Masspektrometri

Masspektrometri
682.0
683.0
684.0
m/z
Margareta Ramström Jonsson
Föreläsning 07-03-23
Uppbyggnad, MS
Jonkälla
Molekyler joniseras
Ex. Elektrospray, MALDI
Massanalysator
Jonerna separeras med
avseende på massa och
laddning.
Ex. Quadrupole, time-offlight, FTICR
Detektor
Massa-överladdning
detekteras
Jonisering
- Både katjoner och anjoner kan bildas!
- Katjoner är vanligast.
Exempel
[M+H+]
[M+Na+]
Joniseringstekniker
Vid analys av biomolekyler är det nödvändigt att använda
milda joniseringstekniker!
Elektrospray och MALDI !
Jonisering med elektrospray
•Sker vid atmosfärstryck.
• Positiv elektrospray är vanligast för proteiner och peptider => positivt
laddade joner analyseras.
•Provet löses i t.ex. 50:50 H2O: organiskt lösningsmedel + låg andel syra,
t.ex. ättiksyra (HAc).
•Provmolekylerna är positivt laddade redan i lösningen.
Sample
Electrospray ionization
MS inlet
(Positive electrospray)
En högspänning läggs mellan spraykapillären och MS, vanligen 2-3 kV.
En ”taylorkon” bildas och vätskan delas i små droppar. Lösningsmedlet
evaporerar, laddningsrepulsionen ökar och dropparna spricker till ännu mindre
enheter, och slutligen formas ”nakna” joner.
Exempel
Elektrosprayspektrum av myoglobin
21+ 20+
HHM 1:1000 in 5% ACN, 1% HOAc
Ronny_050701_001 29 (2.501) Cm (26:34)
22+
100
23+
808.180
848.547
19+
893.139
18+
942.712
771.480
17+
998.153
24+
TOF MS ES+
6.64e3
738.006
16+
1060.438
707.336
1131.119
25+
%
26+
15+
14+
1211.822
679.075
653.020
976.937
0
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
1250
m/z
Myoglobin, Mw=16952.6 Da
OBS! I elektrospray blir större molekyler multipelladdade. Går att kombinera
med instrument med begränsat m/z-område.
För att beräkna molekylvikten ur spektret måste vi göra en DEKONVOLERING.
Finns oftast inbyggd i mjukvaran som styr masspektrometern.
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
Prov
Matris
Provet blandas med en matris
=> Läggs på en MALDI-target.
Matrisen – en liten organisk molekyl som
absorberar starkt i UV-området
Prov + matris kristalliserar på target innan
denna sätts in i masspektrometern.
Vanliga MALDI-matriser
Kommer ni att använda
på lab.
MALDI, forts.
laser
Intorkning
+
H+
Proton transfer
Desorption
•Provet beskjuts med laser
•Matrisen absorberar laserljus
•Energiöverföring sker
•Provmolekylerna joniseras
MALDI-spektrum av myoglobin
Voyager Spec #1=>MC=>MC=>SM9[BP = 5737.0, 2566]
16952.10
100
1224.8
90
80
% Intensity
Intensitet
70
60
50
40
30
20
17162.57
10
0
12754
14644
16534
18424
Mass (m/z)
m/z
Peptider – oftast bara enkelladdade joner
Proteiner – enkel- och ev. dubbelladdade.
20314
0
22204
MALDI eller elektrospray?
För biomolekyler är ofta båda ett bra val.
MALDI
Elektrospray
•God känslighet
•”High throughput”
•Mer tolerant mot salter
•Lättolkade spektrum
•Kan kopplas on-line till LC och CE
•God känslighet, speciellt om nanospray används
•Man får generellt sett bättre
massnoggrannhet även för stora
molekyler.
Massanalysatorer
Uppgift: Att separera jonerna map m/z, så att de sedan kan räknas av detektorn.
Utnyttjar joners egenskaper i elektriska och/eller magnetiska fält.
