LINKÖPINGS UNIVERSITET
IFM-Kemi
Tentamen i Biokemi 2
(NKEC14)
2008-05-30, Kl: 08.00-13.00
Skriv namn på alla blad
Skriv endast en uppgift per blad
Redovisa beräkningar och motiveringar
Hjälpmedel: Miniräknare som inte får vara programmerad
Ansvarig lärare: Magdalena Svensson, 5686 el. 0704-09 09 99
Tentamen i Biokemi 2 (NKEC14) 2008-05-30
1.a) Du har en proteinblandning innehållande 4 olika proteiner med följande pI: Protein A pI
5, Protein B pI 5.6, Protein C pI 6.3 och Protein D pI 7. Hur går du till väga för att separera
dessa proteiner. Motivera val av kromatografimetod, buffert och elueringsbetingelser. Rita
hur ett kromatogram kan komma att se ut efter kromatografin. Indikera var i kromatogrammet
respektive protein återfinns. Ange enhet på axlarna i kromatogrammet.
(5p)
b) Inbindning av syre till hemoglobin orsakar en konformationsförändring. Beskriv
mekanismen och redogör för konsekvenserna av konformationsförändringen.
(5p)
2.a) Du vill karakterisera aktiva ytan hos ett nyupptäckt enzym. Vi antar att reaktionen vilken
enzymet katalyserar är känd. Ge förslag på hur du skulle gå till väga.
(2p)
b) Kymotrypsin är ett serinproteas och katalyserar effektivt hydrolys av peptidbindningar. För
katalyseffekt krävs att den attackerande gruppen är bättre än motsvarande vid den
okatalyserade reaktionen och att den lämnande gruppen är bättre än vid spontanreaktionen.
Jämför effektiviteten av de attackerande grupperna respektive de lämnande grupperna vid
enzymkatalyserad och okatalyserad reaktion.
(4p)
c) ATCase är ett prokaryot enzym som katalyserar första steget i pyrimidinsyntesen. Hur
påverkas ATCase aktivitet av närvaro av allosteriska effektorer som CTP och ATP?
(4p)
3.
Fumaras katalyserar hydratisering av fumarat till L-malat:
COO
|
H―C
+
||
C―H
|
COO
H2O
COO
|
HO―C―H
|
CH2
|
COO
Data i tabellen nedan erhölls när fumarat anvädes som substrat och initialhastigheten
mättes (vid pH 5,2 ch 25ºC) med en enzymkoncentration av 2 x 10-6M. Enzymet består
av 4 identiska subenheter.
Fumarat
(mM)
2,0
3,3
5,0
10,0
v
(mM/min)
2,5
3,1
3,6
4,2
a)
Behandla data grafiskt oh bestäm Vmax, kcat och KM för fumaras under dessa villkor.
b)
Om ett enzym är perfekt är det möjligt att reaktionen blir diffusionskontrollerad, dvs
enzymets kombination med substrat närmar sig 109M-1s-1.
c)
(7p)
Hur är det med detta för enzymet fumaras?
(2p)
Förslå en trolig kompetetiv inhibitor till fumaras.
(1p)
4) Transkriptionen är en komplicerad processsom brukar delas upp i tre olika steg,
initiering, elongering och terminering.
a)
Beskriv vad som händer i de olika stegen (prokaryot system), gärna schematiskt.
(3p)
b)
Många processer är likartade mellan prokaryoter och eukaryoter, ge några exempel på
skillnader vid prokaryot respektive eukaryot transkription.
(2p)
c)
Lac-operonet är ett exempel på reglering på transkriptionsnivå. Vad menas med lacoperonet. Visa schematiskt hur detta reglerar uttrycket av mRNA.
(5p)
5) Du har isolerat ett DNA fragment och vill konstruera en restriktionskarta på detta
fragment. Du väljer att klyva med två olika restriktionsenzymer, EcoRI och BamHI
och separerar de klyvda DNA fragmenten på en agarosgel. Nedanstående tabell visar
resultatet av restriktionsklyvningen.
Restriktionsenzym
EcoRI
BamHI
EcoRI + BamHI
Fragmentstorlek (bp)
3000, 7000
500, 1000, 8500
500,1000, 2000, 6500
a) Konstruera en restriktionskarta och bestäm de inbördes positionerna för de två
restriktionsenzymen.
(4p)
b) Hur detekteras DNA banden på en agarosgel?
(2p)
c) För att undersöka DNA fragmenten i detalj, väljer du att DNA sekvensa fragmenten. Hur
går DNA sekvensning till, vilka komponenter behövs och hur sker detektionen?
(4p)
6) Du har nyss blivit anställd på ett Bioteknikföretag och din första uppgift blir att klona
ett protein (DNA sekvens, figur 1) som är intressant ur läkemedelsynpunkt.
a) Du har valt att leta efter genen för proteinet från ett cDNA bibliotek, vad är ett cDNA
bibliotek och vad skiljer detta från ett genomiskt bibliotek?
(2p)
b) Med hjälp av PCR teknik vill du hitta genen och kopiera den till ett stort antal. Beskriv
hur PCR tekniken fungerar, vilka komponenter ingår?
(4p)
c) Konstruera primers för att kopiera genen i figur 1.
(2p)
d) Du har valt att klona genen i en expressionsplasmid, vad menas med detta och hur kan
du veta att du lyckats med ditt experiment?
5’ATGGATGGTACAAGAACTTCACTTGACATTGAAGAGTACTCGGATACTGAGGTACAGAAA
AACCAAGTACTAACTCTGGAAGAATGGCAAGACAAGTGGGTGAACGGCAAGACTGCTTTTCA
TCAGGAACAAGGACATCAGCTATTAAAGAAGCATTTAGATACTTTCCTTAAAGGCAAGAGTG
GACTGAGGGTATTTTTTCCTCTTTGCGGAAAAGCGGTTGAGATGAAATGGTTTGCAGACCGG
GGACACAGTGTAGTTGGTGTGGAAATCAGTGAACTTGGGATACAAGAATTTTTTACAGAGCA
GAATCTTTCTTACTCAGAAGAACCAATCACCGAAATTCCTGGAACCAAAGTATTTAAGAGTT
CTTCGGGGAACATTTCATTGTACTGTTGCAGTATTTTTGATCTTCCCAGGACAAATATTGGC
AAATTTGACATGATTTGGGATAGAGGAGCATTAGTTGCCATTAATCCAGGTGATCGCAAATG
CTATGCAGATACAATGTTTTCCCTCCTGGGAAAGAAGTTTCAGTATCTCCTGTGTGTTCTTT
CTTATGATCCAACTAAACATCCAGGTCCACCATTTTATGTTCCACATGCTGAAATTGAAAGG
TTGTTTGGTAAAATATGCAATATACGTTGTCTTGAGAAGGTTGATGCTTTTGAAGAACGACA
TAAAAGTTGGGGAATTGACTGTCTTTTTGAAAAGTTATATCTACTTACAGAAAAGTAAATGA
GACATAGATAAAATAAAATCACACTGACATGTTTTT-3’
Figur 1 DNA sekvensen för genen som ska klonas
(2p)
