Projektplan för examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap, 30 högskolepoäng.
Avancerad nivå 1.
Fristående kurs, Biomedicinska Analytikerprogrammet, Institutionen för Biomedicin,
Sahlgrenska Akademin vid Göteborgs Universitet.
Namn: BSc, Inger Fagerberg, Institutionen för Klinisk Kemi och Transfusionsmedicin,
Sahlgrenska Akademin, Göteborg.
Handledare 1: MD PhD, Fariba Baghaei, Institutionen för Medicin, Sahlgrenska Akademin,
Göteborg.
Handledare 2: MD PhD Professor, Tomas L. Lindahl, Institutionen för Experimentell och
Klinisk Medicin, Universitet i Linköping.
___________________________________________________________________________
UTVÄRDERING AV DIAGNOSTIK VID BLÖDNINGSUTREDNING
SPECIFIK MÅLSÄTTNING
Huvudsyftet är att validera en ny impedans aggregometer (Multiplate®) som jämförs med
aggregation enligt Born, som är ”golden-standard-metod”. Jämförelsen kommer att utföras på
blodprover från patienter med milda blödningsrubbningar.
I samband med detta utvärderas även blödningstid enligt Ivy samt en enkät som skall
möjliggöra en standardisering av blödningsanamnesen och där resultatet uttrycks som poäng
(blödningsscore). Meningen är att det skall kunna leda till förbättrad och kanske förenklad
diagnostik av milda blödningsrubbningar.
BAKGRUND
Patienter med blödningsrubbningar kan ha olika defekter i hemostasen. Blödningssjukdomar
som orsakas av rubbningar i den första fasen av hemostasen är,
trombocytfunktionsrubbningar, von Willebrands sjukdom (vWsj) eller kollagendefekter.
Dessa patienter har en ökad benägenhet att få näsblödningar eller rikliga
menstruationsblödningar och de kan också blöda oväntat mycket vid ingrepp. Det är viktigt
med korrekt diagnos inte bara för att kunna förebygga blödningar i samband med ingrepp utan
också för att erbjuda korrekt behandling vid blödningar som t.ex. rikliga
menstruationsblödningar.
Diagnostiken baseras på blödningsanamnes och laboratorieanalyser.
Blödningsanamnesen är en avgörande del av diagnostiken men är i behov av standardisering.
Det har därför tagits internationella initiativ för att ta fram strukturerade enkäter där
blödningsymtomen poängsätts och resultatet uttrycks som ett s.k. "blödningsscore" .
1
Sedan 2007 har koagulationsmottagningarna i Göteborg och Malmö använt sig av en
modifierad version av en blödningsanamnes enkät som tagits fram av en internationell
arbetsgrupp [1].
De laboratorieundersökningar som används för undersökning av trombocytfunktionen
kritiseras för att inte avspegla den kliniska bilden trots att de är tidskrävande och utförs på
speciallaboratorier. Standardmetoden är trombocytaggregation enligt Born men trots att den
använts i 40 år har det inte gjorts någon standardisering, varför utförandet varierar mellan
internationella speciallaboratorier.
Diagnostiken av milda trombocytdefekter är således i behov av förbättring, förenkling och
standardisering. Förbättringen av diagnostiken är dessutom viktigt för att undvika
överdiagnostisering, som i många fall kan leda till stigmatisering av patienterna i onödan.
Nyligen har det tillkommit ett instrument för test av trombocytfunktionen (Multiplate®
Dynabyte Medical, München, Tyskland) som visar trombocyternas aggregationsförmåga i
helblod efter tillsats av olika agonister.
Traditionellt har också blödningstidsbestämning utförts som led i utredningen av patienter
med blödningssymtom men värdet av denna metod har ifrågasatts under senare tid [2].
Studiens syfte är att utvärdera och jämföra Multiplate och blödningstid med övriga
laboratoriemetoder och relatera resultatet till blödningsscore.
ARBETSPLAN
Studiepopulation:
Alla patienter som remitteras, under perioden september 2008 t.o.m december 2009, till
Koagulationscentra vid SU/Sahlgrenska i Göteborg, UMAS i Malmö respektive till Avd. för
klinisk kemi, Universitetssjukhuset i Linköping, för utredning av ökad blödningsbenägenhet,
kommer att ingå i en prospektiv studie där patienterna inkluderas konsekutivt. Patienterna
träffar läkare för upptagning av standardiserad blödningsanamnes.
Inklusionskriterer:
Patienter ≥15 år som remitteras till ovanstående mottagningar för blödningsutredning.
Exklusionskriterier:
Trombocytantalet <80 x 10 9 /L
Hb < 100 g/L
Känd lever eller njursjukdom
Intag av läkemedel som påverkar trombocytfunktionen (ASA, Clopidogrel, NSAID,
antidepressiva läkemedel) under senaste 7 dagarna.
