Undersökning av en möjlig FNR-beroende promotor

Undersökning av en möjlig FNR-beroende promotor
uppströms genen för kloritdismutas i Ideonella
dechloratans
Examination of a possible FNR-dependent promoter upstream the gene for
chlorite dismutase in Ideonella dechloratans
Shady Blomqvist
Fakulteten för hälsa, natur- och teknikvetenskap
Civilingenjörsprogrammet i kemiteknik
Examensarbete Civilingenjör 30 HP
Handledare: Maria Rova
Examinator: Lars Järnström
Datum
Löpnummer
Sammanfattning
Ideonella dechloratans är en fakultativ anaerob som innehåller generna för kloratreduktas och
kloritdismutas nödvändiga för respiration av klorat. Man har tidigare visat att kloritdismutas
induceras under anaeroba förhållanden och anses regleras på transkriptionsnivå. Inom sekvensen
uppströms genen har ett möjligt FNR-säte lokaliserats, en konsensus-sekvens dit
transkriptionsfaktorn FNR kan binda in. FNR är ett regleringsprotein som tillåter anpassning av
fakultativa anaerober som Ideonella dechloratans till syrefattiga miljöer. I det här arbete undersöks
sekvensen uppströms genen för kloritdismutas efter en möjlig FNR-beroende promotor. Genom
tillverkning av två fragment 189 bp respektive 172 bp långt av sekvensen, innehållande en möjlig
promotor med och utan -10 elementet och via en plasmidvektor med en -galaktosidas reportergen
transformera in dessa i Escherichia coli och mäta uttrycken med -galatosidas mätning under
aeroba och anaeroba förhållanden. Det 189 bp fragmentet gav upphov till basaluttryck och anaerob
induktion på 3.3 x basaluttryck medans 172 bp fragmentet inte gav upphov till något uttryck
överhuvudtaget. fragmenten kotransformerades också in i en FNR-negativ stam tillsammans med en
möjlig FNR-gen ifrån Ideonella dechloratans som visade sig ha förmåga att inducera uttrycket av
kloritdismutas under anaeroba förhållanden med 2.8 x basaluttrycket. Detta visar att -10 elementet
är viktigt för både aerobt och anaerobt utrryck vilket föreslår att det finns en promotor inom 189 bp
fragmentet som både står för ett basaluttryck och ett anaerobt uttryck. Resultaten visar också att att
den regleras utav FNR och att FNR-genen ifrån Ideonella dechloratans kan utföra den anaeroba
induktionen.
2
Innehållsförteckning
Sammanfattning....................................................................................................................................2
Övergripande Sammanfattning.............................................................................................................7
Bakgrund..........................................................................................................................................7
Transkription och promotor regioner i prokaryoter.........................................................................8
Tidigare resultat och avsikten med arbetet......................................................................................9
Metodiken kortfattat......................................................................................................................10
Sammanfattning av resultaten........................................................................................................11
De viktigaste slutsatserna...............................................................................................................12
Executive Summary............................................................................................................................13
Background....................................................................................................................................13
Transcripiton and promoter regions in prokaryotes.......................................................................14
Earlier results and the purpose of this thesis..................................................................................15
Methods.........................................................................................................................................17
A summary of the results...............................................................................................................18
Conclusion.....................................................................................................................................19
Förkortningar......................................................................................................................................20
Introduktion........................................................................................................................................21
Problemformulering.......................................................................................................................21
Syfte...............................................................................................................................................21
Klorat och perklorat: Egenskaper och miljöproblem.....................................................................22
Enzymer för kloratmetabolism......................................................................................................23
Transkription och promotor regioner i prokaryoter.......................................................................24
Möjliga promotorer för cld-genen i I. dechloratans och FNR-reglering.......................................26
3
Metodiker.......................................................................................................................................29
Uppnådda resultat..........................................................................................................................31
Viktigaste slutsatserna....................................................................................................................31
Material och metoder..........................................................................................................................32
Bakteriestammar, plasmider och odlingsförhållanden...................................................................32
Analys av promotorsekvens...........................................................................................................32
Plasmidpreparation........................................................................................................................32
Klyvning av plasmid......................................................................................................................33
PCR: Tillverkning av insert...........................................................................................................34
Klyvning av fragment....................................................................................................................35
Ligering..........................................................................................................................................35
Transformering..............................................................................................................................35
Verifiering av kolonierna med 189 bp och 172 bp transformanter................................................35
- galaktosidas Assay....................................................................................................................36
Elektrokompetenta celler...............................................................................................................36
Elektroporering..............................................................................................................................36
Resultat: Del I.....................................................................................................................................37
Analys av promotorsekvens...........................................................................................................37
Primers...........................................................................................................................................38
Plasmidpreparation........................................................................................................................40
Restriktionsklyvning......................................................................................................................41
PCR................................................................................................................................................44
Rening av PCR produkterna..........................................................................................................45
Transformering..............................................................................................................................46
Verifiering......................................................................................................................................47
4
Celltillväxt XL1-BLUE.................................................................................................................48
-galaktosidas assay.....................................................................................................................49
Resultat: Del II...................................................................................................................................52
Plasmidpreparation........................................................................................................................52
Restriktionsklyvning......................................................................................................................53
Rening av kluven plasmid .............................................................................................................54
PCR................................................................................................................................................55
Transformering II...........................................................................................................................56
Verifiering II..................................................................................................................................57
Transformering III.........................................................................................................................58
galaktosidas assay II...............................................................................................................61
Celltillväxt RM 101.......................................................................................................................66
Diskussion .........................................................................................................................................67
Val av plasmider.............................................................................................................................67
Val av primrar för test om hypotes.................................................................................................68
Fragmenten för test om hypotes.....................................................................................................69
Den FNR-beroende promotorn......................................................................................................70
FNR´s roll i I. dechloratans............................................................................................................72
Celltillväxt.....................................................................................................................................73
Klyvning av plasmid......................................................................................................................74
PCR................................................................................................................................................74
Felsökning assayer.........................................................................................................................75
Slutsats................................................................................................................................................76
Tackord...............................................................................................................................................77
Referenser...........................................................................................................................................78
5
Appendix............................................................................................................................................82
6
Övergripande Sammanfattning
Bakgrund
Under en längre tid har nu industriella processer som använder sig utav klorat och perklorat sökt en
lösning på hur man skulle kunna förhindra vidare utsläpp av dessa ämnen ut naturen. Ämnena är
viktiga komponenter i många av processerna och där klorat t. ex. används som blek och
deligninfieringsmedel inom pappersindustrin [3,4,17] och perklorat som komponenter i olika raket[5, 17, 18], och missilbränslen eller som gödningsprodukter [18]. Samtidigt besitter klorat och
perklorat egenskaper som gör dem extremt tåliga och mobila [17, 18] som medför att de väldigt lätt
kan röra sig långa avstånd ifrån källan ut i naturen. Dessutom är båda kompunden hälsoskadliga
både för människor, djur och växter. Klorat är framförallt skadligt för vattenväxter, främst brunalger
[1, 4, 17] där föreningen tros inhibera och stänga av ett nitratreducerande system som medför att
många av dessa växter dör [3, 17]. Perklorat har visat sig vara mer skadlig för människor och djur
där intag leder till försämrat jodupptag som i sin tur kan leda till växt och utvecklingsproblem hos
individen [2, 10, 16, 18]. Som lösning på problemet anses mikroorganismer som anaerobt kan
respirera dessa ämnen och på så sätt bryta ned dem till ofarliga grundämnen. Dessa bakterier
återfinns på platser där klorat och perklorat naturligt uppkommer. Det är vanligtvis i
minneralfyndigheter lokaliserade i öknar värden över som t. ex. i Chile och Kanada eller i
förhistoriska vattenansamlingar i runt om i USA [1, 5]. Mikroorganismerna finns i två typer,
perkloratreducernade bakterier som både kan reducera perklorat och klorat, och kloratreducernade
bakterier som bara kan reducera klorat [4, 11, 17]. Enzymen som gör det möjligt att under anaeroba
förhållanden respirera dessa ämnen är perklorat reduktas, klorat reduktas och kloritdismutas. Endast
perkloratreducerande bakterier bär på perklorat reduktas som både kan reducera perklorat och klorat
vidare till klorit, likaledes gäller kloratreduktas som bara finns kloratreducernade bakterier och bara
reducerar klorat till klorit men klarar inte av perklorat. Kloritdismutas är gemensamt för de båda
huvudtyperna och omvandlar klorit till syre och kloridjoner [4,10]. Reaktionsvägen för nedbrytning
av perklorat och klorat visas i Figur S1.
Figur S1. Visar reaktionsvägen för reduktionen av klorat och perklorat.
7
Transkription och promotor regioner i prokaryoter
För att en gen i en mikroorganism ska uttryckas till ett funktionellt protein måste först ett RNApolymeras binda in till en sekvens strax uppströms genen. Den sekvensen kallas en promotor och
tillåter initiering utav en transkriptionsprocess. Det innebär att RNA polymeraset skriver om genen
som en kopia i form av ett ”messenger RNA” som senare översätts till ett funktionellt protein in
annan process som kallas translation. Promotorregionen är mycket viktig för uttrycket och
bestämmer i vilken grad det sker. Den har karakteristika drag som identifieras av en s-faktor, ett
protein associerar med RNA polymeraset och leder polymeraset dit strax innan transkription.
Beroende på om de karakteristiska dragen är mer eller mindre konserverade avgör de hur aktiv
promotorn är och därmed om uttrycket är högt eller lågt. Dessa drag identifieras som ett
transkriptionsstart som är nukleotiden A eller G och två element som benämns -10 och -35.
Elementen är ungefärligt positionerade -10 och -35 nukleotider från transkriptionsstart och har
konsensussekvenserna TATAAT respektive TTGACA (Figur S2). Ett avvikande ifrån sekvenserna är
vanligt i promotorer där normalt 3/6 eller fler av nukleotiderna är bevarade [8, 9]. Det finns också
en större preferens för vissa nukleotider på bestämda positioner inom -10 elementet som anses ha en
större betydelse inom för identifiering av promotorn och inledning av transkription. Dessa är det
första T:t inom – 10 elementet, närmast transkriptionsstart och benämns ha position -7, och A på
position -11 räknat uppströms från -7 positionen. De tar direktkontakt med RNA-polymeraset [24].
-10 elementet i sig själv är oftast mest bevarat, speciellt i de fall där -35 området avviker ibland
uppkommer en TG determinant positionerat en nukleotid uppströms -10 hexameren (Figur S2) som
ytterligare styrker promotorn identifieringen [9, 12]. Elementet benämns då ”exteneded – 10” och
har konsensus-sekvensen TGNTATAAT. Även optimala avstånd mellan elementen och TSS utgör
en effekt på promotoraktiviteten, för störst aktivitet är avstånden sjutton nukleotider mellan -10 och
-35 elementet [12, 24] och sju nukleotider mellan -10 elementet och transkriptionsstart. Små
proteiner som kallas utav transkriptionsfaktorer kan ibland binda in till promotorn och underlätta
eller motverka inbindning av ett RNA-polymeras och därmed öka eller sänka uttrycket av
genprodukten. En sådan transkriptionsfaktor är FNR som kontrollerar övergången mellan aerob och
anaerob metabolism via reglering på transkriptionsnivå [6, 14, 23]. FNR är en monomer som
aktiveras i syrefria miljöer och får då ett [4Fe–4S]2+ kluster som tillåter dimerisering [23]. Det leder
till att proteinet sekvensspecifikt kan binda in till en egen konsensus-sekvens som är placerade på
promotorer och reglera uttrycket.
Figur S2. Visar den typiska arkitekturen för en bakteriell promotor och konsensus-sekvenserna för faktorn hos E.coli [19].
8
Tidigare resultat och avsikten med arbetet
Problemet med mikroorganismerna är att många av dem är fakultativa anaerober som innebär att de
lever under aeroba förhållanden men har förmågan att utnyttja anaeroba respiration i frånvaro av
syre. Det betyder att man måste avlägsna syret i miljön runt omkring för att få bakterierna att gå
över till en anaerob respiration för att de t. ex. ska kunna reducera klorat och perklorat. Ideonella
dechloratans tillhör kloratreducerande bakterier där studier kring den anaeroba uppregleringen utav
kloritdismutas främst stått i fokus. Målet är att förstå vad som orsakar den så att man potentiellt
skulle kunna styra över den oberoende av hur miljön runt omkring ser ut. Hittills har ett möjligt
transkriptionsstart identifierats [21] och en möjlig FNR-box [20] (Figur S3) inom sekvensen
uppströms kloritdismutas-genen. Man har visat att mutationer på FNR-boxen inte bara stänger ned
den anaeroba induktionen men också leder till att basaluttrycket under aeroba nästan försvinner helt
[15]. Genom att istället bevara FNR-boxen och föra över promotorregionen till en bakteriestam som
inte har förmåga att uttrycka ett FNR har det visat att ett basalt uttryck ändå förmedlats [15]. Detta
gav upphov till en hypotes om att en FNR-beroende promotor längre nedströms finns som leder den
anaeroba induktionen eftersom med FNR-sätets position i förhållande till transkriptionsstart (Figur
S3) ser ut att ha en undertryckande roll utav genen.
Figur S3. Visar var en möjlig promotor skulle kunna vara belägen för kloritdismustas-genen i Ideonella dechloratans. De lätt
understrukna nukleotiderna i -10 och -35 elementen stämmer överens med konsensus-sekvenserna i Escherichia coli [15]. Den
grövre understrukna sekvensen är ett möjligt FNR-säte position.
Därför gjorde jag en teoretisk analys av sekvensen uppströms kloritdismutas-genen i förhållande till
FNR-pallindromet med i hopp om att finna en möjlig FNR-beroende promotor (Figur S4). Av den
gjorde jag sedan två fragment, ett 189 bp långt som bevarar hela den möjliga promotorn och ett 172
bp långt där det möjliga -10 elementet avlägsnats. De ligerades in i reportervektorer och
transformerades in i två olika Escherichia coli stammar med (XL1-BLUE) och utan (RM 101)
förmåga att producera ett FNR. En del av celler som saknade FNR transformerades också med en
gen ifrån Ideonella dechloratans som möjligen kodar för ett FNR. Genom att mäta uttrycken under
aeroba och anaeroba förhållanden kunde resultatet av mätningarna relateras till frågeställningen om
hur vida det finns en FNR-beroende promotor uppströms kloritdismutas-genen och om den regleras
utav ett FNR-protein.
