Institutionen för hälsovetenskap och medicin
Enheten för Klinisk medicin
Program: Biomedicin och metoder inom medicin diagnostik
Kurs: BMLV, avancerad nivå, Examensarbete 15 hp
Datum: HT 2015
CK5/6 och CEA uttryck i skivepitelcancer i
lunga: en retrospektiv studie
Författare: Ihsan Kasim, B.Sc, M.Sc,
Gävle sjukhuset
Handledare: Hirsh Koyi, MD, PhD,
Gävle sjukhuset
Examinator: Allan Sirsjö, Prof,
Örebro universitet
CK5/6 och CEA uttryck i skivepitelcancer i
lunga: en retrospektiv studie
Ihsan Kasim
Bakgrund. Diagnostisk av lungcancer med exakt klassificering av tumörtypen, har stor
betydelse med specifik behandling.
Syfte. Att undersöka CK5/6 och CEA uttryck i lungtumörer som klassificerades som
skivepitelcancer efter rutin färgning (Hematoxylin- eosin).
Metod.
En
retrospektiv
studie
med
CK5/6
och
CEA
immunhistokemiska
färgningsmarkörer av lungbiopsier som initialt diagnostiserades som skivepitelcancer.
Resultat. I 61 lungbiopsier var 34,4% (n=21) CK5/6 positiva och CEA negativa. Dessa
representerade ren skivepitelcancer. I 47,5% (n=29) förekom både markörerna, CK5/6
och CEA färgning. Dessa klassificerades som adeno-skivepitelcancer. I 14,8% (n=9)
förekomst endast CEA färgning. Dessa klassificerades som adenocarcinom. I 3,3 % (n=2)
saknades både CK5/6 och CEA färgning. Dessa ansågs som odifferentierad cancer.
Konklusion. Många fall av skivepitelcancer i lungan uttrycker även körteldifferentiering.
Dessa förhållanden påverkar val av behandling.
Nyckelord:
lungcancer,
immunhistokemi.
skivepitelcancer,
adenocarcinom,
CK5/6,
CEA,
CK5/6 and CEA expression in lung
squamous cell carcinoma: a retrospective
analysis
Ihsan Kasim
Background Accurate classification of lung carcinomas is of importance for choice of
adequate chemotherapy
Aim To study CK5/6 and CEA expression in lung tumors classified as squamous cell
carcinomas after routine staining (Hematoxylin-eosin)
Method A retrospective study with CK5/6 and CEA immuno-histochemical staining of
lung biopsies with an initial diagnosis of squamous cell carcinoma
Results In 61 lung biopsies 34.4% (n=21) showed a pure CK5/6 staining and were
classified as squamous cell carcinomas. Twenty nine (47.5%) were both CK5/6 and CEA
stained and the CK5/6 immunoreaction predominated in all cases except in two in which
the CEA immunoreaction predominated. These tumors were re-classified as adenosquamous carcinomas. In nine cases (14.8%) were only CEA immunoreactive and were
re-classified as adenocarcinomas. Only 3.3% (2/61) stained negative for both CK5/6 and
CEA and were classified as undifferentiated carcinomas.
Conclusion The results show that lung squamous cell carcinomas routinely diagnosed in
Hematoxylin-eosin stained sections to a high extent could be re-classified to
adenocarcinoma after CK5/6 and CEA immunostaining. The re-classification may result
in a refined choice of treatment
Key words: lung cancer, squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, CK5/6, CEA,
expression.
Förkortningar
ADC
Adenocarcinom
BB
Bronkoskopi
CB
Core biopsi
CEA
Carcinoembrygent antigen
CK 5/6
Cytokeratin 5/6
DAB
Diaminobensidintetrahydroklorid
HE
Hematoxylin-eosin
H2O2
Väteperoxid
HTX
Hematoxylin
HRP
Horse radish peroxidas
IHK
Immunhistokemi
KDa
Kilodalton
NSCLC
Icke småcellig lungcancer
SCC
Skivepitelcancer
TTF-1
Tyroidea tanskriptionsfactor-1
WHO
World Health Organization
1
Introduktion
Lungcancer
Lungcancer är en aggressiv tumörsjukdom och den blir idag allt vanligare hos
befolkningen. Nästan 4000 individer diagnostiseras med lungcancer i Sverige per år. Det
är därmed den femte vanligaste cancerformen bland både män och kvinnor i landet. De
flesta som drabbas är mellan 60 och 80 år (1).
Lungcancer är den främsta orsaken till cancerrelaterad död i hela världen (2). Det är
samtidigt en cancerform med hög dödlighet, fem årsmortaliteten är närmare 90 % enligt
Europeiska data (3). Den står i Sverige för drygt var femte dödsfall i cancersjukdom (4)
och den totala incidensen är ca 40 fall per 100 000 invånare (5-6). I Gävleborg
diagnosticeras varje år mellan 100 och 130 nya fall. Av dessa har upp till 50 % av
patienterna fjärrmetastasering vid diagnostillfället och ytterligare ca 25 % lokalt
avancerad sjukdom med lymfkörtelmetastasering.
