Separationsmetoder
Separationsmetoder
• Kromatografi, gas (GC) eller vätska (LC)
• Elektrofores
• Masspektrometri
Kromatografi
• Gaskromatografi, GC
Separation av t.ex. alkoholer, fetter, …
• Vätskekromatografi, LC (t.ex HPLC)
Separation av vattenlösliga ämnen som ej
tål höga temperaturer t.ex. proteiner, DNA,
…
Kromatografi
• Provet passerar en kolonn
som separerar partiklarna
med avseende på storlek
eller kemiska egenskaper
beroende på kolonnmaterialets egenskaper
• Separationen sker genom att en rörlig fas
med de lösta ämnena rör sig genom en fast
fas (stationär fas).
• Den rörliga fasen kan vara i vätske- eller
gasform.
• Den stationära fasen kan vara i fast eller
vätskeform (gel)
Gaskromatograf
http://www.youtube.com/watch?v=
q0pM-k0SvOQ&feature=related
FID detektor
HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Affinitetskromatografi
Kromatogram från HPLC
Diod-Array detektor
Elektrofores
Elektrofores
• Separation av t.ex. proteiner eller DNA
fragment efter storlek och ladding.
• Bestämning av DNA sekvens, sekvensering
Elektrofores
• Joner separeras i en gel
genom att de utsätts för
ett elektriskt fält.
• Jonerna kan separeras
på grund av sin laddning
och storlek.
Sekvensering
Kapillär-elektrofores
Mass spektrometri
MS
Separation av joner med avseende på massa
och laddning
Mass -spektrometer
Mass-spektrometri
Historiskt perspektiv
• J.J Thompson : Upptäckte att Neon hade
flera isotoper c:a 1900. Fragmentering av
molekyler.
• Dempster : konstruerade första ms med
riktningsfokusering c.a 1920, elektron källa.
Användes t.ex vid anrikning av U-235 för
första Atombomben.
Mass- spektrometri (MS)
• Bestämma massan på molekyler och
atomer
• Framställa fragment i gasform av provet
• Mäta massan på fragmenten.
• Fragmenten ger ett fingeravtryck av provet
• Studera relativa andelen av olika
fragmentens massor.
• Studera relativa andelen av olika isotoper.
Blockschema för Mass spektrometer
Vakuum
Prov
från
HPLC
Jonkälla
ger
molekylel
laddning
Analysator Detektor
acceleration
separation
Presentations
enhet
Registrerar
pulsen
Joniseringsmetod
Electron Impact Ionization
Exempel på vanliga fragment
Mass spektrum av benzyl alkohol
Joniseringsmetoder
Matrix-Assisted Laser Desorption
Ionization (MALDI)
Mass-spektrum
Joniseringmetoder
Electronspray (ESI)
•
•
•
•
1 – 5kV spänning då areosolen lämnar kapillären.
”dropparna” torkar in (”hyperladdning”)
Coulombic explosion
Jonerna i gasfas
Joniseringsmetod
Electron spray
”rå-spektrum” från ESI-MS
Analysmetoder
(MALDI) ToF
Analysmetoder
Quadropole mass filter
-(U+Vcos(wt))
+(U +Vcos(wt))
Analysmetoder för MS
Acceleration i
elektriskt fält
E
+ 4000V
0V
+ F
+
+
+
+
v
E
d
F = q*E
mv2/2 = q* U
v2 = q* V*2/m
Böjning i magnetfält
F= q*v * B
m/q = B * r/v
F = mv2/r
XXXXX
r
F
XXXXX B
v
XXXXX
F
Analysmetoder magnetsektor
instrument (MS)
massan = m
laddningen = q
r
r är unik för ett värde
på kvoten m/q
GCMS
homepage.univie.ac.at/Wolfgang.Werther/Folie1.JPG
GC-MS system
Historiskt perspektiv
• GC-MS mitten på 50-talet. Test av
läkemedel, hormoner, föroreningar,…
• MALDI (1985), ES-MS (1988) m.fl. har
gett möjlighet att studera stora
biomolekyler. (Nobelpris 2002)
Kan användas vid diagnos av t.ex Malaria
och Cancer (äggstock-, prostata-, bröst-)
Jonisationsmetoder
Jonisations
metod
Typisk
molekyl
Prov
preparation
Mass range
Egenskaper
EI
Liten flyktig
GC/vätske eller
fast prob
-1000 Da
Hård ger
struktur info
CI
Liten flyktig
GC/vätske eller
fast prob
- 1000 Da
Mjuk
ESI
Peptid/protein
LC/spruta
- 200 000 Da
Mjuk / multiladdad
FAB
Kolhydrater
Prov +Matrix
- 6000 Da
Hårdare än ESI
MALDI
Peptid/protein
Prov +Matrix
- 500 000 Da
mjuk
