Umeå Universitet
Biomedicinska analytikerprogrammet
Separation av plasmaproteiner med elektrofores,
HYDRAGEL PROTEIN(E) K20
Årskull:
Laborationsrapport i Klinisk laboratoriemetodik 1, termin 4
Laborationsdatum:
Handledare:
Granskare:
Inlämnad:
Godkänd:
Abstrakt
I levern bildas plasmaproteiner med undantag för immunglobuliner som produceras av B- lymfocyter i
benmärgen. Vid en infektion aktiveras leverceller att producera akutfasproteiner som interagerar vid
akutfasreaktioner, men vid en hematologisk cancer ökar produktionen av en viss monoklonal
immunglobulin (M-komponent). Dessa två proteinproduktioner kan analyseras med elektrofores
genom att aminosyrorna görs negativt laddade. Syftet med denna laboration var att analysera tre
patienters serumprover mot normala plasma- och serumprover med hjälp av elektrofores HYDRAGEL
PROTEIN(E) K20. De tre patienternas prover samt de nytagna plasma- och serumproverna
applicerades till agarosgelen och proteinerna in- och avfärgades enligt anvisningarna för
elektroforesen. Resultaten för patient 1 och 2 visade varsitt starkt sista band med uppklarnade zoner
runtom, detta påvisade att patienterna drabbats av en hematologisk cancer. Den tredje patientens
band konstaterade att det pågick en akutfasreaktion till följd av en infektion.
Nyckelord
Infektion, akutfasproteiner, hematologisk cancer, immunglobulin och elektrofores.
2
Innehållsförteckning
Abstrakt .......................................................................................................................................................... 2
Nyckelord ................................................................................................................................................... 2
Innehållsförteckning ...................................................................................................................................... 3
Introduktion ................................................................................................................................................... 4
Material och metod ........................................................................................................................................ 5
Resultat ........................................................................................................................................................... 6
Diskussion ...................................................................................................................................................... 7
Referenser....................................................................................................................................................... 8
Figurer ............................................................................................................................................................ 9
Riskbedömning av Blod ............................................................................................................................... 10
Riskbedömning av Natriumazid .................................................................................................................. 11
Riskbedömning av Natriumbarbital ........................................................................................................... 12
3
Introduktion
Blod består av komponenterna blodkroppar och plasma. Plasmans innehåll är till stor del vatten och
proteiner. Plasmaproteinernas huvudsakliga uppgift är att upprätthålla det kolloidosmotiska trycket,
transportera lågmolekylära föreningar och utgöra en integrerad del av försvarsmekanismer. I levern
bildas de flesta plasmaproteinerna med undantag för immunglobulinerna som produceras av Blymfocyterna i benmärgen. Vid en infektion eller ett inflammatoriskt tillstånd aktiveras levercellerna
att producera plasmaproteiner som interagerar vid akutfasreaktioner, så kallade akutfasproteiner. Creaktivt protein (CRP) och α1-antikymotrypsin har högst synteshastighet jämfört med α1-antitrypsin,
orosomukid, haptoglobin, fibrinogen och komplementfaktorerna C3 samt C4 (1). Vid analys med
proteinelektrofores, vilket är en metod för att diagnostisera proteinabnormaliteter i exempelvis serum,
kan man se en pågående akutfasreaktion. Detta genom att α1- antitrypsin, haptoglobin och fibrinogen
framträder starkare på agarosgelen jämfört med normalserum eller normalplasma (2). Skulle däremot
B-lymfocyter öka sin produktion av en viss monoklonal immunglobulin till följd av en hematologisk
cancer skulle detta sjukdomstillstånd synas som ett betydligt kraftigare band med uppklarnade zoner
runtom (M- komponent) (2,3). För att kunna utnyttja denna metod måste proteinets byggstenar
(aminosyror) vara negativt laddade. Genom att ändra aminosyrornas miljö kan de fungera som
antingen syror eller baser. Alla proteiner har en isoelektriskpunkt vilket innebär att antalet positiva
och negativa laddningar är lika vid ett visst pH-värde. Plasmaproteinernas isoelektriskapunkt infinner
sig mellan pH 4,6-7,2 och genom att höja omgivningens pH till 8,5 blir aminosyrorna negativt laddade.
De negativt laddade plasmaproteinerna kommer att vandra mot anoden och separeras med avseende
på storlek, laddning och form (2).
Syftet med denna laboration var att analysera tre patienters serumprover mot normala plasma- och
serumprover med hjälp av elektrofores HYDRAGEL PROTEIN(E) K20.
4
Material och metod
Venprovtagning:
Provtagning enligt föreskrifter gjordes och det användes natriumcitratrör samt serumrör med gel.
Elektrofores med HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 kit:
Ramens nedre del på applikatorhållaren fuktades med 120 µl destillerat vatten. Ett tunt filterpapper
sattes på en agarosgelplatta (agaros 0,8g/dl; Tris- barbitalbuffert pH 8,5 ± 0,1) för att absorbera
överflödig fukt från gelen. Agarosgelplattan placerades mot applikatorhållarens nedre del med
gelsidan uppåt. Till en applikator applicerades 2 plasma- och 2 serumprover som normala referenser
samt serumprover från 3 patienter. Applikatorn sattes till hållarens femte skåra och fick komma i
kontakt med gelen i 40 sekunder. Agarosgelplattan placerades med gelsidan nedåt i en
elektroforeskammare fylld med buffert (stocklösning + destillerat vatten 1:10, Tris- barbital pH8,5 ±
0,3; natriumazid), enligt gelens polaritet. Elektroforeskammaren kopplades till en strömkälla (sebia)
programmerad på 90V och proteinerna fick vandra i 22 minuter.