Den vanligaste orsaken till lungcancer är tobaksrökning. Även radon, asbest och avgaser
är exempel på medverkande faktorer till cancer utvecklingen. Oftast upptäckts lungcancer
sent eftersom symtomen kommer i ett skede när cancern redan har spridit sig. Vanligaste
symtomen är hosta, hemoptys (blodhosta), dyspné (andnöd), bröstsmärta, heshet, trötthet,
aptitlöshet, viktminskning och feber. Prognos och överlevnad av sjukdomen är mycket
dålig. Tidig diagnos samt behandling är avgörande för prognosen. (1, 7).
Totalt är femårsöverlevnaden 15-31 %, med en exponentiell minskning för personer med
lungcancer i sent skede, som förekommer hos ca 70 % av patienter med icke - småcellig
lungcancer (NSCLC) (2, 8-9). Femårsöverlevnaden har rapporterats vara ca 12 % för män
och 15 % för kvinnor i Sverige (5-6).
Det finns olika typer av lungcancer och de flesta uppträder i epitelvävnader som bronker
och i lungparenkym. Efter histologiskt utseende indelas lungcancer i två huvudgrupper:
Småcellig lungcancer (SCLC) som utgör ca 20 % och NSCLC som utgör ca 80 % av
2
fallen. De vanligaste typerna av NSCLC är skivepitelcancer (SCC) och adenocarcinom
(ADC) (1, 10).
Skivepitelcancer
SCC är en malign epitelialcell tumör som utgör nästan 25 % av cancerfallen (10). Det är
den vanligaste lungcancerformen hos män. Vanligen uppstår den centralt i primärbronk,
sekundärbronk eller segmentbronk. Den kan också uppstå i perifera delarna av lungan
(11). SCC utgår från metaplastiska skivepitelceller i bronker. Oftast växer den
långsammare och metastaserar något senare än t.ex. ADC (12).
Makroskopiskt är SCC en oregelbunden, ofta fast och gråvit tumör som ofta har nodulär
tillväxt med central nekros och kavitation. Histologiskt kännetecknas SCC av förekomst
av keratinpärlor (ett stabilt olösligt protein) och intracellulära bryggor mellan angränsade
tumörceller (figur1). Morfologiska typer av SCC inkluderar papillär, klarcellig, basaloid
och småcellig icke keratiniserande cancer. Immunhistoskemiskt (IHK) innehåller
vanligen SCC cytokeratin 5/6 antigen (CK 5/6) som finns i basala celler i normala
bronkepitelet (12).
Keratinpärl
a
Intracellulära bryggor
Figur 1. Skivepitelcancer med en keratinpärla och intracellulära bryggor, Hematoxylin eosin
färgning.
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Well_differentiated_squamous_cell_carcinoma.jpg#fil
e
3
Adenocarcinom
ADC utgör nästan 40 % av lungcancerfallen (10), kvinnor drabbas oftare än män och
tumören kan även förekomma hos icke rökare. Sjukdomen uppkommer ofta i anslutning
till ärr i lungans perifera delar men kan också uppstå centralt (13). Den växer ofta
långsamt, men metastaserar relativt tidigt. Symtomen uppträder sent på grund av det
perifera läget (10,13).
Det finns olika typer av ADC. Vanligaste är en perifert växande tumör, som är gråvit,
köttig,
fast
och
med
fibrosbeläggning
på
lungsäcken.
Histologiskt
ses
körteldifferentiering och/eller mucinproduktion i tumörcellerna. Det finns olika
morfologiska typer av ADC som acinär (körtelbildande), papillär, bronchioloalveolär,
solid med mucin formning, blandad typ och olika varianter av dessa typer. IHK
karakteriseras ADC genom uttryck av olika tumörmarkörer, en av dessa är
carcinoembrygent antigen (CEA) (13).
Under senare år har andelen SCC i lunga minskat medan andelen ADC har ökat. Den
ökningen kan antingen bero på en verklig ökning eller på ändrande diagnoskriterier eller
på båda dessa faktorer tillsammans (14).
Histologisk diagnostik
Histologiskt provmaterial för patologisk anatomisk diagnos (PAD) av lungcancer består
av
bronkoskopi
(BB)
och
core
biopsier
(CB),
dvs.
datortomografiledda
mellannålsbiopsier. Huvudsakligen sker diagnostik av lungcancer med en vanlig
färgningsmetod, s.k. Hematoxylin-eosin (HE). Enligt World Health Organization
”WHO”-klassifikationen från 2015 ”vid tydlig morfologisk bild av SCC inte något tillägg
av IHK färgning” rekommenderas. Det vill säga om det går att påvisa keratinisering
och/eller intercellulärbryggor. Den morfologiska diagnosen blir ofta kategorisk, ibland
endast sannolik, men nästan alltid vägledande. Ibland kan det vara svårt vid lågt
differentierade SCC att skilja dem från andra typer av NSCLC (15-17).
För att förbättra lungcancer diagnostiken krävs användning av IHK färgning, som är ett
komplement till HE. En säker diagnos har betydelse för att skilja lungcancer från
metastatisk cancer och för möjligheten till riktad behandling (18)
4
Immunhistokemisk färgning
Med en IHK kan specifika proteinmarkörer (antigener) och deras lokalisation i
vävnadssnitt
detekteras
med
hjälp
av
specifikt
märkta
primär-antikroppar.
