Examensarbete i biologi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Ett försök att lösa den hundraåriga sarkoidos-gåtan
Stefan Termén
Sarkoidos är en sjukdom som framför allt angriper lungorna. Sjukdomen har varit känd i över
100 år men fortfarande vet man inte vad som orsakar den. Det finns flera likheter med
tuberkulos, som ju orsakas av en bakterie. Man misstänker att även sarkoidos kan orsakas av
bakterier, och flera undersökningar har gjorts utan att man har kunnat ge något svar på frågan.
Man har emellertid alltid inriktat sig på en eller en mindre grupp bakterier. Det skulle vara
önskvärt att kunna identifiera alla bakterier i ett prov på en gång, och tanken med det här
arbetet var att utveckla en metod för detta. Metoden skulle kunna användas i många andra
sammanhang än just sarkoidos.
Vid identifiering av bakteriearter är det smidigt att titta på DNA. Den DNA-bit som sattes i
bruk här var den gen som kodar för 16S rRNA. 16S rRNA är en beståndsdel i ribosomerna, de
strukturer som bygger ihop proteiner av aminosyror med den genetiska koden som ritning.
Detta är förstås en mycket grundläggande funktion och ribosomer och 16S rRNA finns
således i alla bakterier, vilket gör det lämpligt att använda i det här fallet. 16S rRNA har också
använts för att avgöra släktskap mellan bakteriearter, så databaser finns att tillgå där man kan
identifiera en art bara man har sekvensen av dess 16S-rRNA-gen.
Genom att kopiera upp denna DNA-bit från bakterierna i prov från sarkoidospatienters lungor
kan man klona, dvs. sätta in det i en bakteriestam som sedan producerar så många kopior av
DNA-biten som man vill. Då får man så mycket som man behöver för att sekvensera den, och
sekvensen talar om vilken art man har att göra med.
Ett problem är att eftersom man måste kunna kopiera upp DNA från arter man inte känner, så
måste man vara frikostig i urvalet av sekvenser. Detta gör att ovidkommande bitar av DNA
också kommer att kopieras upp, och ge irrelevanta resultat. Problemet visade sig emellertid
vara överkomligt, och jag lyckades utveckla en fungerande metod. Sekvensering visade att det
i de flesta fall var den avsedda 16S-rRNA-genen jag hade kopierat upp.
Nu skulle man kunna sätta upp ett försök där man undersökte vilka bakterier som
sarkoidospatienter har i lungorna och genom att jämföra med friska individer skulle man
kunna få en vink om vilka bakterier som kan tänkas orsaka sjukdomen. Sarkoidosgåtan har
kommit ett steg närmare sin lösning.
Swedish official title: Utvecklandet av en metod för att söka efter mikroorganismer i
bronkoalveolär lavagevätska - ett försök att lösa gåtan bakom sarkoidosens etiologi
Swedish credits: 10p
E-mail address of first author: [email protected]
Supervisor: Gudmundur H. Gudmundsson and Johan Grunewald, Microbiology and Tumor
Biology Center, Karolinska Institute, Stockholm, and Division of Respiratory Medicine,
Department of Medicine, Karolinska Hospital, Stockholm
Submission date/time: 1999-11-23
Examensarbete i biologi, naturvetenskapliga fakulteten, Lunds universitet
Development of a Method for Searching for Microorganisms in
Bronchoalveolar Lavage Fluid - An Attempt to Solve the Enigma
behind the Aetiology of Sarcoidosis
Stefan Termén
Biology, Cellular and Molecular Immunology
Spring 1999
Abstract in English
Sarcoidosis is a granulomatous disease, primarily affecting the lungs, for which the cause is
unknown. Granuloma can form as a result of macrophages having trouble battling bacteria
that persist within them, and typical among these bacteria are the mycobacteria. The clinical
characteristics of sarcoidosis are similar to tuberculosis, which is caused by Mycobacterium
tuberculosis. The explanation that sarcoidosis is caused by mycobacteria has therefore seemed
very likely. Several studies have been made, however, without having proved that this is the
case. Still, it is likely that sarcoidosis is caused by a bacterium, possibly of another genus.
This study aims to develop a method for screening all bacteria present in bronchoalveolar
lavage fluid, for the purpose of solving the 100-year-old enigma concerning the aetiology of
sarcoidosis.
This was done by amplifying a 1500 bp fragment of the pre-rRNA gene, more precisely the
portion that codes for 16S rRNA. DNA extractions of bronchoalveolar lavage fluid from
sarcoidosis patients were used, and the fragment was amplified using primers that can detect
many species of bacteria. The annealing temperature was low (40°C) so as to allow some
mispairing, for the purpose of detecting all species of bacteria present. The amplified DNA
was cloned using two different cloning methods, blunt-ended cloning and TA-cloning.
Transformed colonies with an insert of the desired length were selected for sequencing.
At the low annealing temperature, undesired fragments were amplified beside the 1500 bp
fragment, probably due to primers annealing to sequences of the human DNA present in the
samples. There was also a problem with that only limited amounts of DNA could be
amplified, in that the amplified DNA fragments tolerated no reamplification or other
modification. The cloning method that gave the best results was the TA-cloning kit, and this
kit also requires the least manipulation of the DNA.
Sequencing confirmed that the selected fragments were fragments of DNA that codes for 16S
rRNA. This method can now be used to screen all bacteria present in bronchoalveolar lavage
fluid, which can give important clues toward solving the aetiology of sarcoidosis. The method
can also be used for other diseases that are suspected to be caused by bacteria.