9
Figur S4. Visar en hur den möjliga FNR-beroende promotorn för kloritdismutas genen i Ideonella dechloratans ser ut. Sekvensen
antogs vara en klass II promotor som allmänt har ett transkriptionsstart 41,5 nukleotider nedströms mitten av FNR-sätet. Det optimala
avståndet på sju nukleotider uppströms transkriptionsstart gav ett möjligt extended -10 element markerat i fet stil med understrukna
nukleotider som överensstämmer med Escherichia coli konsensus-sekvens TATAAT. -35 elementet bestämdes sjutton nukleotider
uppströms första nukleotiden i -10 hexameren, elementet är markerat med fet stil och överensstämmande nukleotider understrukna.
Metodiken kortfattat
Tillverkningen av sekvenserna innehållande den möjliga FNR-beroende promotorn med och utan
-10 elementet gjordes med Polymerase Chain Raction eller PCR. Tekniken går ut på att man
amplifierar en önskad sekvens ifrån t. ex. en större DNA molekyl. För att utföra reaktionen behövs
två primrar som är komplementära till en del utav sekvensen som ska amplifieras, ett polymeras,
nukleotider, MgCl och templat DNA. Reaktionen delas därefter in i tre steg efter varandra
denaturereing annealing och extension. Stegen utförs sedan i ordning med bestämda temperaturer
och tider sådant att primrarna binder in till sekvensen som ska amplifieras och polymeraset kan
förlänga primrarna. Stegen utförs flera gånger som ger upphov till att ett stort antal produkter
bildas.
För att mäta om fragmenten av den möjliga FNR-beroende promotorn kunde ge upphov till
transkription och därmed uttryck ligerades de in framför en promotorlös gen som kodar för enzymet
galaktosidas i plasmiderna pBBR1MCS-4-LacZ och pBBR1MCS-2-LacZ. Plasmiden som är en
cirkulär DNA sekvens och klövs upp så att den blev linjär och efter det sammanfogades med den
amplifierade promotorsekvensen och återförslöts igen.
Klyvningen görs med restriktionsenzymer som identifierar en specifik DNA sekvens som benämns
ett restriktionssäte bestående av ett par nukleotider och klyver av DNA:t där. Plasmiden innehåller
många sådana säten från början medans ett specifikt säte som också fanns i plasmiden adderades på
promotorsekvensen under amplifieringen. Både plasmid och promtorsekvens kan då klyvas med
samma restriktionsenzym som gör att komplementära ändar hos plasmid och promotorsekvens som
kan binda till varandra via vätebindningar. Sammanfogningen slutförs sedan i ett ligeringssteg där
enzymet DNA ligas syntetiserar ihop DNA strängarna kovalent med fosfodiesterbindningar som
återförsluter promotorsekvensen med plasmiden som återgår till cirkulär form, nu innehållande
promotorsekvensen framför galaktosidas-genen.
För att introducera in plasmiden innehållande den möjliga FNR-beroend promotrsekvensen in i en
bakterie användes transformering. Två olika transformeringsmetoder användes. En mer generell
metod som involverar att man utsatte cellerna för ett elektriskt fällt en kort tid som ger upphov till
att porer bildas i cellväggen och medför att DNA molekyler ifrån omgivningen kan tränga in. Den
andra metoden var mer specifik och där tillgjorda celler som mycket lätt tar upp DNA beställdes
ifrån ett företag och där igenom följa ett protokoll som beskriver hur man ska gå till väga för att
introducera DNA utifrån in i cellen.
10
Cellerna odlas därefter upp under aeroba och anaeroba förhållanden i lämpligt odlingsmedium med
antibiotika. Det skördas under exponentiell fas och toulen tillsattes som permeabiliserar cellerna så
att det färglösa substratet o-nitrophenyl--D-galactoside (ONPG), när tillsatt, kan diffundera in i
cellen och konverteras av galaktosidas till två produkter varav en är färgad. Mängden gul
produkt kan då mätas via absorbans vid våglängden 420 nm som är, proportionellt mot, om
substratet tillsätts i överflöd, mängden enzym som bildats och reaktionstiden [22].
Sammanfattning av resultaten
Den 189 bp långa sekvensen med den fullständigt bevarade möjliga FNR-beroende promotorn gav
upphov till basaluttryck och anaerob induktion. Induktionen bestämdes till 3.3 ggr basaluttrycket i
XL1-BLUE och till 2.8 i RM 101 som också kontransformerats med den möjliga FNR-genen ifrån
Ideonella dechloratans. Den kortare 172 bp sekvensen där -10 elementet avlägsnats gav inget
uttryck i XL1-BLUE till väldigt låga uttryck i RM 101 utan tydlig anaerob induktion (Figur S5 och
S6).
Beta – galaktosidas [Miller Units]
Beta - galaktosidas aktiviteten i XL1-BLUE celler med 189 bp
och 172 bp fragmenten under aeroba och anaeroba förhållanden
300
250
Aerobt (189 bp fragment)
200
Anaerobt (189 bp fragment)
150
Aerobt (172 bp fragment)
100
Anaerobt (172 bp fragment)
50
0
-50
Figur S5. Visar galaktosidas aktiviteten i XL1-BLUE celler innehållande plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ med 189 bp fragmentet
mot celler med 172 bp fragmentet efter tillväxt under aeroba och anaeroba förhållanden. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett
95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 22 st för 189 bp
aerobt, 12 st för 189 bp anaerobt, 24 st för 172 bp aerobt och 18 st för 172 bp anaerobt.
11
Beta - galaktosidas [Miller Units]
Beta - galaktosidas aktivitet i RM 101 med FNR av
189 bp och 172 bp fragmenten aerobt och anaerobt
100
80
Aerob 189 bp fragment med
FNR utan bakgrund
60
Anaerob 189 bp fragment med
FNR utan bakgrund
40
Aerob 172 bp fragment med
FNR utan bakgrund
20
0
Anaerob 172 bp fragment med
FNR utan bakgrund
Figur S6. Visar Galaktosidas aktiviteten i RM 101 celler med I. dechloratans FNR innehållande fragmenten 189 bp och 172 bp
under aeroba och anaeroba förhållanden. Det bidragande uttrycket förmedlat i celler med bakgrundsplasmiderna innehållande FNR
har subtraherats bort ifrån alla mätningar. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett 95 % konfidensintervallet för det uppmäta
medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 3 för alla aeroba prov och 4 st för de anaeroba.
Det verifierades genom att jämföra uttrycken aerobt och anaerobt för 172 bp fragmentet mot uttryck
i celler som enbart bar på reportervektorn utan inligerat fragment. Resultaten visade också att RM
101 som endast transformerats FNR-genen ifrån Ideonella dechloratans överlevde under anaeroba
förhållanden med NaNO3-respiration till skillnad från RM 101 utan någon FNR-gen.
De viktigaste slutsatserna
Resultaten visar tydligt att utan det föreslagna -10 elementet sänks uttrycket under både aeroba och
anaerob förhållanden till nära noll och måste bevaras för fullt uttryck utav kloritdismutas. Av det
dras slutsatsen att transkription under aeroba och anaeroba förhållanden startar ifrån den FNRberoende promotorn. En annan slutsats är att den möjliga FNR-genen Ideonella dechloratans kodar
för ett protein som kan inducera uttrycket under anaeroba förhållanden. Proteinet har också
förmågan att ersätta Escherichia coli 's FNR-proteins i roll under NaNO3-respiration.
12
Executive Summary
Background
Under a longer peridod of time industriall processes that makes use of chlorate and perchlorate has
been seekeing a solution on how to stop the effluent of these compounds reaching the environment.
Both chlorate and perchlorate are important componenents in many of the processes and are
specifically used as bleech and delignifying agents in the paper and pulp indusrty [3,4,17],
respektive as components in combustionaccelerants such as rocket [5, 17,18], and missilfuels, and
fertilizeragents in agriculture [18]. At the same time chorate and perchlorate are extremly mobile
and inert [17, 18] which makes it easy for them, once they escape an industriell area, to travel long
distances from the source and widley contaminate the environment. Further, the compounds are
considered hazardous for both animal and plants. Chlorate does most damage to waterplants such as
algea, where it inhibits a nitratereducing pathway causing it to fail [3, 17] which has resultet in that
many of these plants have dissapeard, in particular brown algea [1, 4, 17]. Perchlorate has shown to
be more hazardous toward animals and humans where it interferes with the iodine uptake causeing
growth and developmental problems to the individual [2, 10, 16, 18]. A possible solution to this
problem might be to use of naturally found microorganisms with the ability to anaerobically respire
on these compunds, reducing them into the their corresponding elements, rendering them harmless.
These creatures are found all around the world in places where know sources of natural chlorate and
perchorate has been found. This is usually mineralldeposits found in desserts like in Chile and
Canada or in prehistoric aquifers around the USA [1, 5]. The microorganisms are present in two
types, perchlorate-respiring bacteria and chlorate-respiring bacteria. Perchlorate-respiring bacteria
can reduce both perchlorate and chlorate while chlorate-respiring bacteria can only reduce chlorate
[4,11, 17]. The enzymes which makes this possible is perchlorate reductase, chlorate reductase and
chlorite dismutase. Perchlorate reductase has the ability to reduce both perchlorate and chlorate to
chlorite and is only present in perchlorate-respiring bacteria. Chlorate reductase can reduce chlorate
to chlorite but not perchlorate, and is present in chlorate-respiring bacteria. The enzyme chlorite
dismutase turns chlorite into molecular oxygen and chloride ions [4,10], and are present in both
perchlorate-respiring bacteria and chlorate-respiring bacteria. The reaction pathway for the
degradation of chlorate and perchlorate is shown in Figure SI.
Figur SI. Shows the reaction pathway for the reduction of chlorate och perchlorate.
13
Transcripiton and promoter regions in prokaryotes
In order for a functional protein to be expressed from a gene an enzyme called RNA-polymerase
must attach itself to small region just upstream the gene. This sequens is termed a promoter and
allows for the initation of a process called transcription. The meaning of transcription is when the
RNA-polymerase rewrites a copy of the gene in the form of a ”messenger RNA”, the mRNA is later
transalted into a functional protein in another process called translation. The promoter is essentiell
for the expression of the gene and decides to what extent it is done. It has some characteristic
features that can be identifiead by another protein, the s-factor, which associates it self with the
RNA-polymerase and leads the polymerase to the promoter in time for transcription. Depending on
how well conserved these characteristic features are helps decide how active the promoter is and by
that if the gene expression is high or low. The features are a transcription start site which is an A or
a G nucleotide and beyond that two elements termed -10 and -35. The elements have the consensus
sequenses of TATAAT respektive TTGACA and are approxemalty possitioned -10 respektive -35
nucleotides uppstream the transcription start site (Figure SII). Usually the elements are not
compleatly conserved and a match of 3/6 nucleotieds per element or more is to be expected [8, 9]. It
has also been shown that there is a preference for some nucleotides at certain positions within the
-10 element. These are the first T within the -10 element closest to the transcription start site
referred to as the -7 position, and A on position -11 counting uppstream from the -7 position.
Because of the higher preference of the nucleotides -7T and -11A, it has predicted that they have
more of an importans than the other nucleotides in the -10 element in the process of identyfiying the
promoter. Later is has been shown that they make direct contact with the RNA-polymerase under
the initiation of transcription process [24]. The -10 element is the more conserved element between
the two especially when the – 35 element is not. Then the appearance of a TG determinant might
happen, possitioned on nucleotde upstream the -10 element (Figure SII), that can further strengthens
the promotor identification and activity [9, 12]. The combination of this TG determinant with the
-10 element is called an ”extended -10 element” and has the consensus sequence TGNTATAAT.
Even the distances between these elements and in relationship to the transcription start site has an
impact on the promotor strength. The most common distances between the -10 and -35 elements
are 17 nt [12, 24] and 7 nt between the -10 region and the transcription start site, this is also
considered to be the most optimal distances that contributes most to the promotor activity. The
expression of a gene can also be regulated by the binding of small proteins referred to as
transcriptionfactors to the promotor, facillitating or counteracting the transcription process and
thereby increase or repress the exprsseion. FNR is an example of such a transcriptionfactor, that
regulates the transition between aerobic and anaerobic respiration on the trancriptional level [6, 14,
23]. The protein consists of a monomer that activates under oxygen starvation and is then presented
with a [4Fe–4S]2+ cluster allowing it to dimerize [23] and successfully bind to a consensus sequence
of its own located somwhere on the promoter region of genes whom are regulated by FNR.
Figur SII. Shows the typical architecture of a bacterial promoter and consensus sequence of the - factor of E.coli [19].
14
Earlier results and the purpose of this thesis
Many of the microorganisms are facultative anaerobs which means that gathers energy through
aerobic respiration if oxygen is present but has the ability to switch to anaerobic respiration or
fermentation if oxygen i abscent. This presents qiute of a problem in that the effluent from an
industriell process must be deprivied of oxygen in order for the bactereia to enter anaerobic
respiration and reduce chlorate and perchlorate. Ideonella dechloratans is a chlorate respiring
bacteria in which studies connected to the uppregulation of the chlorite dismutase gene has been of
main focus. The goal is to get an understanding of what's causing this increase so that one would be
able to controll it without having to deprive the effluent of oxygen. So far a possible
transcritionstart site [21] and a FNR-box [20] (Figure SIII) within the sequence upstream the
chlorite dismutase gene. It has been shown that mutating the FNR-box inside the promoter region
leads to almost total loss of expression under both aerobic and anaerobic conditions. By insted
preserving the FNR-box and cloning the entire possible promoter region into the FNR negative
Escherichia coli type RM 101 has shown that the promoter still supports basal expression under
aerobic condition [15]. This gave to the hypothosis of that there might be a FNR-dependent
promoter further downstrem the FNR-box which is responsible for the upregulation since the
postion of the FNR-box in relationship to the possible transcription start site (Figure SIII) is mostly
seen in cases when FNR acts as a repressor.
Figur SIII. Shows where a possible promotor could be positioned relative to the chlorite dismutase gene in Ideonella dechloratans.
The thin underlined nucleotides inside the -10 and -35 elements match the consensus sequence in Escherichia coli. The coarser
underlined sequence is a possible FNR-site [15].
15
Therefor I made a theoretical analysis of the sequence upstream the chlorite dismutase gene with
respect to the position of the FNR-box in hope of finding a possible FNR-dependent promotor
(Figure SIV). I then made two constructs of the result i found, one 189 bp long sequence containing
the entire possible FNR-dependent promoter and one 172 bp long sequence where the -10 element
had been removed. The sequences where ligetad in reprtervectors and transformed into to types of
Escherichia coli types with (XL1-BLUE) and without (RM 101) the ability to produce FNR. Into
some of the cells lacking the ability to produce FNR, a gene that might code for a FNR-protein in
Ideonella dechloratans was also transformed indroduced into them. By conducting chemicall assays
I was able to measure the expression each construct provided under aerobic and anaerobic
conditions and by doing so it was possible to relate them to issue if there exists a FNR dependen
promoter upstream the chlorite dismutase gene and if it is regulated by FNR.