Användningsområdet för IHK är stort, såväl forskning som i klinisk diagnostik tillåter
metoden retrospektiva studier på arkiverat material. Metoden är viktig för att identifiera
och klassificera tumörvävnad.
Inom IHK finns olika metoder som t.ex. direkt och indirekt metod. Vid direkt metod är
den primära antikroppen inmärkt med ett fluorescerande färgämne eller ett
enzymkomplex. Med indirekt metod används ett flerstegs teknik. I en två-stegsmetod
detekteras den primära antikroppen med en märkt sekundär antikropp, medan med trestegsmetod krävs ytterligare en märkt antikropp som binds till den sekundära inmärkta
antikroppen (19).
Den metod som användes i den här studien är en tre-stegsmetod med ett kit, OptiView
DAB, som är ett indirekt biotinfritt system för detektering av den primära antikroppen.
Systemet bygger på att den primära antikroppen binder till sitt antigen i vävnaden, och
sedan fäster till en enzymmärkt sekundär antikropp s.k. HQ cocktail. HQ är en
patentskyddad hapten som är kovalent bunden till den sekundera antikroppen. Denna i
sin tur känns igen av en tertiär antikropp, enzymmärkt med horseradish peroxidas (HRP)
multimer. Detta komplex av antikropp-antigenbindning visualiseras sedan med
väteperoxidassubtrat (H2O2) och 3,3′ - diaminobensidintetrahydroklorid (DAB)
kromogen som bildar en brun fällning. Vävnadsprovet kontrastfärgas med hematoxylin
lösning (HTX), som färgar cellkärnor blå genom bindning av ett bindemedelfärgkomplex till nukleinsyror och histonproteiner i hetrokromatinet. Resultat tolkas med
ett ljusmikroskop (20). Se figur 2.
5
Figur 2 Optiview DAB immunhistokemisk detektions kit visar 3-stegsmetods
antikroppar med ett enzymkomplex.
http://productlibrary.ventanamed.com/ventana_portal/OpenOverlayServlet?launchIndex=1&obj
ectId=760-7001010323EN
OptiView DAB som användes i diagnostiken är både känslig och flexibel. Den gör
specifik respektive sensitiv testning, genom att icke specifik bildning inte sker. Den har
förmågan att identifiera låga nivåer av tumörmarkörer (CK5/6, CEA antigen) (20).
Tumörmarkörer vid differentialdiagnostik
Diagnostik med HE färgning är mer eller mindre sannolik men med tillägg av IHK kan
en morfologisk bedömning stödjas (18). Att kunna skilja mellan SCC och ADC har blivit
ett viktigt steg för att välja behandlingsalternativ (21).
Det finns olika markörer i lungcancer diagnostiken. Det rapporterades att CK5, CK5/6,
p40, p63 är positiva tumörmarkörer för SCC. Positiva markörer för ADC är CK7,18 och
19, Tyroidea tanskriptionsfactor-1 (TTF-1), Napsin A och CEA (12,13,15–16).
Färgning med p63 och TTF-1 har använts för att skilja mellan SCC och ADC, detsamma
gäller med färgningen CK5/6 och CK7 (21).
Angående CK antigen bakgrund, den är en stor familj av intracellulära
cytoskelettproteiner i epitelceller. Keratin bildar intermediära filament proteiner. De
utgör en familj på cirka 20 polypeptider med molekylvikt på 40-68 kilodalton (kDa). CK
kan delas in i två typer. Typ I med surt pH och typ II ett basiskt pH. CK markörerna
används för differentialdiagnostik av epitel (22-23).
6
Alveolära celler innehåller lågmolekylära CK-polypeptider typiska för s.k. körtelepitel
(CK7,18 och 19), medan basala celler i bronkepitelet innehåller CK5/6. Alla ADC
uttrycker CK typiska för körtelepitel medan SCC har en mer komplex CK fenotyp (1516).
TTF-1 är en markör för kärnprotein som förekommer i thyreoideas follikelceller samt i
typ II pneumocyter i alveolerna och i Clara celler i bronkioler. Napsin A är en
cytoplasmatisk markör som förekommer i alveolarepitelcell II samt i njurepitelcancer (16,
22). Båda är lungspecifika markörer och är positiva i mer än 85-90% av ADC och används
rutinmässig i ADC diagnostik enligt en studie i södra Sverige (24) och andra olika studier.
Detsamma gäller CK5, CK5/6, p40 och p63 som är positiva tumörmarkörer i mer än 90
% av SCC (25).
Enligt WHO-klassifikationen från 2015 rekommenderas vid otydlig morfologisk
diagnostik av SCC och ADC, en minimal panel av markören (p40, p63, CK5 eller CK5/6)
för SCC och en markör (TTF-1 eller Napsin A) för ADC. I Sverige finns det en tradition
att patologläkaren tar större ansvar och på eget initiativ utreder tumörursprung och
beställer tilläggsanalyser utifrån morfologisk bild (16).
I den här studien utnyttjades CK5/6 och CEA som tumörmarkörer vid lungcancer
diagnostiken.
CK5/6 är intracytoplasmatisk intermediär filament protein som utrycks i skivepitelceller.
CK5/6 är ett basiskt protein med en högmolekylvikt, på 58 respektive 56 kDa. Antigenen
är en specifik markör för SCC i lungan och negativ markör för ADC i lungan (23).