Fixeringssteg:
Agarosgelplattan torkades i en inkubator (sebia) vid 80°C i 10 minuter för att fixera proteinerna.
In- och avfärgning:
Gelen placerades i infärgningslösning (acidviolett+ destillerat vatten, 1:4) under 4 minuter för att
sedan avfärgas i avfärgningslösning (stocklösning + destillerat vatten 1:1000, 0,05g citronsyra/dl) fyra
gånger, fyra minuter vardera. Därefter torkades gelen likt ovan.
5
Resultat
Vandringsträckorna för proteinerna i de normala referens-proverna gav starka tydliga band. För
proteinerna i plasmaproverna framträdde ett ytterligare band jämfört med de normala serumproverna
och patientproverna. För patient 1 framträdde ett grovt sista band med uppklarnade zoner runtom.
Serumprovet för patient 2 gav också ett tydligt sista band med uppklarnade zoner, dock inte lika
markant som för patient 1. För patient 3 uppträdde två av banden skarpare utan uppklarningszoner
jämfört med patient 1 och 2. De fyra normala referens- proverna visade överlag mörkare band än de
tre patient- provernas band (figur 1).
6
Diskussion
Det som har stärkt att patienternas prover är serum, är att det inte existerar något fibrinogenband.
Hos patient 1 och 2 ses två starka sista band vilket tyder på att de båda patienterna har en Mkomponent och de uppklarnade zonerna tydliggör ökad produktion av en viss monoklonal
immunglobulin. Sista bandet för patient 1 som är starkare jämfört med patient 2 kan bero på att
serumprovet har varit färskare eller att sjukdomsförloppet varit längre framskridet. De två banden
som framträder starkare hos patient 3 är belägen där akutfasproteinerna α1 antitrypsin och
haptoglobin har sin kända plats. Detta tyder på att patient 3 har en pågående akutfasreaktion i
kroppen. Alla normala referens- prover visar mörkare band än patienternas, detta kan bero på att
patientproverna har varit frysta och upptinade ett flertal gånger. Proteinerna i patienternas prover har
då tagit skada och mängden blivit mindre.
7
Referenser
1 Plasmaproteiner och elektrofores. Biomedicinska analytikerprogrammet, Klinisk laboratoriemetodik
1, Umeå universitet.
2 Elektrofores med HYDRAGEL PROTEIN(E) K20. Laborationsanvisningar, Biomedicinska
analytikerprogrammet, Klinisk laboratoriemetodik 1, Umeå Universitet.
3 Wikipedia. Myelom. [Elektronisk]. Tillgänglig<http://sv.wikipedia.org/wiki/Myelom> [2010-02-25]
4 Kemi. Databaser. Ämnesregister. Fenol/kloroform. [Elektronisk]
Tillgänglig < http://apps.kemi.se/Amnesregistret/default.cfm> [2010-01-19]
8
Figurer
Figur 1: Agarosgel med negativa referenser i brunn 1-4 (1-2 plasmaprover och 3-4 serumprover), i
brunn 5: patient 1, i brunn 6: patient 2 och i brunn 7: patient 3.
9
Riskbedömning av Blod
På vilket sätt är kemikalien farlig?
Tänk på att blod alltid ska betraktas som smittat. Det kan innehålla livshotande smittor som kan ge
kroniska sjukdomar så som HIV/Aids och Hepatit.
Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning
Använd alltid handskar och skyddsrock vid exponering. Låt inte skärande och stickande föremål ligga
framme oskyddat. Undvik stress vid provtagningar som kan leda till olyckor. Kvarvarande prover,
använda kanyler och dylikt skall hanteras som riskavfall. Tänk på att rengöra, sterilisera arbetsytor.
Skyddsåtgärder
Vid olycka kontakta omedelbart arbetsgivare och uppsök läkare för vidare utredning.
Avfallshantering
Hanteras och slängs som riskavfall.
10
Riskbedömning av Natriumazid
CAS- nr 26628-22-8
På vilket sätt är kemikalien farlig?
Miljöfarlig
Mycket giftig
Den är mycket giftig vid förtäring, utvecklar mycket giftig gas vid kontakt med syra. Mycket giftig för
vattenlevande organismer och kan orsaka skadliga långtidseffekter i vattenmiljön.
Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning
Använd skyddsutrustning så som skyddsrock, handskar, munskydd, dragskåp och glasögon (aldrig
använda linser). Förvaras inlåst, oåtkomligt för barn.
Skyddsåtgärder
Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan skölj rikligt med vatten, kontakta sedan läkare och visa
etiketten. Undvik exponering och vid användning begär special instruktioner.
Avfallshantering
Hanteras och slängs som riskavfall.
11
Riskbedömning av Natriumbarbital
På vilket sätt är kemikalien farlig?
Natriumbarbital har en lugnande och sömngivande effekt, är narkotikaklassat. Förtäring kan det leda
till döden.
Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning
Använd skyddsutrustning så som skyddsrock, handskar, munskydd, dragskåp och glasögon (aldrig
använda linser). Skall förvaras inlåst och oåtkomligt för barn.
Skyddsåtgärder
Vid illamående eller annan påverkan kontakta läkare och visa etiketten.
Avfallshantering
Hanteras och slängs som riskavfall.
12