Figur SIV. Shows where the possbile FNR-dependent promtoter for the chlorate dismutase gene in Ideonella dechloratans is located.
The sequence was assumed to be a class II type FNR promoter which has a transcription start site 41.5 nucleotides downstream the
centre of the FNR-site. The optimal distance of seven nucleotides upstream the transcription start introduced a possible extended -10
element marked in bold type with underlined matching nucleotides to the Escherichia coli consensus sequence TATAAT. The -35
element was found seventeen nucletides upstream the fisrt nucleotide in the -10 hexamer, the element is also marked in bold type
with underlined matching nucleotides.
16
Methods
The production of the constructs containing the possible FNR-dependent promoter with and without
the -10 element was made by the use of a technique called Polymerase Chain Raction or PCR. It
makes it possible to amplify a short fragment of DNA from a known sequence. In order to conduct
this method two primers are needed whom are short oligonucleotied complementary to a short
strech flanking part of the sequnce intended for amplification. Also needed are nucletiodes, a
polymerase, some MgCl and a DNA template. The reaction which produces the products is devided
into three stages, denaturation, annealing and extension and are conducted in that order with set
times and temperatures. This makes it possible for the primers to bind to the sequence of intresst
and for the polymerase to extended the primers and thereby make a copy of the fragment. This is
performed multiple times through the process resulting in a large number of products.
In order to estimate if the constructs were able to give rise to expression they had been ligated
infront off the b-galactosidase gene in the reportervector pBBR1MCS-4-LacZ and pBBR1MCS-2LacZ. The reportervector which has a circular shape was cut open to give a linear shape and
thereafter a construct were joined together with the reportervector and ligated into circular form
again. The digestion was done by using restrictionnezymes which identifies a specific DNA
sequance called a restriction site consisting of a short strech of nucleotides. The restricitionenzymes
cuts the DNA at this loaction. The vector contains alot of these sequances corresponding to multiple
restrictionenzymes. One of these restriction sites is added to the constructs during the PCR
amplification so that both the vector and the constructs can be digested with the same
restrictionenzyme. This leads to that complementary ends are formed on the vector and constructs
which can then bind to each other through hydrgenbonding. By addning DNA ligase, new
phosphodiesterbonds are formed between the vector and the construct which returns the vector to its
circular shape now containing the possible FNR-dependent promoter sequence infront off the
galactosidas-gene.
To introduce the reportervector carrying the variations of the possible FNR-dependend promoter
into bacteria the method of transformation was used. Transformation can be conducted in many
ways where as in this work two methods were used. One was a more common method which
involve exposing the cells to an electric pulse under a short period of time which promotes the
formation of pores in the cell wall therby making it possible for DNA molecules in the surrounding
solution to enter.
The cells were thereafter cultivated under aerobic and anaerobic conditions in a propper cultivation
medium and an antibiotic. They were then harvested under exponentiall growth and was treated
with toluene directly afterwards. This shatters the cell making entry of small molecules such as the
substrate o-nitrophenyl--D-galactoside (ONPG) into the cell possible. ONPG is collorless which
is converted into two products, one of which is yellow, in the presence of b-galactosidase. The
amount of yellow product can be measured with absorbance at 420 nm, and if ONGP was added in
excess, the amount of product is proportional to the amount of enzyme present and the reaction time
between the enzyme and ONPG [22].
17
A summary of the results
Beta – galactosidase [Miller Units]
The 189 bp construct containg the entire possible FNR-dependent promoter was shown to support
both basal expression and was upregulated under anaerobic conditions. The anaerobic induction
was determined to be 3.3 times the basal expression in XL1-BLUE, and 2.8 in RM 101 containing
the the possible FNR gene from Ideonella dechloratans. The shorter cosntruct with the -10 element
removed didn't give rise to any expression at all in XL1-BLUE and a very low expression in RM
101 (Figure SV and SVI).
Beta - galactosidase activity in XL1-BLUE cells containing 189 bp
and 172 bp fragments under aerobic and anaerobic conditions
300
250
200
Aerobic (189 bp fragment)
Anaerobic (189 bp fragment)
150
Aerobic (172 bp fragment)
100
Anaerobic (172 bp fragment)
50
0
-50
Figur SV. Shows the galactosidase activity in XL1-BLUE cells containing the vector pBBR1-MCS4-LacZ with the 189 bp
fragment vs cells with the 172 bp fragment after growth under aerobic and anaerobic conditions. The errorbars represent a 95 %
confidnece interval for the mean value. The number of observations for each mean value are 22 and 12 for the 189 bp under aerobic
and anaerobic conditions respecively. For the 172 bp fragment the number of observations were 24 under aerobic and 18 under
anarobic conditions.
Beta - galactosidase [Miller Units]
Beta - galactosidase activity in RM 101 with FNR and
189 bp and 172 bp fragments under aerobic and anaerobic conditions
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Aerobic 189 bp fragment with
FNR minus backbone vectors
with FNR
Anaerobic 189 bp fragment med
FNR minus backbone vectors
with FNR
Aerobic 172 bp fragment med
FNR minus backbone vectors
with FNR
Anaerobic 172 bp fragment med
FNR minus backbone vectors
with FNR
Figur SVI. Shows the galactosidase activity in RM 101 cells with Ideonella. dechloratans FNR-gene and the vector pBBR1MCS2-LacZ containing the fragments 189 bp och 172 bp under aerobic and anaerobic conditions. The expression mediated by the
backbone vectors alone containing the FNR-gene has been subtracted from all measurements. The errorbars represent a 95 %
confidnece interval for the mean value. The number of observations were 3 under aerobic and 4 under anarobic conditions.
18
This was verified by comparing the expressions under both aerobic and anaerbic conditions
between the 172 bp construct and the expression mediated by the reportervector alone. The results
also showed that RM 101 containing the FNR-gene from Ideonella dechloratans but not any of the
constructs was able to survive under anaerobic conditions during NaNO3 respiration.
Conclusion
Regarding the -10 element, it has been shown that it is important for full expression and without it
there is no expression, under both aerobic and anerobic condition. The conclusion that this is the
one and only promoter from whom which both aerobic and anaerobic transcription is initiated at is
drawn. Another colusion is that the possible FNR-gene in Ideonella dechloratans encodes such a
protein with the ability to induce the expression of the chlorite dismutase gene and also has the
abillity to replace Escherichia coli 's FNR under anaerobic respiration with NaNO3.
19
Förkortningar
PRB
Perkloratreducerande bakterier
CRB
Kloratreducerande bakterier
FNR
fumarate and nitrate reduction regulatory protein
PCR
Polymerase chain reaction
MCS
Multiple cloning site
Ö. N
Över natt
bp
Baspar
SD
Site Directed
ONPG
o-nitrofenyl-b -D-galaktosid
sRNAP
Sigma factor bundet RNA polymeras
TAE
Tris-Acetat-EDTA Buffert
TBE
Tris-Borat-EDTA Buffert
Cld
Kloritdismutas
Clr
Kloratreduktas
LB
Luria Bertani Broth
OD
Optisk densitet
nt
Nukleotider
20
Introduktion
Problemformulering
I dag hanterar många industriella processer ämnen som potentiellt kan vara skadligt för vår miljö,
sådana ämnen är perklorat ClO4- och klorat ClO3-. De är båda inerta och stabila nog att under flera
decennier kvarstå i naturen. Eftersom de är hälsoskadliga för både djur och växter vill man finna ett
sätt att ofarliggöra dem. Bakterier som kan livnära sig på klorat och perklorat via anaerob
respiration finns i naturen, främst på platser där dessa ämnen förkommer naturligt. Dessa bakterier
anses kunna vara en potentiell lösning till problemet med den ökande mängden klorat och perklorat
i naturen som resultat av användning i industriella processer. För rening av förorenade områden
behöver man veta hur regleringen av generna för de enzymer som deltar i nedbrytningen perklorat
och klorat fungerar eftersom de endast aktiveras under anaeroba förhållanden och den kunskapen
finns inte idag. Ideonella dechloratans är en kloratreducerande bakterie som med gener för
enzymerna kloratreduktas och kloritdismutas kan bryta ner klorat till de ofarliga produkterna
kloridjoner och syrgas. Det som hitintills är känt om bakterien är att genuttrycken ökar under
anaeroba förhållanden. På sekvensen uppströms kloritdismutas-genen (cld) har ett
transkriptionsstart identifierats och en sekvens med stor likhet till en känd bindningssekvens för
transkriptionsfaktorn FNR. Det är ett protein som tillåter anpassning av bakterier till syrefattiga
miljöer genom på transkriptionsnivå nedreglera enzymer som är nödvändiga för aerob respiration
och uppreglera uttrycket av enzymer som är viktiga för anaerob respiration. Detta sker genom att
transkriptionsfaktorn binder in till en specifik DNA sekvens som ligger inom en promotorregion
uppströms genen ifråga och därmed underlättar eller undertrycker transkription. Det finns två typer
av promotorer som regleras utav FNR, dessa typer delas in klass I och II promotorer beroende på
FNR-sätets position i förhållande till transkriptionsstart. En klass II promotor har ett
transkriptionsstart (TSS) centrerat 41,5 nt nedströms FNR-sätet och klass I promotorer har ett TSS
längre nedströms. Detta arbete delas upp i två delar, del I och del II som kretsar kring huruvida FNR
reglerar uttrycket utav cld.
Syfte
Syftet med arbetet var identifiera om cld uppreglerades utav FNR under anaeroba förhållanden och
därmed om det möjligen fanns en klass II FNR-beroende promotor placerad 41,5 nt nedströms det
möjliga FNR-sätet. Utöver det tog jag reda på för om en gen i I. decloratans som antogs koda för ett
funktionellt FNR-protein gjorde det och om det kunde binda in till FNR-sätet och inducera uttrycket
av cld.
21
Klorat och perklorat: Egenskaper och miljöproblem
I dagens samhälle beror vår vardag till stor del av industriella processer som genom produktion av
viktiga varor och tjänster underlättar livet. För att dessa viktiga uppgifter ska kunna utföras krävs
ibland hantering av ämnen som potentiellt kan vara skadligt för djur och natur. Dessa ämnen
efterlämnas ofta i processen, eller bildas som biprodukter och kontaminerar olika delar av naturen.
Därför är det ett globalt mål att finna praktiska lösningar på dessa problem. Exempel på förorenande
processer är sådana som använder sig av och släpper ut oxyanjonerna perklorat ClO4- och klorat
ClO3-. Klorat förekommer ofta inom pappersindustrin där klorat främst används i tillverkning av
klordioxid som sedan används för blekning av produkter, man får också tillbaka klorat då det
återbildas efter blekningsprocessen. Det används också som delignifieringsmedel inom massa och
pappersindustrin och inom jordbruk som herbicider och avlövningsmedel [3,4,17]. Perklorat kan
också förekomma ifrån antropogen aktivitet, dvs i processer som utförs utav människor, ett exempel
är tillverkning av ammoniumperkloratsalter som främst används i oxidationsmedel för fast
raketbränsle, pyroteknik [5, 17, 18], bomber, färgproduktion, batterier och smörjmedel [5]. Det
återfinns också i produkter som ammunition, missilbränsle och gödningsprodukter [18]. Dessa
ämnen är starkt inerta och vattenlösliga och eftersom de inte adsorberas på partiklar så som jord och
sediment är de extremt mobila och tåliga. Konsekvensen blir att de lätt följer med ut i naturen, kan
spridas långt ifrån ursprungskällan och ansamlas på platser som i jord och vattenkällor under flera
decennier [17, 18].
Det har visat sig att perklorat kan ge upphov till dysfunktionalitet av hormonproduktionen i
sköldkörteln genom att binda till natrium-jod symportern i sköldkörteln och inhibera upptaget av
jod. Det leder till endokrina sjukdomar och kan ge upphov till tillväxt- och utvecklingsproblem,
framförallt hos foster och spädbarn [2, 10, 16, 18]. Klorat är framförallt giftigt för många typer av
vattenväxter, där vissa typer av brunalger drabbas hårdast [1, 4, 17]. Det kan förklaras genom att
klorat ClO3- är strukturellt likt nitrat NO3- och kompetetivt inhiberar enzymet nitratreduktas som
finns i dessa vattenväxter. Man tror också att eftersom enzymet har svårt att skilja mellan nitrat och
klorat kan det ibland förekomma en förväxling mellan dem som resulterar i att enzymet istället
reducerar klorat till klorit eller hypoklorit som är två extremt reaktiva ämnen. Effekten av detta blir
att det nitratreducerande systemet stängs av [3, 17]. Eftersom både perklorat och klorat har visat sig
vara giftiga och därmed klassificerats som hälsoskadliga för både människor och djur försöker man
nu hitta en lösning som oskadliggör dem.
Dessa ämnen förkommer också i naturen på platser som inte påverkats av människan. Perklorat och
klorat finns världen över och hittas på torra platser såsom i öknar och i förhistoriska
vattenansamlingar [1, 5, 16]. Den största kända ackumuleringen av naturligt perklorat finns i
nitratrika områden i Chiles Atacama öken, men har också funnits Death Valley och Mission Valley
Eocene deposits i Kalifornien, Potash deposits of Saskatchewan i Kanada och förhistoriska
vattenansamlingar i Texas och New Mexiko [5]. Naturliga förekomster av klorat har upptäckts först
på senare tid och förekommer på liknande platser. Den naturliga produktionen av dessa ämnen är
inte helt förstådd. Många system föreslås som t. ex. fotokemiskt i atmosfären, på kloridbelagda
mineralytor, som slutprodukt av fotokemiska reaktioner av klorprekursorer som hypoklorit, klorit
och klorat under ultraviolett strålning eller genom ozonoxidation av kloridjoner i dessa torra
regioner och vattenansamlingar [5]. Senare forskning styrker hypotesen om en global och
kontinuerlig produktion av perklorat och klorat i jordens atmosfär [1, 5, 11].
Man har hittat mikroorganismer som kan livnära sig på klorat och perklorat genom anaerob
respiration spridda på många ställen i naturen men de första stammarna man isolerade var ifrån
kontaminerade vatten, industriområden mm. Dessa mikroorganismer anses vara en potentiell
lösning för de industriella processer som hanterar klorat och perklorat.