CEA var den första tumörmarkören som beskrivits med relativt hög känslighet för många
avancerade ADC, känslighets mättning är störst i ADC (26). CEA är ett glykoprotein med
varierande kolhydrat komponenter. Molekylvikten är 180 kDa. Det finns i normala
mukosala celler och ökar i mängd i ADC särskild i koloncancer. Det förkommer också
vid ADC i lungan. Det är en typisk markör för körtelepitel, positiv i ADC och
rekommenderas att användas i differentialdiagnostik med SCC (22-23). Vid diagnostik
av NSCLC kan markören användas tillsammans CK5/6 (20).
Enligt en studie har CEA 97 % sensitivitet och specificitet för ADC, vid användning som
enda markör (27). Enligt en annan studie är CK5/6 en specifik markör och har 100 %
specificitet och mer än 80 % sensitivitet för SCC. Detta bekräftas av två tidigare studier
7
(28). Dessutom har enligt socialstyrelsen CK5/6 99 % specificitet och 99 % sensitivitet
för SCC (18).
Avslutningsvis uttrycks CK5/6 i cytoplasman i SCC medan CEA utrycks i både
cellmembran och cytoplasma i ADC.
Syfte
Målet med den här studien är att undersöka graden av körteldifferentiering i lungtumörer
som klassificerades som SCC efter rutin färgning med HE.
Material och metod
Etiska aspekter
Eftersom studien endast grundar sig på färgning av identifierat och arkiverat
vävnadsmaterial kommer ingen ansökan till etisk kommitté att göras.
Lungbiopsier
I den här studien användes formalinfixerad och paraffinbäddad vävnad från 67 fall av
lung SCC diagnostiserad med 50 CB och 17 BB teknik. Patienterna utgjordes av 37 män
och 30 kvinnor, som var mellan 54 till 83 år. Alla fall av SCC i lunga var registrerade i
Enheten för Klinisk Patologis datasystem (Sympathy), Gävle sjukhus, under åren 1996
till 2009. De identifieras via datorsystemets specifika topografiska och morfologiska
koder (T28, M80703). Paraffinklotsarna snittades och färgades därefter för histologisk
och immunhistokemisk färgning.
Histologi
Snittning och färgning
De paraffinbäddade lungbiopsierna snittades (3,5µm) i en mikrotom och placerades
därefter på objektglas (Menzel- Gläser, Tyskland) med avjoniserat vatten som blandades
med ca två droppar äggviteglycerin på. Glasen överfördes till en objektglashållare och
8
flyttades till en automatisk färgmaskin (Tissue-Tek® Prisma, Sakura, Japan) där de
torkades i ca 25 min med värmeugn och därefter färgades med HE program. I
färgningsprocessen blir glasen avparaffinerade med xylen och rehydrerade med
minskande koncentration av alkohol därefter färgade med HE samt dehydrerade med
alkohol och xylen. Färgmaskinen är ihopkopplad med monteringsapparat (Tissue-Tek®
Film, Sakura, Japan). Där monterades glasen automatisk med filmglas och pertex som
monteringsmedel.
Immunhistokemi
Snittning och färgning
De paraffinbäddade lungbiopsierna snittades (3,5µm) och placerades därefter på
superfrost plus (laddade) objektglas med avjoniserat vatten på. På varje glas placerades
ett positivt (även negativt) kontrollsnitt (appendix, pankreas, lever och tonsill) för CK5/6
och CEA antikroppar. För CK5/6 var tonsill som positivt, lever och pankreas var som
negativa medan för CEA var appendix som positivt. Glasen sorterades i objektglashållare
inför IHK färgning.
Från Ventana medical system användes instrument (Benchmark Ultra, USA) som är en
automatiserad objektglasfärgningsmaskin. I färgningsmaskinen användes Ventana
medical system OptiView DAB IHK detektions kit 760-700 som innehåller, inhibitor
lösning (väteperoxidas) för att blockera endogent peroxidas, HQ universal sekundär
antikropp (get anti-mus IgG, get anti-mus IgM och get anti-kanin), HRP multimer
innehåller monoklonal anti-HQ märkt HRP-tertiär musantikropp, DAB, H2O2 och
kopparsulfat. Även HTX som är en modifierad Mayer hematoxylin och blåningsreagens
som är en vattenlösning buffrad med 0,1 M litiumkarbonat från Ventana medical system
användes.
De antikroppar som användes var monoklonala mus CK5/6 (D5/16B4, ref. 790-4554)
från Ventana medical system och monoklonala mus CEA (CEA 31, ref.760-4594)
antikroppar från Cell marque. Båda var färdigspädda på spruta till Benchmark
Ultramaskinen.
9
Avparaffinering och färgningsprocedur utfördes självständigt med maskinen enligt
protokoll för de primära antikropparna, CK5/6 och CEA. Se bifogade protokoll (Bilaga
1-2).
När färgning var klar doppades glasen i handvarmt kranvatten med diskmedel innan de
sköljdes 5 min i rinnande handvarmt kranvatten. Därefter dehydrerades glasen med
Tissue-Tek® Prisma färgmaskin med alkohol och xylen. Sedan monterades glasen
automatisk med pertex via Tissue-Tek® Films apparat.