Exempel på vanliga analysatorer:
•Quadrupole
•Magnetisk eller elektrisk sektor
•Time-of-flight (ToF)
•Jonfälla (ion trap)
•Fourier-transform-joncyklotronresonans MS (FTICR)
Viktiga begrepp
Massnoggrannhet- Hur noggrant kan massan
bestämmas?
Upplösning- Förmåga att separera toppar med
närliggande massor.
Detektionsgräns- Den minsta mängd analyt som
ger signal
Quadrupole
Scannas
Instrumentet scannas
För varje steg når joner av exakt ett m/z detektorn
Konstant fält
Quadrupole MS
• Relativt långsamt instrument
• Begränsad massnoggrannhet
• Lätt att kalibrera
• Robust, relativt billigt
• Används ofta i MS/MS-experiment
Time-of-flight (ToF)
Flygrör
+
+ 20 kV
d
Då jonen lämnar det elektriska fältet
W = mv2/2= qV
där v=hastigheten, m=massan, q=laddning, V=potentialskillnad
Flygtiden genom röret
(Använder ni i labkursen)
t =d/v
För att förbättra upplösningen i ToF används en reflektor = en ”jonspegel”.
I reflektorn byter jonerna riktning pga ett elektriskt fält. Beroende av initial
rörelseenergi rör sig jonerna olika långt in i fältet innan de vänder.
Kompenserar för små skillnader i kinetisk energi, initial position och tidpunkt
då jonerna bildades.
Jämförelse
Reflektor ToF
Intens. [a.u.]
Intens. [a.u.]
Linjär ToF
2000
3000
2500
1500
2000
1500
1000
1000
500
500
0
420
2440
2460
2480
2500
0
2520
m /z
40
2445
2450
2455
2460
2465
Samma peptid. Reflektormode ger betydligt bättre upplösning.
2470
2475
2480
2485
m /z
ToF MS är ett snabbt instrument.
- Både elektrospray och MALDI kan användas som
jonkälla
- Bra val om man vill koppla snabba
separationstekniker on-line till masspektrometern
- I princip obegränsat massområde
- Ger hög upplösning i reflector mode
Fourier-transform-joncyklotron-resonans (FTICR) MS
Magnet, 9.4 T
B
Electrospray
Hexapole
Ion optics
Analyzer cell
Skimmer
Capillary
Cyclotron Motion
v
B
Lorentz force
F
F = q(v x B)
fc=qB/2!m
•Ultrahög upplösning (resolving
power >106)
•Hög massnoggrannhet (subppm)
•Hög känslighet
682.0
683.0
684.0
m/z
Excitation och detektion
•Ett par excitationsplattor: Joner i resonans med excitationsfrekvensen
absorberar energi och kommer att cirkulera i bana med större radie. Alla joner
med samma m/z rör sig koherent.
•Ett par detektorplattor: Detekterar strömmen som den koherenta rörelsen ger
upphov till.
OBS! I en FTICR sker masseparation och detektion på samma plats – i cellen!
Bra val om man vill analysera
-Komplexa prover
-Behöver hög massnoggrannhet
-De flesta grupper jobbar med ESI- FTICR MS, men möjlighet att
jonisera med MALDI finns också.
Numera även mycket vanligt med hybridinstrument
- Idé: Kombinera de bästa egenskaperna hos två instrument.
Ett vanlig exempel är Quadrupole-Time-of-Flight (q-TOF)
- Bra tandem-MS-möjligheter i ett TOF-instrument!