22
Där är tanken att mikroorganismerna skulle kunna reducera bort klorat och perklorat i utflödet och
därmed stoppa fortsatt kontaminering av miljön. Mikroorganismerna som kan livnära sig på dessa
ämnen är fakultativa anaerober, det betyder att de lever under aeroba förhållanden men har
förmågan att utnyttja anaeroba respiration i frånvaro av syre. För att då få mikroorganismerna att
reducera dessa ämnen måste de först gå över till anaerob respiration. Det medför att allt syre i
miljön runt omkring t. ex. i utflödet måste avlägsnas, någonting som kostar mycket pengar och är
opraktiskt. Därför studeras nu genregleringen som leder till den anaeroba respirationen på
molekylär nivå i hopp om att förstå hur den fungerar. Målet är att det med tillräcklig kunskap ska
vara möjligt att styra över vilken respiration som inleds och inte behöva anpassa miljön runt
omkring.
Enzymer för kloratmetabolism
Det finns två typer av bakterier med förmågan att reducera dessa ämnen, perkloratreducerande
bakterier (PRB) och kloratreducerande bakterier (CRB). Bakterier tillhörande (PRB) kan reducera
båda perklorat och klorat medans (CRB) kan reducera klorat men inte perklorat [4, 11, 17].
Enzymerna som står för den anaeroba respirationen av klorat och perklorat är perkloratreduktas
(Pcr) som reducerar perklorat till klorit via klorat. Det finns enbart hos perkloratreducerande
bakterier. Kloratreduktas (Clr) reducerar klorat till klorit men har inte förmågan att reducera
perklorat och finns i kloratreducerande bakterier. Kloritdismutas (Cld) är gemensamt för båda
bakterietyperna och omvandlar klorit till syre och kloridjoner [4,10]. Reaktionsvägen för
nedbrytning av perklorat och klorat visas i Figur 1.
(PRB)
(PRB)/(CRB)
2e-
2e-
(PRB)/(CRB)
ClO4- ----------------------> ClO3- --------------------> ClO2- -----------------------> Cl- +
Pcr
Pcr/Clr
O2
Cld
Figur 1. Visar reaktionsvägen för reduktionen av klorat och perklorat.
23
Transkription och promotor regioner i prokaryoter
Vägen ifrån en gen till ett funktionellt protein är kräver två processer, transkription och translation.
Transkription är då en gen avskrivs som en kopia i form av ett ”meddelar RNA” (mRNA). Enzymet
som initierar och utför transkriptionen är RNA polymeras. Därefter kommer translation där
ribosomer binder in till mRNA:t och avläser den information som genen kodar och syntetiserar det
korresponderande proteinet. Transkriptionen skiljer sig i detalj men är i huvuddragen samma mellan
olika celltyper såsom djurceller och bakterieceller. För att transkription i bakterier ska kunna inledas
behöver RNA polymeraset associera sig med en faktor, ett protein som leder polymeraset till en
region strax uppströms genen. Detta område kallas för en promotor och sträcker sig mellan -60bp
till + 20bp relativt till transkriptionsstart som utgör +1 positionen [12, 13]. Varje promotor har
karakteristiska drag som bestämmer hur hög affiniteten mellan RNA polymeraset och DNA
sekvensen är. En del drag är samma för alla promotorer medans andra beror på vilken faktor som
är bundet till RNA polymeraset. Ett tydligt mönster för bakteriella promotorer är att det innehåller
en lägre halt av nukleotiderna G och C i förhållande till det genomiska medelvärdet. Istället är
nukleotiderna A och T mer frekventa som har en lägre stabilitet och smälttemperatur [25]. Detta
uppkommer p.g.a. DNA är dubbelsträngat och består utav två komplementära enkelsträngade
molekyler som sammanfogas genom vätebindningar och måste separeras för att RNA polymeraset
ska kunna inleda transkription där en utav strängarna används som mall. Det finns också två viktiga
regioner positionerade ca -10 och -35 nt uppströms relativt till transkriptionsstart och kan
identifieras av faktorn som binder RNA polymeraset dit. Utan faktorn bundet besitter
fortfarande RNA polymeraset den katalytiska förmågan men kan inte identifiera promotorn [12]. De
två -10 och -35 elementen identifierar också själva promotorn och finns i alla bakterier. De består av
karakteristiska sekvenser som faktorerna känner igen och är specifika beroende på vilken
faktor som är bundet till RNA polymeraset. Sekvenserna skiljer sig också mellan bakterier där en
ideél karakteristisk sekvensen i en bakterie inte är det i en annan.
En av de mest förekommande bakteriella faktorerna är de som tillhör  – familjen och de flesta
gener transkriberas med dem , 8]. Andra faktorer förekommer också och uttrycker specifika
gener under normala eller mer stressrelaterade förhållanden. Konsensus-sekvenserna består av sex
nukleotider var och är för faktorn TATAAT vid -10 regionen och TTGACA vid -35 regionen för
Escherichia coli (Figur 2). Det är väldigt sällan konsensus sekvenserna är helt konserverade i en
promotor utan en kvot på 8/12 matchande nukleotider förekommer för en typisk promotor men är
sällan lägre än en kvot på 6/12 [8, 9]. Det har även visat sig att regionerna är olika viktiga för
promotoraktiviteten där -10 regionen har en större betydelse eftersom den oftare är mer konserverad
än -35 regionen och därför kan kompensera för en mindre välbevarad sådan. De olika nukleotiderna
i konsensus-sekvensen har också olika stor betydelse för promotoraktiviteten och man har visat att
vissa av dem förekommer oftare än andra på specifika positioner inom elementen, speciellt när de är
mindre konserverade [9, 24]. I -10 hexameren är nukleotiderna -7T, -11A och ibland -12T mest
konserverade, vilket indikerar att de har en större betydelse än resterande nukleotiderna i -10
sekvensen. Positionerna inom – 10 elementet numreras från nukleotiden närmast TSS som -7 till
-12 som är nukleotiden längst ifrån TSS enligt: -12T-11A-10T-9A-8A-7T-----TSS. I de initiala
stegen för initiering av transkription och därmed separation av de dubbelbundna DNA strängarna
flippas baserna -11 A och -7T ut ur stackning konformationen i DNA-helixen och associerar med
RNA polymeraset som bär på specifika fickor för dessa två baser [24]. Undersökningar om hur
smältningskinetiken beror av förändringar i -10 sekvenserna visar att A vid -11 och T vid -7
positionen har betydelse för snabb smältning av promotorn. Det är -11A som främst är viktig för
snabb smältning medans -7T som är den mest konserverade nukleotiden är viktig för initiering av
transkriptionsprocessen i sig själv [24]. -10 elementet kan ibland förekomma som en förlängd
version ”extended -10 region” på promotorer, oftast då -10 och -35 regionerna är mindre
24
välbevarade eller då de inte finns något -35 element alls [9, 12]. Regionen som utgör ”extended”
delen utav -10 elementet är att det en nukleotid uppströms hexameren sitter ett TG baspar.
Konsensus-sekvensen lyder då TGNTATAAT där N är någon nukleotid A,T,C, eller G (Figur 2). En
mutation på TG determinanten sänker i dessa avseenden aktiviteten drastiskt och därför andningen
till att den anses kompensera för mindre välbevarade -10 och -35 element. Positionen mellan -10
och -35 regionerna och mellan -10 regionen och transkriptionsstart har också påvisats ha betydelse
för promotoraktiviteten. Ett vanligt förekommande avstånd på 16-18 nukleotider mellan -10 och -35
regionen där 17 nukleotider är oftast förekommande och därmed anses vara det mest optimala
avståndet [12, 24] (Figur 2). Mellan transkriptionsstart och -10 regionen varierar avståndet oftast
mellan 2-11 nt [7] (Figur 2) där 7 nt är mest förekommande och har visats vara optimal för
promotoraktiviteten. Promotorsekvensen uppströms -35 elementet som sträcker sig mellan ca -40
till -60 kallas ”Upstream Element” (UP-Element) som ytterligare ökar promotoraktiviteten [12].
Den består främst av A och T nukleotider och innehåller två säten som kan identifieras av ett RNA
polymeraset. Sätena har ingen specifik sekvens utan en preferens för en ökad mängd A och T vid
dessa områden är en viktig egenskap för identifiering [13].
Figur 2. Visar den typiska arkitekturen för en bakteriell promotor och konsensus-sekvenserna för faktorn hos E.coli [19].
25
Möjliga promotorer för cld-genen i I. dechloratans och FNR-reglering
I. dechloratans är en mikroorganism som tillhör kloratreducerande bakterier, den har gener för Clr
och Cld och kan därmed utöva klorat metabolism (Figur 3). I den här bakterien har man studerat
regleringen av dessa gener där man genom att mäta mRNA-nivåer har funnit att transkriptionen är
högre under anaeroba odlingsförhållanden jämfört med aeroba odlingsförhållanden [4, 11]. Under
fortsatta studier på hur genregleringen utav cld fungerar har sekvensen uppströms genen undersökts
för en möjlig promotorregion och möjliga inbindningssäten för transkriptionsfaktorer. Utav detta
har man identifierat ett transkriptionsstart för cld lokaliserat 85 nukleotider uppströms den första
nukleotiden i translation initieringskodonet [21] och även möjliga -10 och -35 element (Figur 3)
[15]. Sekvenserna antogs utgöra dessa element efter att man observerat en stor och minskning och
ibland total avskaffande utav uttrycket av cld när mutationer eller avkapning av elementen gjorts.
Dessa sekvenser skiljer sig mycket från konsensus-sekvensen i E. coli då bara 1 av 6 respektive 4 av
6 nukleotider överensstämmer med den. Det medför en osäkerhet i huruvida detta verkligen är en
promotor [15]. Ett möjligt bindningssäte tillhörande proteinet (fumarate and nitrate reduction
regulatory protein) FNR har också identifierats [20] och är centrerat 19,5 nt uppströms
transkriptionsstart och kan tydligt observeras överlappa med – 10 elementet (Figur 3).
Figur 3. Visar var en möjlig promotor skulle kunna vara belägen för cld i I. dechloratans. De lätt understrukna
nukleotiderna i -10 och -35 elementen stämmer överens med konsensus-sekvenserna i E.coli. Den grövre understrukna
sekvensen är ett möjligt FNR-säte position [15]. Ett insertionselement ISIde1, genen för kloratreduktas (clrA-D) och
cld-genen visas i pilarna, där pilarnas riktning visar organiseringen av sekvenserna och transkriptionsrikitningen för
clrA-D och cld.
FNR är ett av de vanligaste förekommande regleringsproteinen som kontrollerar övergången mellan
aerob och anaerob metabolism hos bakterier via reglering på transkriptionsnivå [6, 14, 23].
Proteinet finns i cellens cytoplasma och fungerar som en O2 sensor. Då syre finns tillgängligt
inaktiveras proteinet och i frånvaro utav syre aktiveras det. Ett E.coli FNR i aktiv form har ett [4Fe–
4S]2+ kluster per monomer som sitter bundet till fyra cystein [23]. Det förmedlar nödvändig
konformationsförändring som tillåter dimerisering av monomererna. Den formen av proteinet har
förmågan att sekvensspecifikt binda in till DNA och därmed reglera uttrycket [6, 14, 23]. Det är
också klusteret som är känsligt för O2 och under aeroba förhållanden konverteras det till ett [2Fe–
2S]2+ kluster vilket medför att dimererna separeras till enskilda monomerer och därmed proteinets
inte längre kan binda in till DNA sekvensen och reglera uttrycket [23].
26
Konsensus-sekvensen för ett E.coli FNR är TTGATNNNNATCAA och det möjliga FNR-sätet som
identifierats uppströms cld-genen i I. dechloratans stämmer överens till 9 av 10 nukleotider ett
sådant. Precis som för promotorregionerna -10 och -35 behöver inte FNR sekvensen vara identisk
till konsensus-sekvensen för ett FNR-säte ett FNR komplex ska kunna identifiera det och binda in
dit. Det finns också vissa baser som är mer eller mindre konserverade och som anses vara mer
viktiga för identifiering av sätet (Figur 4).
Figur 4. Visar en positionsmatris av de förekommande baserna i FNR-sätet hos E.coli där höjden av baserna visar
konservationsgraden vid respektive position, dvs de mest frekventa nukleotiderna som allmänt observeras på dessa positioner.
Informationen kommer ifrån artikel [6].
Vart det är lokaliserat någonstans på promotorn bestämmer om FNR har en positiv eller negativ
inverkan på transkription. I de fall där FNR har en undertryckande roll på transkription kan sätet
vara placerat från -35 regionen till transkriptionsstart. För en aktiverande roll i en promotor är
centrum för FNR-sätet 41,5 nukleotider uppströms transkriptionsstart och överlappar med någon
nukleotid -35 regionen, dessa promotorer är kända som klass II promotorer [6, 14]. En centrering på
60,5, 71,5, 72,5, 74,5, 82,5 eller 92,5 nt från transkriptionsstart förekommer för klass I promotorer,
de är betydligt mer sällsynta [6, 15]. Ett inbundet FNR komplex med en aktiverande roll tar binder
till RNA polymeraset när de båda bundit till DNA:t. Det förstärker bindningen mellan RNA
polymeraset och promotorn vilket leder till att transkriptionen av den specifika genen ökar. Tidigare
resultat där man arbetat med ett 200 bp långt fragment innehållande den möjliga promotor regionen
och muterat det möjliga FNR-sätet visar det att både basal uttrycket av cld under aeroba
förhållanden såsom det anaeroba nästan totalt slås ut [15]. När man i ett annat försök istället
bevarade det möjliga FNR-sätet men placerade 200 bp fragmentet i en bakteriestam, RM 101 som
saknar förmågan att producera FNR visade mätningarna ändå ett basalt uttryck [15]. Detta gav
upphov till en hypotes som tillsammans med FNR-sätets position i förhållande till det tidigare
bestämda TSS som vanligtvis associeras med en undertryckande roll av gener, bör finnas en FNRberoende promotor längre nedströms som står för den anaeroba induktionen. För att undersöka
hypotesen utförde jag i det här arbetet gjorde en teoretisk analys av sekvensen uppströms cld i
förhållande till FNR pallindromet med ovanstående kunskap som verktyg. Det resulterade i att ett
nytt transkriptionsstart och nya -10 och -35 element längre lokaliserades (Figur 5). Analysen gjordes
genom att räkna 41.5 nt nedströms ifrån FNR-sätet centrum där typ II promotorer har sitt
transkirptionsstart. Ett A lokaliserades på den positionen. Därifrån stegades det sju nukleotider
uppströms som gav upphov till ett möjligt -10 element som också innehöll determinanten TG en
27
nukleotid uppströms -10 hexameren vilket tillsammans formar ett möjligt ”extended – 10 element”.
Genom att till sist mäta vandra ett avstånd på sjutton nukleotider uppströms den första nukleotiden
-10 hexameren identifierades ett möjligt – 35 element, överlappande med FNR-sätet, precis som
konstaterats för en aktiverande roll av FNR.
