Lösningsförslag

Lösningsförslag
Fråga:
6.
Att kunna klona gener och DNA fragment för införsel i E.coli bakterier och andra
värdceller är vardagssysselsättningar för en molekylärbiolog.
a) Du har fått till uppgift att klona genen för ett protein som kallas FABP (Fatty acid
binding protein). För att underlätta kloningen har du konstruerat två olika
restriktionsställen i ändarna på genen (Fet stil). Hur fungerar
restriktionsenzymerna och varför är de så lämpliga att använda för att klona DNA
fragment? Varför är det extra lämpligt att använda två olika restriktionsenzymer?
(4p)
5’AAGCTTATGAAGGCACTCGGCGTAGGTATGGTgACGCGGAAAATGGGTGCTACGGTCAGTCCCGTCGTCGA
ATTGACGGagAAAGACGGAGTGTATACTCTAAAGACGACTAGTACCTTCAAAAACACGGAAATAAAATTCA
AACTTGGCGAAGAATTCGATGAAGACACCGTGGACGGTAGAAAAGTGAAGAGTGTCTGCACTCTGGAAGGT
AATAAACTCATACAGGTGCAGAAAGGTGATAAGAATACTACGATTGAAAGGGAATTCACACCTACAGAGAT
GGAAGCGATCATGAAAGTTGATGACATAGTTTGCACAAGAGTATATAAGATCCAGGAATAAGGATCC-3’
Figur 1 DNA sekvens för genen FABP, kursivt markerat I ändarna är
restriktionställen AAGCTT= HindIII och GGATCC=BamHI
b) Genen klonas in i plasmiden pBR332 (se figur 2). Vad karakteriserar en plasmid
och vad är skillnaden på pBR322 och en expressionsplasmid
(4p)
Figur 2 Restriktionskarta över plasmiden pBR322
c) För att replikera plasmiden transformerar du in den i E.coli celler och sprider
cellerna på agarplattor vilken antibiotikaresistens ska agarplattorna ha?
(2p)
This table shows the 64 codons and the amino acid each codon codes for. The direction is 5' to 3'.
2nd base
U
UUU (Phe/F)Phenylalanine
UUC (Phe/F)Phenylalanine
UUA (Leu/L)Leucine
UUG (Leu/L)Leucine
A
G
UCU (Ser/S)Serine
UCC (Ser/S)Serine
UCA (Ser/S)Serine
UCG (Ser/S)Serine
UAU (Tyr/Y)Tyrosine
UAC (Tyr/Y)Tyrosine
UAA Ochre (Stop)
UAG Amber (Stop)
UGU (Cys/C)Cysteine
UGC (Cys/C)Cysteine
UGA Opal (Stop)
UGG (Trp/W)Tryptophan
CUU (Leu/L)Leucine
CUC (Leu/L)Leucine
C
CUA (Leu/L)Leucine
CUG (Leu/L)Leucine
CCU (Pro/P)Proline
CCC (Pro/P)Proline
CCA (Pro/P)Proline
CCG (Pro/P)Proline
CAU (His/H)Histidine
CAC (His/H)Histidine
CAA (Gln/Q)Glutamine
CAG (Gln/Q)Glutamine
CGU (Arg/R)Arginine
CGC (Arg/R)Arginine
CGA (Arg/R)Arginine
CGG (Arg/R)Arginine
AUU (Ile/I)Isoleucine
AUC (Ile/I)Isoleucine
A
AUA (Ile/I)Isoleucine
AUG (Met/M)Methionine, Start[1]
ACU (Thr/T)Threonine
ACC (Thr/T)Threonine
ACA (Thr/T)Threonine
ACG (Thr/T)Threonine
AAU (Asn/N)Asparagine
AAC (Asn/N)Asparagine
AAA (Lys/K)Lysine
AAG (Lys/K)Lysine
AGU (Ser/S)Serine
AGC (Ser/S)Serine
AGA (Arg/R)Arginine
AGG (Arg/R)Arginine
GUU (Val/V)Valine
GUC (Val/V)Valine
G
GUA (Val/V)Valine
GUG (Val/V)Valine
GCU (Ala/A)Alanine
GCC (Ala/A)Alanine
GCA (Ala/A)Alanine
GCG (Ala/A)Alanine
GAU (Asp/D)Aspartic acid
GAC (Asp/D)Aspartic acid
GAA (Glu/E)Glutamic acid
GAG (Glu/E)Glutamic acid
GGU (Gly/G)Glycine
GGC (Gly/G)Glycine
GGA (Gly/G)Glycine
GGG (Gly/G)Glycine
U
1st
base
C
Svar:
a) Restriktionsenzymer ger upphov till “sticky-ends” som gör det lätt att
sammanfoga DNA bitar om de är klippta med samma restriktionsenzym.
Restriktionsenzym känner oftast igen en plaindromsekvens (t.ex.GGATCC). Vid
kloning används ofta två olika restriktionsenzymer då undviker man ett DNA
fragment blir ”felvänt”(har betydelse om man klonar in det i en
expressionsplasmid)
b) En plasmid är en ”självständig DNA enhet” som är cirkulär, dubbelsträngad och
består av ~2000-10000 baspar. Den har Ori (origin of replication) och kodar för
antibiotikaresistens. En expressionsplasmid har även en promotersite i anslutning
till kloningskassetten för att kunna uttrycka genen som inklonats.
c) Agarplattan ska ha Ampicillinresistens AmpR .
Lösningsförslag
Fråga:
6. PCR tekniken är en mycket användbar metod för att få fram tillräckligt mycket DNA
för t.ex. kloning.
a) Du har fått till uppgift att klona genen för ett protein som kallas FABP (Fatty acid
binding protein) (Figur 1). Med hjälp av PCR tänker du ”fiska” genen från ett
cDNA bibliotek. Beskriv tekniken bakom PCR, vilka komponenter ingår. (gör
gärna en schematisk skiss).
