Anna Eidefors
Molekylärbiolog, Klinisk Mikrobiologi
Karolinska Universitetssjukhuset, Huddinge
Har patienten
en infektion?
Hur går
behandlingen?
Vilken
behandling
skall väljas?
Varför går inte
behandlingen
bra?
Serologi
Kvantitativ PCR
Genotypning
Resistens
HIV-1
HIV-2
HTLV I/II
HIV-1
HIV-2*
HIV-1
HIV-1
HBV
HCV
HBV
HCV*
HAV
HBV
HCV
HDV
HEV*
2 NMMD 2015
Har patienten haft en infektion?
Kronisk/akut
HAV*infektion?
Är patienten
vaccinerad?
HBV
HCV
HDV*
HEV*
* Utförs ej på Karolinska Universitetssjukhuset
Fråga:
Har det nyfödda barnet en HIV infektion?
Serologi
Visar mammans
Antikroppar.
Vid ca 20 månader
skall barnet vara
negativt.
Kvantitativ PCR
HIV-1 RNA
Påvisar virus i
plasma.
Virus skall
påvisas vid minst två
olika tillfällen.
0-3 dagar
6 veckor
≥4 månader
3 NMMD 2015
HIV-1 DNA
Påvisar inkorporerat
virus i gDNA
Skall användas vid
tveksamhet om hur
HIV-1 RNA skall
tolkas.
Fråga:
Hur fungerar patientens behandling?
10
Oftast kommersiella metoder.
Hög automatiseringsgrad.
log kopior/mL
8
6
4
2
0
Stort linjärt område.
Ex: 20-1x107 kopior/mL
4 NMMD 2015
För HBV och HCV kan kvantitativ
PCR användas för att ställa diagnos.
För HCV även för konfirmation av
serologisvar.
1. Provtagning
2. Transport
3. Provet
anländer
4. Inmärkning
5. Centrifugering
6. Avkorkning
Cobas p312
7. Analys
Cobas 6800
8. Avhällning
9. Utsvarning
1-7.
1-9.
4-9.
Bör vara mindre än 24 timmar.
Två analystillfällen per dag.
Median 1,8 dygn. 90% inom 4,0 dygn (HIV-1).
Median 1,0 dygn. 90% inom 3,4 dygn (HIV-1).
Ungefär 20 000 prov per år, dvs ca 80-100 prov per dag.
5 NMMD 2015
6 NMMD 2015
Vid optimal behandling tar det lång tid innan resistens uppstår.
Vid misstanke om behandlingssvikt är det viktigt att ta prov under pågående
behandling. Resistensmutationer kan snabbt försvinna ur den dominerande
viruspopulationen om behandlingen sätts ut eller ändras.
För låga virusnivåer gör att provet inte blir representativt.
Proteas- och RT-inhibitorer:
Integrasinhibitorer:
CCR5-inhibitor:
7 NMMD 2015
19 läkemedel
3 läkemedel
1 läkemedel
ca 1300 bp sekvenseras
ca 900 bp sekvenseras
ca 180 bp sekvenseras
2b. Nestad PCR
Viroseq
1. Extraktion
2. RT-PCR
Viroseq
3. Rening
Spinnkolonner
4. Agarosgel
5. Cykelsekvensering
Viroseq
6. Rening
Etanolfällning
7. Detektion
ABI 3130XL
8. Editering
Viroseq
9. Genotypning
Mega4
10. Resistensbedömning
Stanford HIV db
11. Utsvarning
NucliSENS easyMag
8 NMMD 2015
• Om även kvantifiering är beställd inväntas detta resultat.
• Om provet har <100 kopior/mL utförs inte resistensbedömning.
• PR/RT-resistens utförs en gång per vecka.
• Nestning utförs en gång per vecka.
• Integrasresistens utförs varannan vecka.
• CCR5 tropism utförs vid behov (följer med hepatiterna vilka körs
två gånger per vecka).
Analys
PR- och RT-inhibitorer:
Integrasinhibitorer:
CCR5-inhibitor:
9 NMMD 2015
Antal per år
500
45
50 (15 i år)
HBV Genotyp/Resistens:
•
Analyseras som paket.
•
Ovanligt med resistens.
•
ca 400 prov/år.
HCV Genotyp:
•
Viktigt att veta genotyp inför behandling.
•
ca 1000 prov/år.
HCV Resistens:
•
NS3 Resistens utförs i Uppsala
10 NMMD 2015
Agensspecifikt – Dag 1
1. Extraktion
2. RT-PCR/PCR
NucliSENS easyMag
3. Inre PCR
M13-handtag
Generellt – Dag 2
4. Rening
Illustra ExoStar
5. Cykelsekvensering
M13-primrar
6. Rening
BigDyeXterminator
7. Detektion
ABI 3130XL
Analys – Dag 3
9. Editering
SeqScape
11 NMMD 2015
10. Resistensbedömning/Genotypning
Geno2Pheno/Mega4
11. Utsvarning
Alla kan och ska inte göra allt!
Huvudlabbet bör ha kontroll på helheten.
Om inte vi utför analysen skickar vi provet vidare, tar emot svaret och
lägger in det i vårt system.
Minskar risken för att felbeställda analyser utförs.
12 NMMD 2015
13 NMMD 2015