Diagnostik bedömning
Både HE och IHK färgningarna avlästes i mikroskop av en patolog. IHK färgningen
undersöktes semi-kvantitativt. Färgningsintensitet och reaktivitet graderades som positiv
(1-3) och (0) som negativ. De proverna som markerades med 1+ hade <10% positiva
celler, 2+ hade 10-50% positiva celler och 3+ hade >50% positiva celler. Se figur 3.
Positiv och negativ vävnadkontroll kontrollerades.
10
Figur 3. Immunhistokemisk färgning med olika graderingar av lungcancer A.
Adenocarcinom, CEA överuttryck (1+). B. Adenocarcinom, CEA överuttryck (2+). C.
Adenocarcinom, CEA överuttryck (3+). D. Skivepitelcancer, CK5/6 överuttryck (3+).
11
Resultat
Resultatet av IHK färgning med CK5/6 och CEA i 61 lungtumörer initialt bedömda som
SCC visas i tabell 1. En del prover hade tumörområden med olika stark infärgning och
därför har flera graderingar. Av de 67 proverna var sex fall (tre män och tre kvinnor)
borttagna på grund av otillräckligt material.
Tabell 1. Samtliga resultat analyser av olika graderingar (0, 1+, 2+ och 3+) med CK5/6
och CEA proteinöveruttryck på lungbiopsier med immunhistokemi.
Fall
1
2
3
4
5
6
7
8
9
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
CK5/6
3+
3+
3+
3+
3+
3+
1+
3+
3+
3+
3+
3+
0
3+
3+
3+
0
3+
0
3+
2+
3+
3+
3+
3+
0
3+
3+
CEA
0
0
0
0
3+
3+
1+
3+
2+
0
3+
0
1+
0
0
2+
3+
2+
2+
2+
3+
0
0
0
1+
1+
3+
0
Kön
m
k
k
m
m
k
m
k
m
m
k
m
k
k
k
m
m
m
k
m
m
k
k
m
k
m
m
m
Ålder (år)
83
81
72
71
77
81
78
77
80
79
78
80
74
71
80
78
72
71
77
78
76
70
70
73
71
72
69
75
BB/CB
CB
CB
CB
CB
CB
CB
CB
CB
CB
BB
CB
CB
CB
CB
CB
CB
CB
BB
CB
CB
BB
CB
CB
CB
CB
CB
CB
CB
12
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
60
61
3+
3+
3+
3+
3+
3+
0
0
0
3+
3+
3+
3+
3+
3+
3+
3+
0
2+
0
2+
1+
3+
0
1+
3+
3+
1+
3+
0
3+
0
2+
1+
1+
1+
1+
3+
3+
0
3+
0
1+
2+
1+
2+
1+
2+
1+
1+
0
0
0
0
3+
0
0
3+
3+
1+
1+
0
m
m
m
m
m
k
m
k
m
k
m
k
m
m
m
k
m
k
k
k
m
k
k
k
m
m
k
m
m
m
m
67
63
72
66
72
66
69
66
63
62
66
65
67
67
60
64
61
56
56
63
56
55
72
54
71
69
60
70
60
62
62
BB
CB
CB
CB
CB
CB
CB
CB
CB
BB
CB
BB
CB
CB
CB
CB
BB
CB
CB
CB
CB
CB
BB
BB
BB
BB
BB
BB
BB
BB
BB
BB (bronkoskopi), CB (core biopsi), m (man), k (kvinna), 1+ (<10% positiva celler), 2+ (10-50% positiva
celler), 3+ (>50% positiva celler) och 0 (ingen färgning).
Sammanställning av resultat i tabell 1 visas i tabell 2 och 3. I 21 fall (34,4 %) var CK5/6
positiv och CEA negativ. Dessa representerade ren SCC. I 29 fall (47,5 %) var både
CK5/6 och CEA positiva. I två fall var CEA färgningen starkare än CK5/6 färgningen
och i åtta fall var båda färgningen lika stark. Dessa betraktades som blandad ADC och
SCC (adeno-skivepitelcancer). Se figur 4, som visar CEA markörer färgar ADC celler
13
medan CK5/6 markörer färgar SCC celler i samma fall. I nio fall (14,8 %) var endast CEA
positiva och i Fyra fall av dessa var CEA färgningen i mer än 50 % av tumörceller. Dessa
åter klassificerades som ADC. I två fall (3,3 %) var både CK5/6 och CEA färgningen
negativa, vilket tyder på att dessa representerar odifferentierad cancer.
Tabell 2. Procentuella fördelningar mellan CK5/6 och CEA med positiva och/eller
negativa proteinmarkörer.
Tabell
Totalt
Antal
21
29
9
2
61
%
34,4 %
47,5 %
14,8 %
3,3 %
CK5/6
positiva
positiva
negativa
negativa
CEA
Kommentar
negativa
positiva 2 st CEA > CK5/6 och 8 st CEA=CK5/6
positiva
negativa
Tabell 3. Gradering med förhållande mellan CK5/6 och CEA proteinmarkörer.
