Kloning av cellcykel-gener från Sulfolobus acidocaldarius.
Erik Karlsson
Det finns tre huvudgrupper av levande organismer – Bakterier, Eukaryoter och Arkéer, där de
två senare är närmare släkt med varandra än med bakterier. En stor del av nyckelfunktionerna
i deras cellmaskineri fungerar på liknande sätt, vilket gör arkéer intressanta att studera som en
modell för hur eukaryota celler, inklusive våra egna, fungerar.
I mitt examensarbete har jag klonat elva gener från crenarkéen Sulfolobus acidocaldarius,
isolerad från heta källor. Jag har mångfaldigat generna från genomiskt DNA och satt in
bitarna i en plasmid - en konstgjord bakteriekromosom - som jag har fört in den vanliga
laboratoriebakterien Escherichia coli. Efter att ha försäkrat mig om att generna blivit insatta
på rätt håll i plasmiden utan mutationer, genom att masskopiera DNA:t och bestämma
bassekvensen, behandlade jag cellerna så att de bildade stora mängder proteiner från de
insatta generna. Cellerna slogs därefter sönder med ultraljud, och proteinerna renades genom
en kolonn klädd med nickel-joner. Eftersom proteinerna innehöll negativt laddade aminosyror
(histidin) så band de till de positivt laddade nickeljonerna. Resten av värdcellens
proteininnehåll kunde sedan tvättas bort, och därefter kunde bindningen mellan proteinet och
nickel-jonerna brytas, och proteinet renas fram.
De renade proteinerna kan nu studeras vidare. Proteinstrukturen kan avgöras genom
röntgenkristallografi, och från strukturen kan man få viktiga ledtrådar om proteinets funktion.
DNA-bindande proteiners bindnings-sekvens kan bestämmas. Protein kan lokaliseras i cellen
med olika mikroskopitekniker. Enzymers aktivitet kan studeras genom att mäta förbrukning
av deras substrat. Eventuella interaktions-partners kan bestämmas. På så vis kan de tio
proteinerna jag har klonat studeras, och deras funktion och roll i cellcykeln avgöra. Därmed
har ytterligare ett steg tagits mot ökad förståelse av cellcykelns funktion i arkéer, och ultimat
också i eukaryoter.
Examensarbete i biologi, 20p, VT 2006
Instutionen för biologisk grundutbildning och Institutionen för molekylär evolution, Uppsala Universitet
Handledare: Rolf Bernander