Intag av antikoagulantia
Graviditet
METODER
Blodprovstagning:
Två vacuumrör av vardera innehållande hirudin och/eller natriumcitrat 3,2 % (2,7 mL)
används för aggregometri med Multiplate®- instrumentet och 7-10 rör (2,7 mL) för analys av
2
trombocytaggregation enligt Born. Kanylstorlek 19-21 gauge ger en minimal påverkan på
trombocyterna och skall av den anledningen användas [3]. Den exakta provtagningstiden
anges. Övrig provtagning sker samtidigt enligt respektive centras rutiner för
blödningsutredning.
Trombocytaggregation enligt Born
Aggregation enligt Born används för att bedöma trombocyternas aggregationsförmåga efter
aktivering via olika receptorer. Analysen utförs på trombocytrik plasma. Efter tillsats av en
agonist som stimulerar en trombocytreceptor aggregerar trombocyterna under
magnetomrörning och strikt temperaturkontroll. När trombocyterna aggregerar ökar
ljusgenomsläppligheten i provet vilket registreras med en fotocell. Aggregometri enligt Born
kräver stor blodvolym och centrifugering vilket är tidskrävande och omständligt [4].
Genomförande av Born aggregometri:
Aggregations- analys enligt Born är ”golden-standard-metod” och skall användas för att
validera Muliplate®-instrumentet. Denna jämförelse görs enbart på Sahlgrenska
Universitetssjukhuset, Göteborg. Jämförelser görs med agonister som används rutinmässigt.
Följande reagens och slutkoncentrationer används i trombocytrikplasma (PRP):
ADP 0,2/0,5/1,0/1,5/2/4 μmol/L
Adrenalin 5 μmol/L
Kollagen 0,5/1,0 μg/mL
Arakidonsyra 500 μmol/L
Ristocetin 0,3/0,6/1/2 mg/mL
Trombocytaggregation med impedansmetodik; Multiplate
Multiplate® är avsett för att bedöma trombocyternas aggregationsförmåga i helblod efter
tillsats av olika agonister. Liksom vid trombocytaggregation enligt Born ses sämre
aggregation vid olika receptordefekter och då trombocyterna påverkas av olika läkemedel.
Det är två väsentliga skillnader mellan den klassiska tekniken enligt Born och Multiplate:
1: Born aggregometri utförs på trombocytrik plasma och Multiplate analysen görs på helblod.
Det innebär att resultatet vid Mulitplate analysen också kan påverkas av erytrocyterna (röda
blodkroppar).
2: Vid Born aggregometri registreras trombocytaggregationen direkt som ökad
ljusgenomsläpplighet medan Multiplate instrumententet registrerar den impedansförändring
som uppstår när trombocyterna efter tillsats av agonisten fastnar på elektroder i en
engångskyvett [5]. Närvaron av erytrocyter och skillanden i registreringsteknik gör att
metoderna inte är direkt jämförbara.
Syftet med studien är att avgöra om Multiplate trots skillnaderna i analysteknik kan ge samma
och ev. utökad information om trombocytfunktionen och därmed förbättrad diagnostik.
Genomförande av impedansaggregometri; Multiplate:
Trombocytaggregometri med Multiplate® bör utföras mellan 0,5–1,5 timmar (exakt analystid
anges) efter provtagning. Mätning görs med tillsats av olika agonister för att se effekt på
3
trombocyternas aggregationsförmåga. Följande reagens och slutkoncentrationer (helblod)
används:
ADP 6,4 μM,
Kollagen 3,2 μg/mL
TRAP 32 μM
Arakidonsyra (ASPItest) 0,5 mmol/L
Ristocetin 0,77 mg/mL.
Normalmaterial:
Till analyserna som utförs på Multiplate®–instrumentet krävs normalmaterial för att skilja
mellan sjuk och frisk. Totalt 50 friska frivilliga normalpersoner provtas med provtagningsrör
innehållande 3,2 %-ig natriumcitrathalt samt hirudin. Samtliga sjukhuslaboratoriers resultat
läggs samman till ett gemensamt normalmaterial. Enstaka individers blodprover ska
analyseras vid upprepade tillfällen för att se om det finns en intra-individuell variation.
Beräkning av dubbelprovs varians ska göras mellan två mätpositioner för att erhålla ett
spridningsmått.
Vid varje provtagningstillfälle på normalpersoner skall de inte ha tagit läkemedel som
påverkar trombocytfunktionen såsom medel mot depression, ASA (acetylsalicylsyra) och
anti-inflammatoriska preparat (s.k.NSAID) de senaste 7-10 dagarna.
Blödningsanamnes enkät används för beräkning av blödningsscore hos normalpersoner
genom läkarintervjuer.