CK5/6
CEA
0
1+
2+
3+
Total
------------------------------------------------------------------------------------0
2
2
1
18
23
1+
4
1
1
9
15
2+
1
0
0
9
10
3+
4
1
1
7
13
------------------------------------------------------------------------------------Total
11
4
3
43
61
14
Figur 4. Jämförelse mellan CEA och CK5/6 markörfärgningar av de olika cellerna i
samma fall. Ovan: översikt av mikroskopisk bild över CEA och CK5/6 färgningar. Under:
detaljerad mikroskopisk bild över CEA och CK5/6 markörer av adenocarcinom
respektive skivepitelcancer cellfärgning.
15
Diskussion
Diagnos av maligna lungtumörer sker ofta i ett sent skede och behandlingen med
botemedel är då oftast omöjlig. Eftersom diagnostiken bygger på mikroskopiska
undersökningar av små biopsier som BB eller CB, är därför tumörmaterialet begränsat
och även antalet IHK färgningar som kan utföras (29).
I den här undersökningen utfördes en retrospektiv studie för att utvärdera ett antal fall av
SCC i lunga diagnostiserade med HE färgning. Det fanns en svårighet i diagnostik av
lungtumörer när de saknar de typiska dragen av SCLC och tecken på ADC differentiering
såsom körtel och papillära strukturer saknas. De flesta tumörer var solida och med bara
tillfälliga och tydliga tecken på skivepitel differentiering.
Eftersom biopsimaterialet för IHK var begränsat, valdes CK5/6 som anses vara en
relevant och specifik markör för skivepitel differentiering i lungcancer (30-33). CEA
valdes som sensitiv markör för att demonstrera ADC differentiering (34), eftersom CEA
uttrycks i mer än 95 % av ADC i lunga (35-36). TTF-1ansågs inte vara ett alternativ
eftersom den ibland också färgar tumörceller med SCC differentiering (37-39).
Även om CEA är en mycket känslig markör för ADC i lungan har den nackdelen av en
låg specificitet (34). De flesta gastrointestinala ADC till exempel är typiskt CEA positiva,
men den nackdelen hade mindre betydelse i studien eftersom inga undersökta tumörer var
med all sannolikhet inte av metastatisk natur. Napsin A är en annan mycket känslig och
specifik markör för lung ADC (40-41), men har nackdelen av en minskad expression i
lågt differentierade tumörer (42).
Över 50 % av SCC uttryckte ADC markören. En del tumörer färgades med både CK5/6
och CEA och reklassificerades som adeno-skivepitelcancer. En del tumörer var endast
CEA positiva och klassificerades som ADC. Sammanlagt 62 % av tumörerna visade
körteldifferentiering. Det är oklart om en del celler färgas med båda markörerna, se figur
4.
Den aktuella studien visar att det inte alltid är lätt att beskriva lungtumörer i enkla
histologiska termer. De är ofta fenotypiskt heterogena och tumörcellerna kan visa en
mängd olika färgningsegenskaper med hjälp av IHK. Av denna anledning förefaller det
möjligt att inte bara kvalitativa utan även kvantitativa mätningar i framtiden kommer att
bli ett krav att beskriva biologi en lungtumör.
16
Det här resultatet visar tydligt att histologisk klassificering av små lungbiopsier på HE
färgade snitt är svårt och att ytterligare IHK färgningen kommer att förfina diagnostiken.
En mer specifik klassificering av maligna lungtumörer har stor betydelse genom de
senaste framstegen med specifika terapier.
Tillkännagivande
Med stor respekt vill jag tacka alla som hjälpte mig på alla sätt och vis att klara den här
uppsatsen.
Först och främst vill jag tacka min handledare:
Hirsh Koyi, utan dig mitt ”master”-skepp var i turbulents hav vilse och besviken men
med din hjälp, vänlighet, uppmuntran och tips fick det att segla fram.
Sedan vill jag rikta ett speciellt stort tack till:
Professor Erik Wilander, för ödmjukhet, dyrbara tider, konsultation, stöd och diagnostik.
Patologer, Michiel Dooper och Péter Egerszegi, för genomgång av diagnostiken.
Slutligen vill jag tacka:
Patologi enheten i Gävle sjukhus, för projekt utförandet.
Anna lindblad, för digitala bilder.
Åsa Ahtinen, för genomläsning av projektet.
17
Referenser
1. Cancerfonden, lungcancer [Internet]. Stockholm Gotland: Regionalt cancer
centrum. 2015 [citerad 2015 April 15]. Tillgänglig från:
https://www.cancerfonden.se/om-cancer/lungcancer
2. Dela Cruz CS, Tanoue LT, Matthay RA. Lung cancer: epidemiology, etiology,
and prevention. Clin Chest Med. 2011; 32:605-44.
3. Verdecchia A, Francisci S, Brenner H, Gatta G, Micheli A, Mangone L, et al.
Recent cancer survival in Europe: a period analysis 2000–2002 of the
EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 2007; 8: 784–796.
4. Wilking N, Högberg D, Jönsson B. Karolinska Institutet/i3 Innovus
Benchmarking report of lung cancer care in selected European Countries
[Internet]. Stockholm, Comparator Reports, 2008.p.6-8. [citerad 2015 Okt 28].
Tillgänglig från:
http://www.comparatorreports.se/Lung_cancer_benchmarking_080526.pdf
5.
Socialstyrelsen [Internet]. Nationella riktlinjer for lungcancer vård.
2011.[citerad 2015 Okt 28]. Tillgänglig från:
http://www.socialstyrelsen.se/publikationer2011/2011-3-2
6.