Figur 5. Visar en hur den möjliga FNR-beroende promotorn för cld i I. dechloratans ser ut. Sekvensen antogs vara en klass II
promotor som allmänt har TSS 41,5 nukleotider nedströms mitten av FNR-sätet. Det optimala avståndet på sju nukleotider uppströms
TSS gav ett möjligt extended -10 element markerat I fet stil med understrukna nukleotider som överensstämmer med E.coli
konsensus-sekvens TATAAT. -35 elementet bestämdes sjutton nukleotider uppströms första nukleotiden i -10 hexameren, elementet
är markerat med fet stil och överensstämmande nukleotider understrukna.
28
Metodiker
Genom att använda en sekvensamplifieringsteknik kunde den möjliga promotor regionen till cld
ifrån I. dechloratans DNA isoleras och amplifieras, tekniken kallas Polymerase Chain Reaction
eller PCR. Metoden kräver att man känner till sekvensen som ska amplifieras för att kunna
syntetisera två primrar som är komplementära till en del av ett område som sträcker sig över den
önskade sekvensen som ska amplifieras. Komponenterna som ingår i reaktion är primrar, polymeras
enzym, nukleotider, MgCl och templat DNA. Processen sammanfattas i tre olika steg, denaturering,
annealing och extension. Dessa steg utförs flera gånger och under specifika temperaturer. Under
denatueringssteget höjs temperaturen till 90 °C som separerar DNA strängarna ifrån varandra som
gör sekvensen som önskas amplifieras tillgänglig. I annealingssteget sänks temperatuern till mellan
50-60 °C som medför att hybridisering av de två primrarna till det komplementära området i DNA:t
som sträcker sig över målsekvensen. Därefter i extensionsteget höjs temepraturen till 74°C som
tillåter polymeraset att vid optimal hastighet amplifiera den önskade sekvensen. Eftersom processen
upprepas många gånger amplifieras sekvensen till ett stort antal kopior. Temperatur, tid och antal
cykler för processerna skiljer sig från system till system.
För att mäta om fragmenten av den möjliga FNR-beroende promotorn kunde ge upphov till
transkription och därmed uttryck hade de ligerats in framför en promotorlös gen som kodar för
enzymet galaktosidas i plasmiderna pBBR1MCS-4-LacZ och pBBR1MCS-2-LacZ. Det görs
genom att klyva upp plasmiden som är en cirkulär DNA sekvens så att den blir linjär och efter det
sammanfoga den amplifierade promotorsekvensen med den linjära plasmiden och återförsluta igen.
Restriktionsenzymer används då som identifierar en specifik DNA sekvens som benämns ett
restriktionssäte bestående av ett par nukleotider och klyver av DNA:t där. Plasmiden är konstruerad
att innehålla ett flertal sådana sekvenser för olika restriktionsenzymer. Genom att vid
primerdesignen addera restriktionssäten på primrarna som också finns i plasmiden får produkterna
från amplifieringen av promotorsekvensen dessa restriktionssäten som gör det möjligt att klyva
plasmid och promtorsekvens med samma restriktionsenzym. Det medför att plasmiden och
promotorsekvensen får komplementära ändar och kan binda till varandra via vätebindningar.
Eftersom enkelsträngarna i en DNA molekyl sitter ihop kovalent med fosfodiesterbindningar måste
ett DNA-ligas enzym också tillsättas att slutföra sammanfogningen. Detta steget kallas ligering och
innebär att ligaset syntetiserar nya fofsofdiesterbindningar. Under ligeringen i det här fallet
återförsluts DNA:t i cirkulär form, nu innehållande den möjliga promotorsekvensen framför
galaktosidas-genen.
Därefter är det dags att transformera celler med plasmiden innehållande den möjliga
promotorsekvensen. Transformering är en metod som tillåter introduktion av en DNA molekyl in i
en cell. Två metoder användes i det här arbetet för att introducera plasmider med inligerade
fragment av den möjliga FNR-beroende promotorn i celler. Den ena metoden var att arbeta med
superkompetenta celler, något som beställs ifrån ett företag och transformeras väldigt lätt genom att
följa ett protokoll. Den andra metoden var mer traditionell och kallas elektroporereing. Det är en
teknik där cellerna först genomgår ett antal tvättar som gör dem elektrokompetenta och därefter
utsätts dem för en kort elektrisk puls. Teorin bakom pulsningen hävdar att porer bildas i
cellmembranet som tillåter transport av DNA in i cellen. Processen består utav uppodling av celler
som sedan tvättas i en mängd centrifugeringsprocessen för att avlägsna salter som annars kan leda
till kortslutning under pulsningen. Cellerna blandas i nästa steg med en godtycklig mängd DNA och
pulsas vilket leder till upptag av DNA ifrån omgivningen. Parameterarna som ställs in under
pulsningen är fältstyrka, motstånd och kapacitans, som beror olika faktorer som t. ex. vilken typ av
celler man arbetar med.
29
Cellerna innehållande plasmiden med inligerad promotorregion odlas upp under aeroba och
anaeroba förhållanden. Odlingen görs i ett lämpligt odlingsmedium med ett antibiotika som en
selektivitetskontroll för att säkerställa att cellerna innehöll plasmiden eftersom den medför någon
typ av antibiotikaresistens till bakterien. De skördas sedan under exponentiell fas och sedan tillsätts
toluen som permeabiliserar cellerna och därefter ett substrat som - galaktosidas konverterar till en
mätbar produkt. Naturligt hydrolyserar - galaktosidas galaktosider till monosakarider men
används också för biokemiska mätningar. Substratet är o-nitrophenyl--D-galactoside (ONPG),
som diffunderar in i cellen via proerna som bildats och katalyseras i närvaro av - galaktosidas.
Substratet är ifrån början är färglöst men bildar en färgad produkt. Produkterna som bildas är
galaktos, och den färgade produkten o-nitrophenol som är gul [22]. Mängden o-nitrophenol som
bildas mätas via absorbans vid 420 nm och är, om ONPG är tillsatt i överflöd proportionell mot
mängden galaktosidas och reaktionstiden för hydrolyseringsreaktionen [22]. galaktosidas
aktiviteten beräknas med formeln:
Beta−galaktosidas aktivitet=1000 x
OD 420−1,75 OD550
t v OD 600
Där t är reaktionstiden i [min], v är volymen cellkultur [ml], OD600 är ett mått på celldensiteten
innan assayen, OD420 absorbansen vid 420 nm av o-nitrophenol [-], 1,75 OD550 en korrektionsfaktor
för ljusspridningen ifrån cellskräp vid 550 nm [-].
30
Uppnådda resultat
Efter försöken med 189 bp och 172 bp fragmentet under aerob och anaeroba förhållanden i XL1BLUE visade resultaten att 189 bp fragmentet, innehållande den möjliga – 10 regionen gav ett
uttryck aerobt och ett större inducerat uttryck anaerobt. Den anaerob induktionen för 189 bp
fragmentet bestämdes till 3,3 ggr basaluttrycket. Fragmentet med 172 bp sekvensen där möjliga -10
regionen avlägsnat gav under båda förhållanden ett uttryck nära noll och därmed inte heller någon
induktion. Det jämfördes också mot uttrycket förmedlat av bakgrundsplasmiden under samma
förhållanden där resultatet visade att det inte var någon skillnad mellan uttrycken. Dessa försök
upprepades i RM 101 som påvisade samma sak för 189 bp fragmentet och att I. dechloratans FNR
var kapabel till att inducera uttrycket under anaeroba förhållanden. Induktionen bestämdes till 2,8
ggr balsaluttrycket. Förutom det påvisades det också att celler med I. dechloratans FNR överlever
under anaeroba förhållanden med NaNO3 respiration.
Viktigaste slutsatserna
Efter att jag utgått ifrån hypotesen om att cld-genen regleras utav en FNR-beroende klass II
promotor identifierades ett möjligt – 10 element. Resultaten visade att elementet behövdes för en
anaerob uppreglering vilket stärker hypotesen. När elementet avlägsnades minskade uttrycken både
under aeroba och anaeroba förhållanden till noll. Slutsatsen blev att transkription utav cld med stor
sannolikhet startar ifrån samma promotor, som både utgör uttryck vid aeroba och anaeroba
förhållanden. Den tidigare hypotesen om två skilda promotorer, en som står för basaluttrycket under
aeroba förhållanden och en FNR-beroende som står för ett inducerat uttryck under anaeroba
förhållanden förkastas. Den andra viktiga slutsatsen är att I. dechloratans kodar för ett FNR-protein
med förmågan att inducera uttrycket av cld under anaeroba förhållanden. Det har också förmågan
att ersätta ett E.coli FNR under anaeroba förhållanden med NaNO3 respiration.
31
Material och metoder
Bakteriestammar, plasmider och odlingsförhållanden
Bakteriearten som användes var E.coli och stammarna var XL1-BLUE och RM 101. Skillnaden
mellan stammarna är att bland annat RM 101 saknar en FNR-gen som uttrycker ett funktionellt
FNR-protein. Ursprungsplasmiderna var pBBR1-MCS4-LacZ [31], pBBR1-MCS2-LacZ [31],
pBR322 [15]. De användes som reportervektorer för 189 bp och 172 bp fragmenten som ligerades
in strax uppströms den promotorlösa lacZ genen under restriktionssätena PstI och SalI i pBBR1MCS4-LacZ och EcoRI och SalI i pBBR1-MCS2-LacZ. Där genen lacZ uttrycker b-galaktosidas. I
tidigare arbeten hade en variant av plasmiden pBR322 konstruerats där FNR-genen ifrån I.
dechloratans ligerats in då betecknad pBR322_IdFNR[15]. Över natt (Ö.N) kulturer sattes upp
med enstaka kolonier ifrån dessa stammar som växt på LB plattor och sedan först över till Luria
Bertani Broth (LB) medium (10 g tryptone, 5 g NaCl och 10 g jästextrakt per liter avjoniserat
vatten, pH 7) med lämpligt eller antibiotika (100 µg/ml ampicillin och 50 µg/ml kanamycin) och
odlats aerobt vid 37 ᵒC 16 tim. En del av kulturerna fördes sedan till nytt LB medium med samma
antibiotika och odlades aerobt med syre som enda elektronacceptor och anaerobt med natriumnitrat
(40mM) som enda elektronacceptor. Aeroba kulturer odlades i partiellt fyllda 500 ml Erlenmeyer
flaskor med skumkorkar och anaeroba kulturer i helt fyllda 50 ml flaskor med gummikorkar, båda
under 37 ᵒC, 200rpm. De aeroba kulturerna odlades 2 h-2 h 40 min och anaeroba i 5 h. Cellerna
skördades under exponentiell fas dvs under aeroba förhållanden vid OD600 = 0,45-0,7 och för
anaeroba förhållanden vid OD600 = 0,35-0,4. Där OD mäter ljusförlusten i form av en skenbar
absorbans på celler som belyses vid 600 nm, eftersom celler inte absorberar ljus utan skingrar det
när de belyses, och har ingen enhet.
Analys av promotorsekvens
Sekvensen uppströms cld analyserade efter möjliga promotorregioner med online tjänsterna
”Softberry” BPROM Prediction of bacterial promoters [26], ”Fruitfly” Neural Network Promoter
Prediction [27] och ”CBS” Promotor 2.0 Prediction Server [28]. En teoretisk analys ifrån FNRboxen som utgångsläge gjordes med antagande att det fanns en FNR-beroende klass II promotor
nedströms boxen.
Plasmidpreparation
Celler innehållande pBBR1-MCS4-LacZ eller pBBR1-MCS2-LacZ ifrån E.coli stammen XL-1
BLUE odlades upp på varsin agar platta, innehållande 100µg/ml ampicillin respektive 50 µg/ml
kanamycin över natten i 37 °C. En koloni ifrån varje platta fick växa i 50 ml Ö.N kultur där hela
mängden sedan användes för plasmidpreparationen med kittet NucleoBond® Xtra Midi Plus,
Nucleic Acid and Protein Purification,( Macherey-Nagel). Preparationen utfördes enligt
tillverkarens rekommendationer med en elueringsvolym på 5 ml följt av en isopropanolfällning.
Därefter bestämdes renhet och koncentration genom att mäta absorbansen för provet vid 260 nm
och 280 nm med Infinite® 200 PRO NanoQuant.
32
Klyvning av plasmid
Av pBBR1-MCS4-LacZ klövs 1 µg med restriktionsenzymerna PstI (10U/µL) och SalI (10U/µL)
(Fermentas Life Sciences) och av pBBR1-MCS2-LacZ klövs 6 µg med EcoRI (5U/µL) och SalI
(5U/µL) (Fermentas Life Sciences). Processen utfördes i en 10 x BUFFER O (Thermo Scientific)
enligt tillverkarens rekommendationer med en reaktionsvolym på 30 µL. Under reaktionen
inkuberades provet i 37 °C under 60 min. För att ta reda på om klyvningen var lyckad blandades en
del av provet med DNA Loading Dye (6x) solution (Thermo Scientific) och sterilt vatten och fördes
över till en en 0,8 % TAE x 1 gel och vandra under 75 V i 90 min. Som referens fördes också
okluven plasmid och en referensstege Lambda DNA/PstI Marker, 24 (Thermo Scientific) över på
gelen för att verifiera om det var någon skillnad i vandringslängd mellan okluvet och kluvet DNA
och om bandet storleksmässigt låg runt 8000 bp vid jämförelse med referensstegen. Gelen färgades
efteråt in med etidiumbromid (10mg/ml) och en bild togs med ImageQuant 400. Därefter kördes
den resterande mängden av proven ut på en likadan gel under samma villkor. De kluvna
plasmiderna skars ut ur gelen och renades med QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN), enligt
tillverkarens rekommendationer.
33
PCR: Tillverkning av insert
För att kunna tillverka fragmenten designades primrar se (tabell II). För beräkning av deras
smälttemperatur användes onlinetjensten ”BioPHP PHP for bioinformatics” [29] och för
möjligheten att bilda sekundärstrukturerna, homodimer, heterodimer och hårnål användes
OlgioAnalyser 3.1 (Integrated DNA Technologies®) [30]. Till uppströms- och nedströmsprimrarna
adderades säten för restriktionsenzymer Pst I respektive SalI.
PCR reaktionerna gjordes med KAPA2G Robust HotStart ReadyMix, (KAPABIOSYSTEMS) och
utfördes enligt tillverkarens rekommendationer. Ungefär 20 ng av pBBR1MCS-4-lacZ_cldprom
innehållande 200 bp av sekvensen uppströms cld från I. dechloratans användes som templat i vissa
av reaktionerna och 10 ng genomiskt I. dechloratans DNA i resten, provens totalvolym blev 25 µL.