(4p)
b) Designa primers för att hitta genen.
(2p)
c) För att analysera resultatet vill du bestämma DNA sekvensen på genen. Hur
fungerar DNA sekvensning. Vilka komponenter ingår (gör gärna en schematisk
skiss)
(4p)
5’ATGAAGGCACTCGGCGTAGGTATGGTgACGCGGAAAATGGGTGCTACGGTCAGTCCCGTCGTCGAATTGAC
GGagAAAGACGGAGTGTATACTCTAAAGACGACTAGTACCTTCAAAAACACGGAAATAAAATTCAAACTTG
GCGAAGAATTCGATGAAGACACCGTGGACGGTAGAAAAGTGAAGAGTGTCTGCACTCTGGAAGGTAATAAA
CTCATACAGGTGCAGAAAGGTGATAAGAATACTACGATTGAAAGGGAATTCACACCTACAGAGATGGAAGC
GATCATGAAAGTTGATGACATAGTTTGCACAAGAGTATATAAGATCCAGGAATAA-3’
Figur 1 DNA sekvens för genen FABP.
This table shows the 64 codons and the amino acid each codon codes for. The direction is 5' to 3'.
2nd base
U
UUU (Phe/F)Phenylalanine
UUC (Phe/F)Phenylalanine
UUA (Leu/L)Leucine
UUG (Leu/L)Leucine
A
G
UCU (Ser/S)Serine
UCC (Ser/S)Serine
UCA (Ser/S)Serine
UCG (Ser/S)Serine
UAU (Tyr/Y)Tyrosine
UAC (Tyr/Y)Tyrosine
UAA Ochre (Stop)
UAG Amber (Stop)
UGU (Cys/C)Cysteine
UGC (Cys/C)Cysteine
UGA Opal (Stop)
UGG (Trp/W)Tryptophan
CUU (Leu/L)Leucine
CUC (Leu/L)Leucine
C
CUA (Leu/L)Leucine
CUG (Leu/L)Leucine
CCU (Pro/P)Proline
CCC (Pro/P)Proline
CCA (Pro/P)Proline
CCG (Pro/P)Proline
CAU (His/H)Histidine
CAC (His/H)Histidine
CAA (Gln/Q)Glutamine
CAG (Gln/Q)Glutamine
CGU (Arg/R)Arginine
CGC (Arg/R)Arginine
CGA (Arg/R)Arginine
CGG (Arg/R)Arginine
AUU (Ile/I)Isoleucine
AUC (Ile/I)Isoleucine
A
AUA (Ile/I)Isoleucine
AUG (Met/M)Methionine, Start[1]
ACU (Thr/T)Threonine
ACC (Thr/T)Threonine
ACA (Thr/T)Threonine
ACG (Thr/T)Threonine
AAU (Asn/N)Asparagine
AAC (Asn/N)Asparagine
AAA (Lys/K)Lysine
AAG (Lys/K)Lysine
AGU (Ser/S)Serine
AGC (Ser/S)Serine
AGA (Arg/R)Arginine
AGG (Arg/R)Arginine
GUU (Val/V)Valine
GUC (Val/V)Valine
G
GUA (Val/V)Valine
GUG (Val/V)Valine
GCU (Ala/A)Alanine
GCC (Ala/A)Alanine
GCA (Ala/A)Alanine
GCG (Ala/A)Alanine
GAU (Asp/D)Aspartic acid
GAC (Asp/D)Aspartic acid
GAA (Glu/E)Glutamic acid
GAG (Glu/E)Glutamic acid
GGU (Gly/G)Glycine
GGC (Gly/G)Glycine
GGA (Gly/G)Glycine
GGG (Gly/G)Glycine
U
1st
base
C
Svar:
a) De komponeter som ingår i PCR är värmetåligt polymeras, fria deoxynukleotider
(dNTP), buffert, Mg2+ samt två primers (forward och revers). Tre olika
temperatursteg, denaturering 95 grader, annealing ~60 grader och och
polymerisering 72 grader. Denna cykel upprepas 20-25 ggr. Se även figur i boken.
b)
Forward primer:
5´-ATGAAGGCACTCGGCGTAGG-3´
Reverse primer
5´- TTATTCCTGGATCTTATATAC-3´
c) För DNA sekvensning behövs primers som binder till det område man vill sekvensa,
DNA polymeras, deoxy- OCH dideoxynuklotider buffert samt enkelsträngat DNA.
Separationen av fragmenten sker på en polyakrylamidgel. Se även figur i boken.
Extrafrågan 5 p
a) För att ”hitta” en gen används ofta två olika typer av DNA
bibliotek. Vad kallas dessa två typer av DNA bibliotek och vad
skiljer dem åt?
(4p)
b) För att hitta analysera renheten och koncentrationen på DNA
fragment används ofta agarosgel. Hur fungerar en agarosgel och hur
sker detektionen?
(1p)
Svar:
a) cDNA bibliotek och genomsiska bibliotek. Ett genomiskt bibliotek inehåller hela
genomet medan ett cDNA bibliotek innehåller de gener som uttrycks för en
speciell vävnad t.ex i ett cDNA bibliotek från bukspottskörteln finns de gener som
just uttrycks i bukspottskörteln.
b) En agarosgel ger ett ”grovmaskigt” nät som passar bra att separera stora
makromolekyler såsom DNA. Separationen sker främst med avseende på storlek.
Detektioen sker mha att man tillsätter etidiumbromid (eller SyBrsafe) och belyser
agarosgelen med UV-ljus. DNA:t syns då som orangefärgade band.