Blödningstid Ivy
Blödningstid enligt Ivy utförs med ett snitt på volarsidan av underarmen. Idag använder man
en industriellt tillverkat apparat (Surgicutt) som ger snittdjup på 1 mm och snittlängd på 5
mm. När trombocytplugg har bildats registreras tiden med stoppur.
Blödningstidsbestämning utförs inte på Koagulationsmottagningen i Malmö.
Flödescytometri
Med flödescytometri mäts hur trombocyterna svarar med fibrinogenbindning och uttryck av
alfa-granuleproteinet P-selektin på stimulering av ADP-receptorerna (med ADP),
kollagenreceptorn GPVI (med kollagenrelaterad peptid), trombinreceptorerna PAR1 (peptiden
SFLLRN) och PAR4 (peptiden AYPGKF). Frisättning av dense granule fångas med
fibrinogenbindning med och utan apyras (som bryter ned frisatt ADP och tar bort det
sekundära svaret på ADP).
Adhesivitetstest
Trombocytadhesivitetstest utförs endast på Koagulationsmottagningen i Malmö enl. en
modifiering av den metod som ursprungligen beskrevs av Hellem. Trombocyternas retention i
en kolonn med glaspärlor bestäms. För detta används en pump som genererar ett konstant
blodflöde, med vilket trombocyterna i en spruta pressas genom glaspärlekolonnen. Antalet
trombocyter räknas manuellt före och efter filtrering. Skillnaden (i %) är ett mått på
adhesiviteten och den är normalt 16-34%.
4
Trombingenerering
Trombingenerering utföres enligt Varadi et al [6] på såväl PPP som PRP. Två Citratrör tages
och behandlas enligt följande: Centrifugeras 200 g 10 min i rumstemperatur. En mL plasma
avsuges från varje rör och trombocyter räknas (PRP). Rören med resterande innehåll
centrifugeras 1800 g i 20 min, plasman avdrages och centrifugeras ånyo (PPP). PRP spädes
med PPP så att slutpartikelkoncentration av trombocyter blir ca 300 x 109/L. Fryses vid -80C
(2 rör PPP och 2 rör PRP för varje patient) för senare transport till Wallenberglab., Malmö.
Faktoranalyser och övriga laboratorieanalyser:
PK(INR), APTT, FVIII:C, FIX (män), VWF:Ag, VWF:aktivitet (VWF:RCo), fibrinogen.
ABO-blodgrupp, Hb, TPK, CRP.
Om möjlighet så anges dag i menscykel vid provtagningen.
DNA-analys
DNA sparas för senare analys av ”single” nukleotid polymorfier (SNP) som kan tänkas vara
relaterade till trombocyternas funktion. Lämpliga SNP för analys letas i offentliga databaser
över det humana genomets variation samt SNPs redan kända för att påverka trombocyternas
funktion.
Statistisk beräkning och analys på patientdata skall utföras med SPSS (SPSS, Chicago, USA).
BETYDELSE
Det är viktigt att diagnostisera även milda rubbningar inte bara för att kunna förebygga
blödningar i samband med ingrepp utan också för att erbjuda behandling för t.ex. rikliga
menstruationsblödningar. En förbättring och standardisering av diagnostiken är av största vikt
för denna patientgrupp. Det är lika viktigt att förbättra diagnostiken för att undvika en
överdiagnostisering hos friska personer.
Detta kan leda till en ekonomisk vinst för samhället men även undvikande av onödigt lidande
för dessa patienter som t.ex. blödningskomplikationer vid tandläkaringrepp och operationer.
5
REFERENSER
[1]
Tosetto A, Rodeghiero F, Castaman G, Goodeve A, Federici B, Batlle J, et al. A
quantitative analysis of bleeding symptoms in type 1 von Willebrand disease:
results from a multicenter European study (MCMDM – VWD). J Thromb
Haemost. 2006;4:766-73.
[2]
Mielke CH, Kaneshiro MM, Maher IA, Weiner, Rapaport SI. The standardized
normal Ivy bleeding time and its prolongation by Aspirin. Blood 1969;34:204215.
[3]
Platelet Function Testing by Aggregometry; Proposed Guideline. Clinical and
Laboratory Standards Institute. H58-p Vol.27 No.19.
[4]
Born GVR. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its
reversal. Nature 962;194:927-9.
[5]
Tóth O, Calatzis A, Penz S, Losonczy H, Siess W.Multiple electrode
aggregometry: a new device to measure platelet aggregation in whole blood.
Thromb Haemost. 2006;96:781-8.
[6]
Varadi K, Negrier C, Berntorp E, Astermark J, Bordet JC, Morfini M, et al.
Monitoring the bioavailability of FEIBA with a thrombin generation assay. J
Thromb Haemost. 2003;1:2374-80.
6