Hälften av proverna gjordes med nedströms primer_172 och resten med nedströms primer_189 för
att ge respektive produkter (Tabell II och Figur 6 och 7). Två negativa kontroller gjordes för att
verifiera att det ingen av komponenterna var kontaminerad. De innehöll alla komponenter utom
templat DNA. Kontrollerna skiljde sig i att den ena innehöll nedströms primer_189 och den andra
kontrollen nedströms primer_172. Programmet som kördes under reaktionen visas i tabell I.
Tabell I: Programmet för PCR amplifiering av 172 bp och 189 bp fragmentet. De tre stegen denaturation, annaealing och extension
utfördes med 35 cykler.
Steg
Temperatur [°C]
Tid [s]
Initial denaturation
95
180
Denaturation
95
15
Annealing
60
15
Extension
72
15
Final Extension
72
60
Efter PCR reaktionerna fördes proverna över på en 3 % TBE x 1 agaros gel och separerades under
75 V i 45 min för att kontrollera om produkterna hade rätt storlek. Därefter renades återstoden med
GeneJet™ PCR Purification Kit (Fermentas) enligt tillverkarens protokoll och med en eluerings
volym på 50 µL.
34
Klyvning av fragment
Klyvningarna av restriktionsenzymssätena i ändarna av 189 bp och 172 bp fragmenten utfördes
med totalvolymer på 30 µL för proven under det första klyvningstillfället och 60 µL under det
andra. Under första klyvningen klövs 2.2 µg av 172 bp PCR produkt och 1.85 µg 189 bp PCR
produkt och under det andra tillfället var klövs 1.3 µg 172 bp PCR produkt och 1.5 µg 189 bp
produkt. Processen utfördes i en 10 x BUFFER O (Thermo Scientific) med enzymerna PstI och
SalI enligt tillverkarens rekommendationer. Under reaktionen inkuberades proverna under 60 min i
37 °C. Proverna renades sedan med GeneJet™ PCR Purification Kit från Fermentas enligt
tillverkarens protokoll med elueringsvolymer på 50 µL. Kvantifiering av renade produkter med
absorbansmätning vid 260 nm och 280 nm gjordes med Infinite® 200 PRO NanoQuant.
Ligering
Ligeringarna utfördes med kluven plasmid. Fragmenten tillsattes i ett 3:1 molärt förhållande där 3.5
ng av 189 bp fragmentet tillsattes till 50 ng utav plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ i ett prov och 3.2
ng 172 bp fragmentet till ett annat prov med lika stor mängd utav samma plasmid. Under den andra
ligeringen tillsattes 3.8 ng av 189 bp fragmentet till 55 ng utav pBBR1-MCS2-LacZ i ett prov och
3.5 ng av 172 bp fragmentet i ett annat med lika stor mängd av samma plasmid. Reaktionen
utfördes med 10 x T4 DNA Ligase buffer och T4 DNA Ligase (Thermo Scientific) enligt
tillverkarens rekommendationer i en totalvolymen på 25 µL. Under ligeringsprocessen inkuberades
proven i rumstemperatur i 10 min. Ligaset inaktiverades sedan under 10 min i 65°C.
Transformering
Transformeringen gjordes med superkompetenta XL1-BLUE celler (Stratagene) och utfördes enligt
tillverkarens rekommendationer. Proven som användes för transformering var tre st, ett för 189 bp
fragmentet, ett för 172 bp fragmentet och en kontroll. Värdplasmiden som fragmenten var
inligerade i var pBBR1-MCS4-LacZ, kontrollen innehöll en annan plasmid, pUC18 utan insert.
Efter att transformanterna strukits ut på LB plattor med 100 µg/ml ampicillin odlades de övernatten
i 37 °C. Nästa dag valdes sex kolonier från vardera platta och ströks ut på nya plattor som fick odlas
likadant. Därefter sattes två Ö.N. kulturer av transformanter med 189 bp och 172 bp fragment inför
verifiering.
Verifiering av kolonierna med 189 bp och 172 bp transformanter
En koloni från vardera transformation med plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ och pBBR1-MCS2LacZ valdes ut för plasmidpreparation, som ovan, och skickades sedan till Eurofin Genomics för
sekvensering.
35
- galaktosidas Assay
XL1-BLUE celler med 189 bp, 172 bp fragmenten eller endast pBBR1-MCS4-LacZ odlades upp
aerobt i 500 ml flaskor med skumkorkar i 25 ml LB medium och 100 µg/ml ampicillin. Anaeroba
kulturer odlades upp i 50 ml flaskor med gummikorkar, helt fyllda med ca 60 ml LB medium och
med 100 µg/ml ampicillin och 40 mM NaNO3. Fyra olika stammar av RM 101 celler odlades. De
innehöll två plasmider: pBBR1MCS-2-LacZ med antingen 189 eller 172 bp fragmentet samt
pBR322 utan insert eller med en FNR-gen från I. dechloratans (pBR322_IdFNR). Antibiotikum
halten var 100 µg/ml ampicillin och 50 µg/ml kanamycin. Dessutom användes två kontrollstammar
av RM101, en med de båda plasmiderna ovan utan insert och en med pBBR1MCS2-LacZ utan
insert och pBR322 med FNR-genen från I. dechloratans. Kulturerna sattes på skak 225-250 rpm i
37 °C och skördades i exponentiell fas. Mätningarna gjordes i triplikat och utfördes enligt Millers
protokoll [22]. Till mätningarna på 189 bp och 172 bp fragmenten användes 0,5 ml celler, och för
mätning på bakgrundsplasmiden pBBR1-MCS4-LacZ respektive bakgrundsplasmiderna pBR322
och pBBR1-MCS2-LacZ användes 0,6 ml celler.
Elektrokompetenta celler
RM 101 celler gjordes elektrokompetenta inför transformering med elektroporering. Kulturer av
celler med plasmiden pBR322 och pBR322_IdFNR odlades på skak 225-250 RPM och 37 °C i 16
tim. Nästa dag odlas en mängd av dessa upp i 250 ml LB + 100 µg/ml ampicillin och skördades vid
exponentiell tillväxtfas. Cellerna sattes på is i 15 min och centrifugerades sedan under 10 min i 4
°C, 4500 rpm i rotor SLA-3000 (Sorvall™). Supernatanten dekanterades av och cellerna tvättades
med 500 ml iskallt vatten och centrifugerades igen likadant. Vattnet dekanterades av och cellerna
löstes i 8 ml 10 % glycerol och centrifugerades likadant. Glycerolen hälldes av och cellerna löstes i
den återstående glycerolen på botten och fördes över i 50 µl portioner till eppendorfrör.
Elektroporering
Transformeringen av RM 101 gjordes med Gene Pulser II® (Bio-Rad). 1 µL plasmid pBBR1MCS2-LacZ DNA innehållande 341 ng 189 bp respektive 287 ng 172 bp fragmentet blandades ned
i 50 µL elektrokopmetenta celler. Lösningen tillsattes sedan i en kyvett (Biorad) med ett avstånd på
0.2 cm mellan elektroderna och sattes in i elektroporeringsapparaten. Därefter ställdes parametrarna
in enligt: spänning 2.5 kV; resistans 200 Ohm och kapacitans 25µF. Direkt efter pulsen tillsattes 1
ml uppvärmt (42 °C) SOC-medium till kyvetten och provet överfördes sedan till ett 15 ml Falkonrör
som inkuberades i 37 °C på skak 225-250 RPM under 60 min. Efteråt ströks cellerna ut på LB
plattor innehållande 100µg/ml ampicillin och 50 µg/ml kanamycin som inkuberades i 37 °C.
36
Resultat: Del I
Analys av promotorsekvens
Hypotoesen om att FNR-boxen tillhörde en FNR-beroende promotor av klass I eller II testades
genom att undersöka sekvenser ca 40, 60 och 70 nt nedströms boxen. Sekvensen uppströms cld
analyserades med onlinetjänsterna ”Softberry” BPROM Prediction of bacterial promoters,
”Fruitfly” Neural Network Promoter Prediction och ”CBS” Promotor 2.0 Prediction Server. Ingen
av tjänsterna gav något utslag till en möjlig promotor inom sekvensen. Den analyserades då
manuellt där den sekvensen som hade mest likhet med en s70 promotor i E.coli hittades på position
som stämmer med en FNR-beroende promotor av klass II. Den sekvensen utgjorde ett
transkriptionsstart lokaliserat 41,5 nukleotider nedströms mitten- nukleotiden i FNR-sätet,
7 nt uppströms TSS hittades en möjlig ”extended - 10 region” TG-GAAGAT och 17 nt uppströms
hexameren i -10 regionen en möjlig -35 region AACACA (Figur 6 och 7). Regionerna – 10 och -35
som identifierades stämmer överens med fem av nukleotiderna för ett ”extended – 10” område, TGTATAAT och tre av nukleotderna för ett -35 element, TTGACA i E.coli.
37
Primers
Primrarna som användes för att åstadkomma de önskade fragmenten var uppströms primer,
nedströms primer _172 och nedströms primer_189. Uppströms primern användes i alla PCR
reaktionerna för syntetisering av både 189 bp och 172 fragmenten och hade ett klyvningssäte för
PstI. Båda nedströms primrarna hade klyvningssäten för SalI, där nedströms primer_172
tillsammans med uppströms primern användes för syntetisering av 172 bp fragmentet och likadant
med nedströms primer_189 för 189 bp fragmentet. Nedströms primer_172 var konstruerad att binda
in en nukleotid uppströms det möjliga extended -10 elementet och ge det kortare 172 bp fragment
som då inte innehåller -10 sekvensen. Nedströms primer_189 konstruerades för att binda in vid
transkriptionsstart och överlappa det möjliga -10 elementet för få med hela den möjliga promotorn
och ge det längre 189 bp fragmentet. I tabell II visas primrarnas sekvens och förväntad
produktlängd för primerkombintationerna. Figurerna 6 och 7 visar vart primrarna binder in till den
möjliga promotorn och vart sekvenserna -10, -35, ISIde1 och FNR är lokaliserade i förhållande till
TSS.
Tabell II. Visar primrarnas sekvens och produktlängden varje kombination förväntas ge. Den delen med grå bakgrund är
komplementär sekvens till den möjliga promotorn, fet stil är restriktionssäten och sekvens med G och C för
restriktionssätena är GC-klampar.
Primerkombinationer
Primersekvens
Produkt
längd
5' GGGC CTGCAG GCGAGGTCGGCGTCAGT '3
Uppströms primer
Nedströms primer_172 5' GGCGC GTCGAC TTTCTCCTTTTTTATGTGTTTGATT
172 bp
5' GGGC CTGCAG GCGAGGTCGGCGTCAGT '3
Uppströms primer
Nedströms primer_189 5' GCGC GTCGAC TGCACGAATCTTCGCATTTCTCCT 3'
189 bp
3'
38
5'GCGAGGTCGGCGTCAGTGTCGGGCGGTTGTACCACCGAGGGTCATGTTTGTTGAG
AAGTCAATTTCCACTGGAAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAG
AAACTCTTGACTTAAATCAAACACATAAAAAAGGAGAAATGCGAAGATTCG
TGCACTTTCCGCTTGCTCGGCGACCAAGCCGCCCAGCGGATTCCGATTCTTAACAC
TGGAGTACATCATG'3
Figur 6. Visar en hur den möjliga FNR-beroende promotorn uppströms cld i I. dechloratans ser ut. Sekvensen antogs vara en klass II
promotor som allmänt har TSS (vitt A i svart bakgrund) 41,5 nukleotider nedströms mitten av FNR-sätet (understruken sekvens). Det
optimala avståndet på 7 nt uppströms TSS gav ett möjligt extended -10 element i större teckenstorlek markerat med sträck ovanför
sekvensen. -35 elementet (större teckenstorlek) bestämdes 17 nt uppströms första nukleotiden i -10 hexameren. De nukleotiderna i
vitt med svart ytterlinje i -10 och -35 hexameren stämmer överens med konsensus-sekvensen för E.coli. Sekvens med grå
bakgrund är bindningsekvens för uppströms primer och nedströms primer_172. I fet stil markeras den möjliga promotor regionen
uppströms cld. Den resterande omodifierade sekvensen t.o.m 5'-änden tillhör ISIde1 elementet. Kursiverat ATG är startkodonen för
cld-genen.
5'GCGAGGTCGGCGTCAGTGTCGGGCGGTTGTACCACCGAGGGTCATGTTTGTTGAG
AAGTCAATTTCCACTGGAAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAG
AAACTCTTGACTTAAATCAAACACATAAAAAAGGAGAAA(TGCGAAGAT)
TCGTGCACTTTCCGCTTGCTCGGCGACCAAGCCGCCCAGCGGATTCCGATTCTTAA
CACTGGAGTACATCATG'3
Figur 7. Visar en hur den möjliga FNR-beroende promotorn uppströms cld i I. dechloratans ser ut. Sekvensen antogs vara en typ II
promotor som allmänt har TSS (kursiverat vitt A i grå bakgrund) 41,5 nukleotider nedströms mitten av FNR-sätet (understruken
sekvens). Det optimala avståndet på 7 nt uppströms TSS gav ett möjligt extended -10 element i större teckenstorlek markerat med
parenteser. -35 elementet (större teckenstorlek) bestämdes 17 nt uppströms första nukleotiden i -10 hexameren. De nukleotiderna i
vitt med svart ytterlinje i -10 och -35 hexameren stämmer överens med konsensus-sekvensen för E.coli. Sekvens med grå bakgrund
är bindningsekvens för uppströms primer och nedströms primer_189. I fet stil markeras den möjliga promotor regionen uppströms
cld. Den resterande omodifierade sekvensen t.o.m 5'-änden tillhör ISIde1 elementet. Kursiverat ATG är startkodonen för cld-genen.
39
Plasmidpreparation
I tabell III nedan visas resultatet av plasmidpreparationen av pBBR1-MCS4-LacZ.
Elueringsvolymen var 100 µL där 5,1 µg plasmid preparerades fram. Renheten som bestämdes
definieras som kvoten mellan absorbansvärden vid 260 och 280 nm.
Tabell III: Visar resultatet av absorbansmätning vid 260 och 280 nm för renhet och koncentration efter preparation av plasmiden
pBBR1-MCS4-LacZ.
Elueringsvolym [µL] DNA
Koncentration [ng/µL]
Renhet [-]
100
51,1 ng/µL
1,9
100
51,1 ng/µL
2
40
Restriktionsklyvning
För att verifiera aktiviteten hos enzymerna klövs 300 ng avDNA med varje enzym enskilt.
Enzymen tillsattes i en aktivitet som motsvarade 10 U i båda fallen. En mängd på 300 ng okluvet
DNA och en stege Lambda DNA/PstI Marker, 24 (Thermo Scientific) användes som referens.
