefär 1/6 av genen fångas upp och
kopieras. En jämförelse av sekvenserna mellan det isolerade cDNAt från apa och det för
mänskligt 12/15-LOX visade att de är hela 98 % lika varandra. Ifall detta gäller för resten av
cDNAt och om enzymet har samma aktivitet som det mänskliga enzymet återstår att se.
Handledare: Lars-Olof Hedén och Pontus Forsell
Examensarbete 20 p i mikrobiologi. Ht 2003
Institutionen för cell- och organismbiologi, Lunds universitet
Biolipox AB
Abstract
Lipoxygenases comprise a heterogeneous family of non-heme iron containing enzymes
that catalyse the addition of molecular oxygen to polyunsaturated fatty acids, converting them
into bioactive lipid mediators. Lipoxygenases are classified according to their positional
specificity of oxygenation and their cell specific expression pattern. The enzymes can be
found in plants, fungi, invertebrates, mammals and, as recently described, in some bacteria.
In this project I wanted to clone and express the gene for a human 15-lipoxygenase as well
as isolate the corresponding cDNA from Rhesus monkey lung tissue. The successful cloning
and expression of the human 15-lipoxygenase gene, using the Creator system, resulted in a 60
kDa protein. In experiments regarding the identification of lipoxygenases in Rhesus monkey,
we used regular-, temperature gradient-, nested- and degenerative-nested PCR. We also made
an effort to create a cDNA library. The degenerative-nested PCR resulted in the isolation of
350 bp cDNA-fragments for two types of lipoxygenases, 5-lipoxygenase and 15lipoxygenase, respectively. To our knowledge no one has cloned the genes for these enzymes
from Rhesus monkey before and future attempts to isolate the full-length cDNA will
hopefully provide better insight in the biological functions of lipoxygenases.