Detektorer
Generell princip:
Jonerna når ytan på detektorn
Elektronöverföring sker
Elektrisk ström
Signal till datorn som omvandlar till
masspektrum
Bilden: Princip för elektronmultiplikator
Tolkning av masspekta
Isotopfördelning i ett spektrum med god upplösning
Monoisotopisk massa
1:a isotoptoppen
2:a isotoptoppen
682.0
683.0
(Från FTICR)
684.0
m/z
( 12C " 98,9%, 13C " 1,1%
=> Vi får olika teoretiska massor
beroende av isotopsammansättningen =>
Isotoptoppar)
I spektrum med hög upplösning
kan vi lätt avgöra vilken laddning
jonen har, och därmed
molekylmassan.
M+H+
M+3H+
M+2H+
M+4H+
Tandem MS, peptidfragmentering
Ger info om sekvensen, peptidens uppbyggnad.
a1
b1
c1
O
O
H2N - CH – C – NH – CH – C - R1
R2
xn-1 yn-1
zn-1
Fragmenten kallas a, b och c respektive x, y och z beroende på var
fragmenteringen sker och vilken ände som joniseras.
HUR DÅ?
Exempel Fragmentering i quadrupole
Q1
Val av
precursorjon
Q2
Kollisionscell.
Jonerna
kolliderar med
gasmolekyler
Q3
Scannas. Ett massspektrum registreras
CID - collision induced dissociation (ovan)
Här dominerar fragmentering av peptidbindning, dvs vi får b- och y-fragment!
CID kan genereras i de flesta masspektrometrar på olika sätt.
Andra sätt att fragmentera kan vara genom att beskjuta provmolekylerna med
fotoner (laser) eller elektroner.
Aminosyrornas massor (i peptidkedjan)
Klipp in tabellen från kursboken.
Skillnaden mellan två närliggande fragment ger massan på den aminosyra som skiljer.
V
b-fragments
A
Q
L
y-fragments
E
L
G G G
G G G
L
b7
[M+2H]2+
y11
b11
y12
b8
b9
b6
b10
y13
y14
y15
b12
b13
600
800
1000
1200
1400
b14
b15 y17
1600
y19
b18
1800
m/z
Vi räknar ett exempel!
Traditionell Proteomics
2D PAGE ryggmärgsvätska
•Separera proteiner på gel
•Färga in
•Lokalisera spottar av intresse
•Skär ut gelbit
•Digerera proteinet med hjälp
av ett enzym (trypsin)
•Kör MS på resulterande
peptider
•Databassökning
Figure from Kim et al. Stroke 2003:24,2835-2841
Trypsin klyver specifikt C-terminalt om lysin (K) och arginin (R).
Myoglobin
GLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKS
EDEMKASEDLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYL
EFISECIIQVLQSKHP GDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKELGFQG
(Leta upp klyvningssajterna!)
Viktigt att definiera klyvningsförhållandena, t.ex. reducera cysteinbryggor.
Tänkbara tryptiska peptider (myoglobin)
1
397.2563
397.5010
48
50
0
(K) HLK (S)
1
407.2658
407.5368
32
34
0
(R) LFK (G)
1
409.2087
409.4655
43
45
0
(K) FDK (F)
1
456.3186
456.6098
99
102
0
(K) IPVK (Y)
1
650.3150
650.7138
148
153
0
(K) ELGFQG (-)
1
662.3361
662.7223
57
62
0
(K) ASEDLK (K)
1
738.2980
738.7965
51
56
0
(K) SEDEMK (A)
1
748.4357
748.9062
134
139
0
(K) ALELFR (K)
1
754.2929
754.7959
51
56
0
(K)SEDEMK(A)
1
828.3562
828.9251
141
147
0
(K) DMASNYK (E)
1
844.3511
844.9245
141
147
0
(K)DMASNYK(E)
1
910.4634
911.0088
35
42
0
(K) GHPETLEK (F)
1
1350.8109
1351.6426
64
77
0
(K) HGATVLTALGGILK (K)
1
1515.6651
1516.6425
119
133
0
(K) HPGDFGADAQGAMNK (A)
1
1531.6600
1532.6419
119
133
0
(K)HPGDFGADAQGAMNK(A)
1
1632.8709
1633.8566
17
31
0
(K) VEADIPGHGQEVLIR (L)
1
1800.9285
1802.0530
1
16
0
(-) GLSDGEWQLVLNVWGK (V)
1
1853.9622
1855.0766
80
96
0
(K) GHHEAEIKPLAQSHATK (H)
1
1970.0309
1971.3381
103
118
0
(K) YLEFISECIIQVLQSK (H)
1Met-ox
1Met-ox
1Met-ox
Intens. [a.u.]