Figur 8 visar resultatet av testklyvningarna utkört på en 0,8 % TAE x 1 agaros gel där brunn (SalI)
är DNA kluvet med SalI, brunn (PstI): DNA kluvet med PstI, brunn (OK): okluvet DNA och
brunn (Stege): referensstegen.
Ytterligare en testklyvning gjordes, den här gången av plasmiden pBBR1MCS4-LacZ för att
verifiera att båda enzymerna var kapabla till att klyva den. Klyvningen gjordes enskilt med varje
enzym likadant som den tidigare testklyvningen. Figur 9 visar resultatet av den test klyvningen på
en 0,8 % TAE x 1 gel. Där brunn (SalI): innehåller kluven plasmid med SalI, brunn (PstI): plasmid
kluven med PstI, brunn (Okluvet): okluven plasmid och brunn (Stege): referensstegen Lambda
DNA/PstI Marker, 24 (Thermo Scientific). Det översta bandet på referensstegen är av storleken
11501 bp och bandet under 5077 bp.
Figur 10 visar klyvningen av 1 µg plasmid med båda enzymerna SalI och PstI samtidigt utkört på
en 0,8 % TAE x 1 gel. Tillsammans har enzymerna klyvt bort ett 29 bp långt fragment som senare i
ligeringssteget ska ersättas av 189 bp och 172 bp fragmenten som också klyvts med samma
restriktionsenzymer. Brunnen (KP) till vänster innehåller plasmiden kluven med både SalI och PstI,
brunn (OKP): okluven plasmid och brunn (Stege): referensstegen Lambda DNA/PstI Marker, 24
(Thermo Scientific). Det översta bandet på referensstegen är av storleken 11501 bp och bandet
under 5077 bp.
Här visar resultatet att PstI klyvningen av DNA är identisk med referensstegen Lambda DNA/PstI
Marker, 24 som är DNA kluvet med PstI. SalI skulle klyva DNA:t en gång och ge två band som
ligger strax under det okluvna DNA:t precis som visas på gelen.
Figur 8.Visar gelen med fyra prover från vänster till höger där DNA är kluvet med SalI i första brunnen och PstI i den andra. Den
tredje brunnen (OK) innehar okluvet DNA och den fjärde brunnen (Stege) Lambda DNA/PstI Marker, 24.
41
Figur 9. Visar gelen med fyra prover från vänster till höger där plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ klyvts med SalI i första brunnen och
PstI i den andra. De två resterande brunnarna innehåller okluven plasmid (Okluvet) och stegen Lambda DNA/PstI Marker, 24.
42
Här visar resultatet tydligt att banden som representerar den kluvna plasmiden med SalI och PstI
ligger skilt från bandet som representerar den okluvna plasmiden. DNA kan anta olika former som
medför band på olika platser i gelen beroende på varje forms rörelsemotstånd under resan genom
gelen. Den kluvna plasmiden är linjär och antar en större yta än den cirkulerade som i det här fallet
bollat ihop sig. Den utsätts då för ett större rörelsemotstånd i gelen och rör sig långsammare än den
mindre bollformen av det cirkulära DNA:t. Vandringssträckan blir därför kortare. Den kluvna
plasmidens storlek är 8040 bp som ligger mitt emellan stegens 11501 bp och 5077 bp som den
linjära plasmid bör göra.
Figur 10. Visar i brunnen (KP) från vänster den resterande mängd 1 µg plasmid pBBR1-MCS4-LacZ som klyvts med både SalI och
PstI, i brunnen intill okluven plasmid (OKP) och därefter stegen Lambda DNA/PstI Marker, 24.
Rening av kluven plasmid
Reningen av den kluvna plasmiden gav ett totalt utbyte på 20 %, ca 200 ng kluven plasmid DNA.
Elueringsvolymen var 20 µL och gav koncentrationen 9,5 ng/µL med renheten 1,8-1,9. Den kluvna
plasmiden är nu redo att användas i ligeringssteget dit 189 bp och 172 bp fragmenten var för sig ska
ligeras in.
43
PCR
PCR reaktionerna gjordes med plasmiden pBBR1MCS-4-lacZ_cldprom innehållande den möjliga
promotorn som templat DNA tillsammans med uppströms primer och nedströms primer_189 för att
konstruera och amplifiera 189 bp fragmentet och med uppströms primer och nedströms primer_172
för att konstruera och amplifiera 172 bp fragmentet. Proverna fördes över på en 3 % TBE x 1 agaros
gel för verifiering och visas i figur 11 och 12. En stege, GeneRuler low range DNA ladder (Thermo
Scientific) användes som referens, stegens 150 bp och 200 bp är markerade i båda figurerna. PCR
reaktionerna utfördes i två omgångar för att få tillräckligt med produkt. Olika mängd av
reaktionslösningen fördes över och separerades ut på gelen för att få en uppfattning hur effektiv
reaktionen varit. För att verifiera att ingen av komponenterna som användes i reaktionen var
kontaminerad gjordes två negativa kontroller med alla komponenter utan DNA templat. Skillnaden
mellan kontrollerna var att en innehöll nedströms primer_189 och den andra nedströms primer_172.
I den första reaktionen vars resultat visas i figur 11 var tillsatsen till brunnarna som skulle innehålla
prov 10 µL av en lösning innehållande mängden 1µL eller 3 µL löst prov i från PCR reaktionen.
Ifrån den andra reaktionen var tillsatsen fortfarande 10 µL men mängden tillsatt löst prov alltid 2
µL. Anledningen till den alternerade mängden prov var att få en uppfattning om hur mycket produkt
som bildats under reaktionen. Tillsatsen av de negativa kontrollerna till sina respektive brunnar var
10 µL från PCR reaktionerna under båda rektionerna.
Figur 11. Visar PCR produkternas vandring genom gelen där brunnarna 1 och 2 innehåller 189 bp produkten av mängd 3 µL
respektive 1 µL prov. Brunnarna 3 – 5 i ordning innehåller 3: 172 bp produkt (3 µL), 4: GeneRuler low range DNA ladder och 5: 172
bp produkt (1µL). Brunn 6 och 7 innehåller negativa kontroller.
44
Figur 12. Verifiering av produkterna ifrån PCR reaktion 2 likadant som ovan.
Rening av PCR produkterna
Proverna från PCR reaktionen renades totalt två gånger, en gång direkt efter PCR reaktionen och
ytterligare en gång efter att restriktionsenzymssätena i ändarna av fragmenten klyvts. Det gav
resultaten 88 ng/µL för 189 bp fragmentet och 101 ng/µL för 172 bp fragmentet efter första
reningen och 21 ng/µL för 189 bp fragmentet och 24 ng/µL för 172 bp fragmentet efter den andra.
Elueringsvolymerna från reningsstegen var 50 µL. Renheten var 1,9 i båda fallen.
45
Transformering
Figur 13 och 14 visar transformerade XL1-BLUE bakterier med 189 bp respektive 172 bp fragment
som strukits ut och vuxit på ampicillin innehållande LB plattor t.o.m. dagen efter transformeringen.
Cellerna ströks ut på enskilda plattor betecknade 200 L, 100 L och 40 L respektive 200 K, 100 K
och 40 K, där (L) står för bakterier transformerade med 189 bp fragmentet och (K) för de med 172
bp fragmentet. Talen betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på plattorna.
Figur 13. LB + ampicillin plattor med XL1-BLUE bakterier transformerade med pBBR1-MCS4-LacZ innehållande 189 bp
fragmentet. Talen 40, 100 och 200 betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem.
Figur 14. LB + ampicillin plattor med XL1-BLUE bakterier transformerade med pBBR1-MCS4-LacZ innehållande 172 bp
fragmentet. Talen 40, 100 och 200 betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem.
46
Verifiering
Sekvenseringsresultatet av de inligerade fragmenten från den möjliga promotorn gav de tänkta 172
bp och 189 bp varianterna med undantaget att det fanns en nukleotid i båda fragmenten som var
skild ifrån den ursprungliga sekvensen, dvs en mutation. De var i båda fallen placerade inom ISIde1
elementet men skilda ifrån varandra. Plasmidsekvensen uppströms och nedströms fragmenten var
identiskt med den ifrån databasen.
47
Celltillväxt XL1-BLUE
För cellerna XL1-BLUE och RM 101 bestämdes tillväxtkurvorna under anaeroba förhållanden för
att få information om hur fort bakterierna fördubblades.
Figur 15 visar tillväxtkurvan för transformerade XL1-BLUE celler med bakgrundsplasmiden
pBBR1MCS4-LacZ utan insert och figur 16 för celler med pBBR1-MCS4-LacZ innehållande 189
bp fragmentet.
Här visar figurerna att närvaron utav 189 bp fragmentet inte påverkar tillväxthastigheten.
OD600
Anaerob tillväxtkurva för XL1-BLUE
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Bakgrundsplasmid
utan insert
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tid [min]
Figur 15. Visar tillväxten som funktion av tiden för anaerobt odlade XL1-BLUE celler innehållande plasmiden pBBR1MCS4-LacZ.
Anaerob tillväxtkurva XL-1 BLUE 189 bp fragment
0,5
OD600
0,4
0,3
189 bp insert
0,2
0,1
0
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450
Tid [min]
Figur 16. Visar tillväxten som funktion av tiden för anaerobt odlade XL1-BLUE celler innehållande plasmiden pBBR1MCS4-LacZ
med 189 bp fragmentet.Celltillväxt
48
-galaktosidas assay
Figur 17 visar -galaktosidas uttrycket i XL1-BLUE celler med 189bp och 172 bp fragmenten
under aeroba och anaeroba förhållanden. Mätningarna gjordes för att ta reda på hur stort uttrycket
var i cellerna och om en anaerob induktion kunde observeras i celler med någon av fragmenten. I
mätningarna har uttrycket förmedlat av bakgrundsplasmiden pBBR1-MCS4-LacZ, subtraherats bort
för att ge det riktiga uttrycket. Figur 18 beskriver en jämförelse mellan uttrycket i celler med
bakgrundsplasmiden pBBR1-MCS4-LacZ mot likadana celler med inligerat 172 bp aerobt och
anaerobt. Det gjordes för att ta reda på hur stort -galaktosidas uttryckt bakgrundsplasmiden bidrog
med, om det var någon skillnad mellan det och uttrycket för 172 bp fragmentet och om det fanns en
anaerob induktion. De uppmätta resultaten i figur 18 och 19 sammanfattas i tabell IV och är
bestämda med 95 % konfidensintervall.
Tabell IV: Visar de numeriska värdena av b-galaktosidas aktiviteten med 95 % konfidensintervall för mätningarna i figurerna 17 och
18. I kolumnen som visar mätvärdena för figur 17 har uttrycket ifrån bakgrundsplasmiden har avlägsnats.
Modell
Aktivitet [Miller units]
figur 17
pBBR1-MCS4-LacZ med
189 bp fragment
Aerobt: 78,9 +/- 9,1
Anaerobt: 258,7 +/- 23,3
pBBR1-MCS4-LacZ med
172 bp fragment
Aerobt: 0,27 +/- 8,9
Aerobt: 24,5 +/- 8,9
Anaerobt: -1,57 +/- 13,6 Anaerobt: 47,7 +/- 13,6
pBBR1-MCS4-LacZ
Aktivitet [Miller units]
figur 18
Aerobt: 24,2 +/- 7,6
Anaerobt: 49,3 +/- 6,9
49
Resultatet visar att 189 bp fragmentet, är – 10 elementet är bevarat, ger upphov till ett basaluttryck
under aeroba förhållanden och induceras under anaeroba förhållanden. Celler med 172 bp
fragmentet där – 10 elementet avlägsnats visar inget uttryck.
Beta – Galaktosidas [Miller Units]
Beta - galaktosidas aktiviteten i XL1-BLUE celler med 189 bp och 172 bp
fragmenten under aeroba och anaeroba förhållanden
300
250
Aerobt (189 bp fragment)
200
Anaerobt (189 bp fragment)
150
Aerobt (172 bp fragment)
100
Anaerobt (172 bp fragment)
50
0
-50
Figur 17. Visar galaktosidas aktiviteten i XL1-BLUE celler innehållande plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ med 189 bp fragmentet
mot celler med 172 bp fragmentet efter tillväxt under aeroba och anaeroba förhållanden. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett
95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 22 st för 189 bp
aerobt, 12 st för 189 bp anaerobt, 24 st för 172 bp aerobt och 18 st för 172 bp anaerobt.
50
Här visar figuren att det statistiskt sätt inte är någon skillnad mellan uttrycket från
bakgrundsplasmiden mot 172 bp fragmentet som saknar det eventuella – 10 elementet. Men att
uttryck induceras under anaerob förhållanden.
Beta-Galaktosidas [Miller Units]
Beta - galaktosidas aktivitet i XL1-BLUE celler med bakgrundsplasmiden
mot 172 bp fragmentet under aeroba och anaeroba förhållanden
80
70
60
50
40
30
20
10
Aerobt (172 bp fragment)
Anaerobt Bakgrundsplasmid
Aerobt Bakgrundsplasmid
Anaerobt (172 bp fragment)
0
Figur 18. Visar galaktosidas aktiviteten i XL1-BLUE celler innehållande bakgrundsplasmiden pBBR1-MCS4-LacZ utan fragment
mot celler med 172 bp fragmentet efter tillväxt under aeroba och anaeroba förhållanden. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett
95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 26 st för
bakgrundsplasmiden aerobt och 17 st anaerobt, 24 st för 172 bp aerobt och 18 st anaerobt.
51
Resultat: Del II
Del II hade som syfte att ta reda om en gen i I. dechloratans som misstänks koda för ett protein
tillhörande FNR familjen gör det. Genom att kotransformera E.coli celler som själva saknar ett eget
FNR med I. dechloratans möjliga FNR-gen och mina fragment kan man under aerob och anaerob
uppodling av cellerna följt av b-galaktosidas mätningar observera om cellerna induceras under
anaeroba förhållanden. Därmed kan man avgöra om den möjliga FNR-genen kodar för ett
funktionellt FNR-protein som tillåter anaerob respiration.
Plasmidpreparation
Plasmidpreparationen av pBBR1-MCS2-LacZ gjordes i två omgångar där första omgången gav 13,5
µg och andra omgången gav 15,2 µg plasmid. Elueringsvolymen var 100 µL och kvantifieringen
gav resultatet i tabell IV. Renheten som bestämdes definieras som kvoten mellan absorbansvärden
vid 260 och 280 nm.
Tabell V: Visar resultatet av absorbansmätning vid 260 och 280 nm för renhet och koncentration efter preparation av plasmiden
pBBR1-MCS2-LacZ.
