Separationsmetoder
Separationsmetoder
• Kromatografi, gas (GC) eller vätska (LC)
• Elektrofores
• Masspektrometri
Kromatografi
• Gaskromatografi, GC
Separation av t.ex. alkoholer, fetter, …
• Vätskekromatografi, LC (t.ex HPLC)
Separation av vattenlösliga ämnen som ej
tål höga temperaturer t.ex. proteiner, DNA,
…
Kromatografi
• Provet passerar en kolonn
som separerar partiklarna
med avseende på storlek
eller kemiska egenskaper
beroende på kolonnmaterialets egenskaper
• Separationen sker genom att en rörlig fas
med de lösta ämnena rör sig genom en fast
fas (stationär fas).
• Den rörliga fasen kan vara i vätske- eller
gasform.
• Den stationära fasen kan vara i fast eller
vätskeform (gel)
Gaskromatograf
FID detektor
HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Diod-Array detektor
Affinitetskromatografi
Elektrofores
• Separation av t.ex. proteiner eller DNA
fragment efter storlek och ladding.
• Bestämning av DNA sekvens, sekvensering
Elektrofores
• Joner separeras i en gel
genom att de utsätts för
ett elektriskt fält.
• Jonerna kan separeras
på grund av sin laddning
och storlek.
Sekvensering
Elektrofores
Kapillär-elektrofores
Mass- spektrometri (MS)
• Bestämma massan på molekyler och
atomer
• Framställa fragment i gasform av provet
• Mäta massan på fragmenten.
• Fragmenten ger ett fingeravtryck av provet
• Studera relativa andelen av olika
fragmentens massor.
• Studera relativa andelen av olika isotoper.
Historiskt perspektiv
• J.J Thompson : Upptäckte att Neon hade
flera isotoper c:a 1900. Fragmentering av
molekyler.
• Dempster : konstruerade första ms med
riktningsfokusering c.a 1920, elektron källa.
Användes t.ex vid anrikning av U-235 för
första Atombomben.
Principen för en enkel Mass
Spektrometer (MS)
massan = m
laddningen = q
r
r är unik för ett värde
på kvoten m/q
Mass spektrum av benzyl alkohol
Joniseringsmetod
Electron Impact Ionization
Joniseringsmetoder
Matrix-Assisted Laser Desorption
Ionization (MALDI)
Analysmetoder
(MALDI) ToF
Mass-spektrum
Analysmetoder
Quadropole mass filter
-(U+Vcos(wt))
+(U +Vcos(wt))
Joniseringmetoder
Electronspray (ESI)
•
•
•
•
1 – 5kV spänning då areosolen lämnar kapillären.
”dropparna” torkar in (”hyperladdning”)
Coulombic explosion
Jonerna i gasfas
GCMS
homepage.univie.ac.at/Wolfgang.Werther/Folie1.JPG
Historiskt perspektiv
• GC-MS mitten på 50-talet. Test av
läkemedel, hormoner, föroreningar,…
• MALDI (1985), ES-MS (1988) m.fl. har
gett möjlighet att studera stora
biomolekyler. (Nobelpris 2002)
Kan användas vid diagnos av t.ex Malaria
och Cancer (äggstock-, prostata-, bröst-)
Jonisationsmetoder
Jonisations
metod
Typisk
molekyl
Prov
preparation
Mass range
Egenskaper
EI
Liten flyktig
GC/vätske eller
fast prob
-1000 Da
Hård ger
struktur info
CI
Liten flyktig
GC/vätske eller
fast prob
- 1000 Da
Mjuk
ESI
Peptid/protein
LC/spruta
- 200 000 Da
Mjuk / multiladdad
FAB
Kolhydrater
Prov +Matrix
- 6000 Da
Hårdare än ESI
MALDI
Peptid/protein
Prov +Matrix
- 500 000 Da
mjuk