Exempel: Enzymatiskt digerat, serum albumin
Elektrospray
MALDI
4000
3000
2000
1000
0
500
700
900
1100
1300
1500
1700 m/z
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
Man får komplexa spektra. Elektrosprayspektret något mer komplext än MALDIspektret. Då man använder elektrospray är det även vanligt att analysera med
HPLC-MS.
m /z
Databassökningar
(Exempel på program)
Info från gel
Klistra in massorna här!
Välj tolerans
beroende på
MS-metod
http://prowl.rockefeller.edu/profound_bin/WebProFound.exe
Man får en lista på
tänkbara proteiner
rankade i ordning
efter vilken som är
troligast.
Information om vilka
peptider som matchade
de experimentella
massorna, var i
proteinsekvensen dessa
befinner sig och mätfelet.
Alternativa metoder
”Shot-gun” eller ”bottom-up” proteomics
•Klyv proteinerna mha ett enzym
•Separera peptiderna (LC, CE eller separation i flera
dimensioner)
•Detektion med MS eller MS/MS
•Databassökningar
Liquid
chromatography
Enzymatic
digestion
MS or MS/MS
Proteins
Peptides
Ryggmärgsvätska, klyvt
med trypsin.
(LC-MS)
tid
m/z
Fördelar:
Man slipper gel-steget, problem med pI och hydrofobicitet
Flera peptider från samma protein
Lätt att automatisera
Svårigheter:
Komplext mönster
Peptiderna från ett protein eluerar vid olika tider
Många sökmotorer är konstruerade för analys av gelband
Kvantitativ proteomics
Sample A
Sample B
Label with a
light marker
Label with a
heavy marker
Jämför koncentrationer i två
prover.
Flera gelfria metoder bygger på
kemisk inmärkning
Combine the
samples
I masspektret ser man signaler i
par. Den relativa intensiteten ger
relativ koncentration.
Mass spectrometry
Relative quantification
Exempel
ICAT
Affinity tag
Linker
Reactive group
•Länkdelen innehåller 1H eller deuterium 2H på X-positionerna. Skillnad i
massa mellan tung och lätt markör blir 8 Da.
•Reaktiva gruppen märker in cysteiner.
•En biotin-tag för isolering av inmärkta peptider.
Att tänka på vid provpreparering
Proverna måste vara lösta i för joniseringstekniken
lämpliga lösningsmedel.
Salter stör joniseringen.
Kontaminanter från laboranten bör undvikas. Handskar på!
(Vanligt: keratin från hud, polyetylenglykol (PEG) från t.ex.
hudkrämer).
Vilka mängder är lämpliga att jobba med?
MALDI
• Lämplig mängd peptid på MALDI-target är 1 pmol (10-12 mol).
• Man laddar ca 1 µL av varje prov.
• För proteiner behövs något större mängd, beroende på molekylens
storlek.
Electrospray
• Vid direktinfusion är en lämplig provkoncentration 1µM.
• Nanospray har drastiskt ökat känsligheten i elektrosprayinstrument. Låga
flöden ca 10nL/min används. Provåtgången är mycket låg.
•Kopplingar av olika separationstekniker till masspektrometern ökar
känsligheten. Provets komplexitet minskar, varje komponent koncentreras.
Rekord: 30 zeptomol (10-21 mol) av proteiner i storleksordningen 8 to 20 kDa
har detekterats i en specialpreparerad FTICR MS.