Socialstyrelsen [Internet]. Cancerincidens i Sverige 2012. Nya diagnosticerade
cancerfall år 2012. Sveriges Officiella Statistik, statistik – hälso- och sjukvård.
2014. [citerad 2015 Okt 28]. Tillgänglig från:
http://www.socialstyrelsen.se/publikationer2013/2013-12-17
7. Om lungcancer [Internet]. Healthcare Media.2013 [citerad 2015 April 15].
Tillgänglig från: http://lungcancer.se/om-lungcancer/
8.
Schabath MB, Thompson ZJ, Gray JE. Temporal trends in demographics and
overall survival of non–small-cell lung cancer patients at Moffitt Cancer Centre
from 1986 to 2008. Cancer Control. 2014; 21:51-6.
9.
Jung CY. Biopsy and mutation detection strategies in non-small cell lung
cancer. Tuberc Respir Dis (Seoul). 2013; 75:181-87.
10. Läkemedelsboken, lungcancer [Internet]. Göteborg: Sahlgrenska
universitetssjukhus. 2014 [citerad 2015 April 15]. Tillgänglig från:
http://www.lakemedelsboken.se/j4_onk_lungcancer_2013fm10.html
18
11. Funai K, Yokose T, Ishii G. Ariki K, Yoshida J, Nishimura M, et al.
Clinicopathologic characteristics of peripheral squamous cell carcinoma of the
lung. Am J Surg Pathol. 2003; 27:978–984.
12. Hammar SP, Brambilla E, Pugatch B, Geisinger K, Fernandez EA, Vogt P, et al.
Squamous cell carcinoma. In: Travis WD, Brambilla E, Muller-hermelink HK,
Harris CC red. Pathology and genetics of tumours of the lung, pleura, thymus,
and heart. Lyon: IARC Press. 2004. p. 26-30.
13. Colby TV, Noguchi M, Henschke C, Vazquez MF, Geisinger K, Yokose T, et
al. Adenocarcinoma. I: Travis WD, Brambilla E, Muller-hermelink HK, Harris
CC, red. Pathology and genetics of tumours of lung, pleura, thymus and heart.
Lyon: IARC; 2004.p. 35-44.
14. Vårdprogram för lungcancer och mesoteliom [Internet]. Uppsala Örebro:
Regionalt cancercentrum. 2012 [citerad 2015 April 10]. Tillgängligt från:
http://www.slmf.se/v%C3%A5rdprogram
15. 15. Regionalt vårdprogram för lungcancer [Internet]. Norra sjukvårdsregionen:
Norrbotten, Västerbotten, Västernorrland och Jämtland. 2015. [citerad Dec 6].
Tillgängligt från:
https://www.cancercentrum.se/globalassets/cancerdiagnoser/lunga-ochlungsack/norr/regionalt_vardprogram_lungcancer_150123.pdf
16. Lungtumörer- Svensk Förening för Patologi – Svensk Förening för Klinisk
Cytologi. Framtagen av Thorax-KVAST-grupp. Dok.nr. Thorax-1. 2015.
17. Grilley-Olson JE, Hayes DN, Moore DT, Leslie KO, Wilkerson MD, Qaqish
BF, et al. Validation of interobserver agreement in lung cancer assessment:
hematoxylin-eosin diagnostic reproducibility for non-small cell lung cancer: the
2004 World Health Organization classification and therapeutically relevant
subsets. Arch Pathol Lab Med.2013;137:32–40.
18. Socialstyrelse [Internet]. Misstänkt lungcancer där cytologiskt eller histologiskt
vävnadsprov utförs. 2015. [citerad Dec 6]. Tillgängligt från:
https://www.socialstyrelsen.se/nationellariktlinjerforlungcancervard/sokiriktlinje
rna/misstanktlungcancerdarcytologi
19
19. Taylor CR, Shi SR. Techniques of immunohistochemistry: Principles, pitfalls,
and standardization. I: Dabbs DJ. Diagnostic immunohistochemistry. United
States of America: Elsevier science. 2013. p. 1-12
20. Optiview DAB IHC detection kit [Internet]. Tucson: Ventana medical system; [uppdaterad 2011 jun 23;citerad 2015 Jun 03]. Tillgänglig från:
http://www.ventana.com/product/1574?type=2037
21. Ho C, Tong KM, Ramsden K, Lonescu DN, Laskin J. Histologic classification
of non-small-cell lung cancer over time: reducing the rates of not-otherwisespecified. Curr Oncol 2015;22(3):e164-70.
22. Advanced staining catalogue novocastra TM IHC antibodies, probes & leica
bond reagents. International Ed. Bromma. 2014; p.50, 71, 104,133-134, 178 och
201.
23. Leong A S-Y, Cooper K F, Leong FJ W-M. Manual of diagnostic antibodies for
immunohistology. 2nd ed. London: Greenwich medical media ltd; 2003.p. 18586, 51-52.
24. Brunnström H, Johansson L, Jirström K, Jönsson M, Jönsson P, Planck M.
Immunohistochemistry in differential diagnostics of primary lung cancer – an
investigation within the Southern Swedish Lung Cancer Study. Am J Clin
Pathol.2013; 140:37-46.
