Åsa Hagström
Självständigt DNA i vinförstörande jäst
Dekkera bruxellensis är en jäst som blivit ökänd som en ovälkommen fermenterare i vin- och
ölbryggning, eftersom den inte bara producerar alkohol utan även illasmakande ämnen.
Industrin har därför ett intresse i att kontrollera D. bruxellensis samt veta mer om hur den
fungerar rent molekylärt. Än så länge har det varit svårt eftersom man endast har lyckats
transformera (föra in främmande DNA) jästen med så kallade linjära vektorer (bärar-DNA)
som i sin tur måste integreras i det genomiska DNA:t (DNA:t som finns i cellens kärna) för att
fungera. Det vore fördelaktigt att kunna transformera D. bruxellensis med en vektor som inte
behöver integreras för att fungera utan är självständig och i cirkulär form. För att uppnå detta
måste man ha ett visst DNA-element på vektorn, kallat ARS (Autonomously Replicating
Element – en DNA-sekvens som sätter igång fördubblingen av DNA:t) eller centromer (CEN
- specialiserade regioner på kromosomerna som behövs under celldelningen). Dessa kommer
att aktivera övriga jäst-DNA-sekvenser på vektorn så att den kan fungera oberoende av det
genomiska jäst-DNAt. Centromerer är specialiserade regioner i kromosomer och är
nödvändiga för celldelningen. Det finns två typer: punkt (korta) och regionala (långa)
centromerer. Förstnämnda har hittats i jäst besläktade med Saccharomyces. Den minsta
(bagerijäst) består av två, korta specifika DNA- bitar vilka omger en längre och mer varierad
DNA-bit.
Målet med mitt examensarbete var att isolera en D. bruxellensis ARS/CEN. Jag började med
att skapa ett bibliotek (vektorer som innehåller genomiska DNA fragment) och
transformerade in detta i D. bruxellensis. Endast jästceller som tog vektorer med en
självständig sekvens eller en sekvens som gynnar integration till det genomiska DNA:t kunde
växa. För att få veta om de cellkolonier som växte innehöll självständiga vektorer eller om de
hade integrerat till det genomiska DNA:t gjordes ett flertal tester, varav alla tydde på att
plasmidena var självständiga. De var dessutom mer effektiva att transformera med än en linjär
plasmid. Det visade sig att fyra av åtta sekvenser innehöll genomiska fragment som fanns på
alla D. bruxellensis kromosomer, vilket tyder på att de fanns i flera kopior. Två av
plasmiderna innehöll genomiska fragment med en identisk, kortare DNA sekvens medan två
andra innehöll en annan identisk, längre sekvens. Den förstnämnda undersöktes vidare och
flertal potentiella DNA-bitar, som liknande centromererna i S. cerevisiae hittades. Fragmentet
minskades då till hälften (innehållande dessa bitar) och trots detta fungerade den fortfarande
vilket tydde på att det var här aktiviteten fanns. Stabiliteten för vektorerna (innehållande de
sekvenser som hittades i flera av vektorerna) testades också och resultatet blev en stabilitet
mellan 34 och 90 procent. Detta tydde på att plasmiderna var semi-stabila och inte integrerade
i genomet, eftersom de då hade varit 100 procent stabila. Det talde även emot att det var en
ARS eftersom dessa är väldigt instabila.
Resultaten tyder på att en eller två centromerer har isolerats och att D. bruxellensis är en art
som har punktcentromerer. Centromersekvenserna kan användas för vidare studier av denna
jäst, när självständiga och stabila plasmider behövs. Exempelvis kan vinindustrin använda den
för att förtrycka de mekanismer som leder till jästens illasmakande ämnen, eller så kan
ölindustrin använda den för att utveckla nya spännande smaker. Även bioetanolindutrin kan
dra nytta av mina resultat, till exempelvis genom att öka avkastningen av etanolproduktionen.
Handledare: Linda Hellborg och Jure Piskur
Examensarbete 30 hp i molekylär genetik. Vt 2008
Insitutionen för cell- och organismbiologi, Lunds universitet
Åsa Hagström
Autonomously Replicating Sequence elements in the wine spoilage yeast
Dekkera bruxellensis
The lineages of, baker’s yeast, Saccharomyces cerevisiae and the wine spoilage yeast,
Dekkera bruxellensis, are believed to have separated from each other at least 200 million
years ago. They do, surprisingly enough, share several unique traits, such as good ethanol
production, the ability to survive without oxygen, and the generation of mitochondrial DNA
deficient mutants (petites). In this study we attempted to learn about sequences that promote
DNA replication in D. bruxellensis.
Two genomic DNA libraries were constructed in a vector carrying the D. bruxellensis URA3
gene but no yeast replication active sequences. Optimisation of a DNA transformation
protocol employing a D. bruxellensis ura3 strain yielded several transformants. The
corresponding plasmid fragments were rescued from the yeast transformants into Escherichia
coli and the insert sequence determined. When the total DNA content of the yeast
transformants was analysed, in several cases the plasmid DNA was found to be present as an
autonomous DNA piece in the cell. Growth under non-selective conditions showed a
pronounced plasmid loss (34-90%), generating cells without the plasmid.
All together, this suggests that the plasmids carried an ARS or CEN like sequence. When the
primary structure of a few of the inserts were analysed we surprisingly found out that they
carry short motifs homologous to the S. cerevisiae centromeric elements, but not to the
Candida albicans and/or Yarrowia lipolytica centromeric elements. Could it be that (i) S.
cerevisiae and D. bruxellensis are more closely related than so far deduced, or (ii) the S.
cerevisiae/D. bruxellensis centromere organisation is an ancient one, which has been modified
in some yeast lineages, or (iii) there is a parallel evolution in the two lineages resulting in
similar centromeres? Nevertheless, from the applied point of view our results represent a
valuable molecular biology tool to construct an autonomously replicating vector for further
studies of D. bruxellensis.
Advisor: Jure Piskur and Linda Hellborg
Degree project 30 credits in Molecular Genetics. Spring 2008
Department of Cell and Organism Biology, Lund University