25. Zhang K, Deng H, Cagle PT. Utility of Immunohistochemistry in the Diagnosis
of Pleuropulmonary and Mediastinal Cancers: A Review and Update. Archives
of Pathology & Laboratory Medicine. 2014; 138:12: 1611-1628.
26. Lung cancer [Internet]. Prague: European group on tumour markers; - [citerad
2015 Dec 12]. Tillgänglig från: http://www.egtm.eu/professionals/lung_cancer
27. Richard WB, Gary MC, Atul KT, Craig Allred D. Multiple-marker
immunohistochemical phenotypes distinguishing malignant pleural
mesothelioma from pulmonary adenocarcinoma. Human Pathology. 1993;
24:4:347–354.
20
28. Zhao W, Wang H, Peng Y, Tian B, Peng L, Zhang DC. ΔNp63, CK5/6, TTF-1
and napsin A, a reliable panel to subtype non-small cell lung cancer in biopsy
specimens Int J Clin Exp Pathol. 2014; 7:7: 4247–4253.
29. Coghlin CL, Smith LJ, Bakar S, Stewart K N, Devereux GS, Nicolson MC. et al.
Quantitative analysis of tumor in bronchial biopsy specimens. Journal of
Thoracic Oncology. 2010; 5: 448-452.
30. Kaufmann O1, Fietze E, Mengs J, Dietel M.Value of p63 and cytokeratin 5/6 as
immunohistochemical markers for the differential diagnosis of poorly
differentiated and undifferentiated carcinomas Am J Clin Pathol. 2001 Dec;
116(6):823-30.
31. Chu PG, Weiss LM. Expression of cytokeratin 5/6 in epithelial neoplasms: an
immunohistochemical study of 509 cases. Mod Pathol. 2002 Jan; 15(1):6-10.
32. Terry J, Leung S, Laskin J, Leslie KO, Gown AM, Ionescu DN. Optimal
immunohistochemical markers for distinguishing lung adenocarcinomas from
squamous cell carcinomas in small tumor samples. Am J Surg Pathol. 2010 Dec;
34(12):1805-11.
33. Yunfan M, Mengying F, Liang D, Xiaozheng K, Yiqiang L, Yu S. et al.
Expression of p63 and CK5/6 in early-stage lung squamous cell carcinoma is not
only an early diagnostic indicator but also correlates with a good prognosis.
Thoracic Cancer. 2015; 6: 288-295.
34. Sheahan K, O'Brien MJ, Burke B, Dervan PA, O'Keane JC, Gottlieb LS, et al.
Differential reactivities of carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related
monoclonal and polyclonal antibodies in common epithelial malignancies. Am J
Clin Pathol. 1990 Aug; 94(2):157-64.
35. Vårdprogram för lungcancer-Region Skåne [Internet]. Lund: Onkologiskt
centrum. 2011 [citerad 2015 Okt 6]. Tillgängligt från:
https://www.google.se/search?sourceid=navclient&hl=sv&ie=UTF8&rlz=1T4AVNF_svSE626SE626&q=V%c3%a5rdprogram+f%c3%b6r+lungca
ncer+-+Region+Sk%c3%a5ne
36. Peiguo C, Lawernce W. editor. Modern Immunohistochmistry [Internet]. United
Kingdom: Cembridig University Press; 2014 [citerad 2015 Okt 5]. Tillgänglig
från: https://books.google.se/books?id=tbSAgAAQBAJ&pg=PA89&dq=CEA+best+lung+adenocarcinoma&hl=sv&sa=
X&ved=0CDYQ6AEwA2oVChMI65e21
mZ2syAIVi75yCh0RWAlt#v=onepage&q=CEA%20best%20lung%20adenocar
cinoma&f=false
37. Downey P, Cummins R, Moran M, Gulmann C. If it's not CK5/6 positive, TTF1 negative it's not a squamous cell carcinoma of lung. APMIS. 2008 Jun;
116(6):526-9.
38. Johansson L Histopathologic classification of lung cancer: Relevance of
cytokeratin and TTF-1 immunophenotyping. Ann Diagn Pathol. 2004 Oct;
8(5):259-67.
39. Nakamura N, Miyagi E, Murata S, Kawaoi A, Katoh R. Expression of thyroid
transcription factor-1 in normal and neoplastic lung tissues. Mod Pathol. 2002
Oct; 15(10):1058-67.
40. Hirano T, Auer G, Maeda M, Hagiwara Y, Okada S, Ohira T, et al. Human
tissue distribution of TA02, which is homologous with a new type of aspartic
proteinase, napsin A. Jpn J Cancer Res. 2000 Oct;91(10):1015-21.
41. Kim MJ, Shin HC, Shin KC, Ro JY. Best immunohistochemical panel in
distinguishing adenocarcinoma from squamous cell carcinoma of lung: tissue
microarray assay in resected lung cancer specimens. Ann Diagn Pathol. 2013
Feb; 17(1):85-90.
42. Stoll LM, Johnson MW, Gabrielson E, Askin F, Clark DP, Li QK. The utility of
napsin-A in the identification of primary and metastatic lung adenocarcinoma
among cytologically poorly differentiated carcinomas. Cancer Cytopathol. 2010
Dec 25;118(6):441-9.
22
Bilaga 1.
23
Bilaga 2.
24