Elueringsvolym [µL] DNA
Koncentration [ng/µL]
Renhet [-]
100
135 ng/µL
1,9
100
152 ng/µL
1,9
52
Restriktionsklyvning
Innan plasmiden pBBR1MCS2-LacZ klövs med både EcoRI och SalI samtidigt inleddes med en
testklyvning med varje enzym enskilt för att säkerställa att båda enzymerna var kapabla till att klyva
den. Därefter klövs totalt 6 µg plasmid med båda enzymerna för att sedan användas i
ligeringssteget.
I figur 19 visas testklyvningen med EcoRI och SalI av plasmiden pBBR1MCS2-LacZ utkört på en
0,8 % TAE x 1 gel som verifierar att de klyver plasmiden. Där brunn (EcoRI) till vänster
representerar bandet som innehåller plasmiden kluven med EcoRI, brunn (SalI): plasmid kluven
med SalI, brunn (OK): okluven plasmid och brunn (Stege): referensstegen Lambda DNA/PstI
Marker, 24 (Thermo Scientific). Det översta bandet på referensstegen är av storleken 11501 bp och
bandet under 5077 bp. Figur 20 visar klyvningen av 6 µg plasmid pBBR1-MCS2-LacZ med
enzymerna EcoRI och SalI samtidigt utkörd på en 0,8 % TAE x 1 gel. Tillsammans har enzymerna
klyvt bort ett 27 bp långt fragment som senare i ligeringsteget ska ersättas av 189 bp och 172 bp
fragmenten som också klyvts med samma restriktionsenzymer. De tre brunnarna till vänster
markerade (KP) visar tre vandrande band som innehåller 2 µg var kluven plasmid med både EcoRI
och SalI, brunn (OK) näst intill är okluven plasmid och bredvid den (Stege) referensstegen Lambda
DNA/PstI Marker, 24 (Thermo Scientific). Det översta bandet på referensstegen är av storleken
11501 bp och bandet under 5077 bp.
Här syns direkt att båda banden som representerar kluven plasmid med EcoRI och SalI ligger skilt
från bandet som representerar den okluvna plasmiden. DNA kan anta olika former som medför band
på olika platser i gelen beroende på varje forms rörelsemotstånd i gelen. Den okluvna plasmiden tar
i den här, mer relaxerade formen upp en större yta än den kluvna linjära plasmiden och rör sig
därför långsammare genom gelen. Bandet för den kluvna plasmiden hamnar därför under bandet för
den. Den kluvna plasmidens storlek är 8234 bp som ligger mitt emellan stegens 11501 bp och 5077
bp som den linjära plasmid bör göra.
Figur 19. Visar gelen med fyra prover från vänster till höger där plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ är kluven med EcoRI i första
brunnen (EcoRI) och i brunnen (SalI) intill kluven med SalI. Den tredje brunnen (OK) innehar okluven plasmid och den fjärde
brunnen (Stege) Lambda DNA/PstI Marker, 24.
53
Figur 20. Visar gelen där de tre första brunnarna från vänster innehåller 2 µg var kluven pBBR1-MCS2-LacZ med enzymerna EcoRI
och SalI. Brunnen (OK) näst intill har okluven plasmid och bredvid den, brunnen (Stege) finns det en Lambda DNA/PstI Marker, 24.
Rening av kluven plasmid
Reningen av den kluvna plasmiden gav ett totalt utbyte på 18 %, ca 1 µg kluven plasmid DNA av
de 6 µg som separerades ut på gelen. Elueringsvolymen var 50 µL och gav koncentrationen 22
ng/µL med renheten 1,9-2.
54
PCR
PCR reaktionerna gjordes med genomiskt I. dechloratans DNA som templat och med uppströms
primer och nedströms primer_189 för att konstruera och amplifiera 189 bp fragmentet och med
uppströms primer och nedströms primer_172 för att konstruera och amplifiera 172 bp fragmentet.
Resultatet separerades efteråt ut på en 3 % TBE x 1 agaros gel för verifiering och visas i figur 21.
Fragmenten testades tillsammans med en referensstege GeneRuler low range DNA ladder (Thermo
Scientific). Stegens 150 bp och 200 bp är markerade på bilden. Två negativa kontroller gjordes med
alla komponenter utan templat DNA. En kontroll innehöll nedströms primer_172 men ingen
nedströms primer_189 och den andra kontrollen innehöll tvärtom. Kontrollerna visade sig vara
kontaminerade eftersom att produkter bildats i brunnarna 10 och 11. Jag försökte ta reda på vilken
eller vilka av komponenterna som var kontaminerade genom att byta ut de olika komponenterna
mot nytt av ur en annan förpackning. Alla komponenter hann jag inte byta p.g.a. att det tog för lång
tid samtidigt som risken att fel produkt hade bildats i reaktionen var mycket liten.
När det var dags att tillsätta produkt ifrån PCR reaktionen till brunnarna på gelen i figur 21 inför
verifieringen gjordes det genom att först lösa 2 µL av provet i 8 µL sterilt vatten. Det gjordes för att
få en rimlig volym att tillsätta eftersom brunnarna är ganska djupa och för att späda ut provet p.g.a.
att resultatet ifrån de två tidigare PCR reaktionerna (Figur 11 och 12) visat detta är en lämplig
mängd som syns bra på gelen.
Figur 21. Visar PCR produkternas vandring genom gelen. Brunnarna 1-4: innehåller 189 bp fragment, brunn 5: GeneRuler low range
DNA ladder, brunnarna 6-9 har 172 bp fragmentet och 10-11 är kontaminerade blankprover.
PCR Rening
Proverna renades totalt två gånger, en gång direkt efter PCR reaktionen och ytterligare en gång efter
restriktionsenzymssätena i ändarna av fragmenten klyvts. Det gav resultaten 36 ng/µL för 189 bp
fragmentet och 29 ng/µL för 172 bp fragmentet efter reningen och 19 ng/µL för 189 bp fragmentet
och 14 ng/µL för 172 bp fragmentet efter den andra reningen. Elueringsvolymerna var 50 µL.
Renheten blev 1,9 -2 respektive 1,9.
55
Transformering II
Figur 22 och 23 visar transformerade XL1-BLUE bakterier med 189 bp respektive 172 bp fragment
som strukits ut och vuxit på kanamycin innehållande LB plattor t.o.m. dagen efter transformeringen.
Cellerna ströks ut på enskilda plattor betecknade 200 L, 100 L och 40 L respektive 200 K, 100 K
och 40 K, där står för (L) bakterier transformerade med 189 bp fragmentet och (K) bakterier med
172 bp fragmentet. Talen betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på plattorna.
Figur 22. LB + kanamycin plattor med XL1-BLUE bakterier transformerade med pBBR1-MCS2-LacZ innehållande 189 bp
fragmentet. Talen 40, 100 och 200 betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem.
Figur 23. LB + 3anamycin plattor med XL1-BLUE bakterier transformerade med pBBR1-MCS2-LacZ innehållande 172 bp
fragmentet. Talen 40, 100 och 200 betecknar antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem.
56
Verifiering II
Sekvenseringsresultatet av de inligerade fragmenten från den möjliga promotorn gav de tänkta 172
bp och 189 bp varianterna med undantaget att det fanns två insertionsmutationer i 189 bp
fragmentet. Båda var placerade inom ISIde1 elementet (Figur 24).
Plasmidsekvensen uppströms och nedströms 189 bp insertet var identiskt med den ifrån databasen.
Gällande plasmiden med 172 bp insertet kunde sekvenseringsföretaget bara leverera resultatet för
plasmidsekvensen nedströms insertet. Den också var identisk till databasens.
Sekvens uppströms cld i Ideonella
5'GCGAGGTCGGCGTCAGTGTCGGGCGGTTGTACCACCGAGGGTCATGTTTGT
TGAGAAGTCAATTTCCACTGGAAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAG
AACACATAAAAAAGGAGAAAT
TTTCGGAGAAACTCTTGACTTAAATCA
GCGAAGATTCGTGCA
'3
Sekvenseringsresultat 189 bp fragment
TAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGCGAGGTCGGCGTCAAGTG
TAGAACTAGTGGATCCCCCGGG
TCGGGCGGTTGTACCACCGAGGGTCATGTTTGTTGAGAAGTCAATTTCCACTG
GAAACGGCATAGAGCCAAAAATATAGTGTTAAGTTTCGGAGAAACTCTTGACT
AACACA
TG GAAGATTCGTGCAGT
TAAATCA
TAAAAAAGGAGAAA
C
CGACCTCGAGGGGGGGCCCAGGAGGACGTCCATG
Figur 24. Visar jämförelsen mellan den möjliga promotor sekvensen uppströms cld och 189 bp framgentet som ligerats in i plasmiden
pBBR1-MCS2-LacZ. Sekvens med grå bakgrund är bindningsekvens för uppströms primer och nedströms primer_189. I fet stil
markeras den möjliga promotor regionen uppströms cld. Den resterande omodifierade sekvensen t.o.m 5'-änden tillhör ISIde1
elementet. Vit sekvens med svart ytterlinje är restriktionssekvenser och kursiverad sekvens med sträck över sig är plasmiden pBBR1MCS2-LacZ. Insertionsmutationerna är markerade som vit sekvens inom svart bakgrund. Extended -10 element och -35 element är
markerade med större teckenstorlek. FNR-boxen är understruken.
57
Transformering III
Den tredje transformeringen var en kotransformering som gjordes av redan transformerade RM 101
celler. Cellerna kom från två olika kulturer. Den ena kulturen var sedan tidigare transformerad med
plasmiden pBR322 och den andra med pBR322_IdFNR. Där IdFNR betonar att plasmiden innehöll
ett insert som kodar för en gen i I. dechloratans som möjligen tillhör en FNR familj. Jag behövde
transformera dessa celler med mitt 189 bp och 172 bp fragment för att senare kunna utföra bgalaktosidas mätningar som gav en indiktation på om det möjliga FNR proteinet i I. dechloratans
hade förmåga att förmedla en anaerob induktion genom att binda in till den möjliga promotorn. Det
första bildparet (Figur 25) visar RM 101 celler innehållande plasmiden pBR322_IdFNR och
transformerade med plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ innehållande mina 189 bp och 172 bp
fragment. Cellerna har strukits ut och vuxit på ampicillin och kanamycin innehållande LB plattor
t.o.m. dagen efter transformeringen. Det andra bildparet (Figur 26) visar RM 101 celler
innehållande plasmiden pBR322 utan FNR-genen transformerade med plasmiden pBBR1-MCS2LacZ innehållande mina 189 bp och 172 bp fragment och vuxit under samma förhållanden som
cellerna i figur 25. På tredje bildparet (Figur 27) visas två kontroller, på LB plattan till vänster med
ampicillin har en liten del utav otransformerade RM 101 bara innehållande pBR322 strukits ut och
växt på. På plattan med kanamycin till höger har den resterande mängden strukits ut på. Detta
gjordes för att verifiera att cellerna endast innehöll plasmiden pBR322 med ampicillin resistens och
inget annat. Det visade sig att cellerna växte på ampicillin plattan men inte på kanamycin plattan
som indikerar att plasmiden pBR322 som innehåller ampicillin resistans finns i cellerna. Hade
cellerna växt på kanamycin plattan hade någon form av kanamycin resistens utvecklats eller att de
på något sätt tagit upp en plasmid med det. Det hade inneburit att transformeringen inte kunnat
göras eftersom en selektivitetskontroll då hade saknats.
För övrigt gav transformeringsförsöken gav en stor andel transformanter på ytterligare plattor än de
som redovisas nedan.
Figur 25. LB + ampicillin + kanamycin plattor med RM 101 bakterier innehållande plasmiden pBR322_IdFNR transformerade med
pBBR1-MCS2-LacZ innehållande fragment. IdFNR betecknar att I. dechloratans FNR-gen är inligerad i plasmiden. Talet 30 står för
antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem. Bokstaven L betecknar att cellerna transformerats med 189 bp fragmentet och
K med 172 bp fragmentet.
58
Figur 26. LB + ampicillin + kanamycin plattor med RM 101 bakterier innehållande plasmiden pBR322 transformerade med pBBR1MCS2-LacZ innehållande fragment. Talet 25 står för antalet µL transformerade celler som ströks ut på dem. Bokstaven L betecknar
att cellerna transformerats med 189 bp fragmentet och K med 172 bp fragmentet.
59
Figur 27. Till vänster en LB + ampicillin platta med otransformerade RM 101 bakterier innehållande plasmiden pBR322
och till höger en LB + kanamycin platta med likadana celler. Med beteckningarna (L) och (K) i menas att cellerna tillhörde den
mängd var tänkta till att transformeras med 189 bp fragmentet respektive 172 bp fragmentet.
60
galaktosidas assay II
Figur 28 visar -galaktosidas uttrycket i RM 101 celler transformerade med 189 bp och 172 bp
fragmenten. Mätningarna är gjorda på celler transformerade med olika innehåll. Alla celler
innehåller två plasmider som bas. Dessa plasmider är pBR322 och pBBR1-MCS2-LacZ. I en del av
cellerna innehåller en utav plasmiderna eller båda två ett insert. Detta insert kan i plasmiden
pBR322 bara vara IdFNR som betonar att genen som kodar för I. dechloratans FNR har ligerats in.
I plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ kan det finnas ett utav mina insert, 189 bp eller 172 bp
fragmentet. Vissa av cellerna innehåller bara dessa plasmider utan insert. Beteckningarna som
införts här är följande ”189 bp/172 bp fragment med FNR” för celler innehållande 189 bp eller 172
bp fragmentet inligerat i plasmiden pBBR1MCS2-LacZ samtidigt som FNR-genen är inligerad i
plasmiden pBR322. Är beteckningen ”189 bp/172 bp fragment utan FNR” är FNR-genen inte
inligerad i pBR322 men fragmenten finns i pBBR1MCS2-LacZ. Om fragmenten är frånvarande
men FNR-genen inligerad heter beteckningen och ”bakgrundsplasmider med FNR” respektive
bakgrundsplasmider utan FNR om både fragment och FNR är frånvarande. Dessa mätningar i figur
28 gjordes enbart aeroba förhållanden. I mätningen har det förmedlade uttrycket från
bakgrundsplasmiderna med eller utan FNR insertet inte subtraherats ifrån någon av de andra
uttrycksmätningarna i figuren. Mätningens syfte var få en uppfattning om FNR genens innebörd
under aeroba förhållanden, om den har någon påverkan på uttrycket. Figur 29 visar -galaktosidas
uttrycket i celler innehållande 189bp och 172 bp fragmenten inligerat i pBBR1MCS2-LacZ med
FNR-genen inligerat i pBR322 under aeroba och anaeroba förhållanden. I mätningarna har uttrycket
förmedlat från bakrundsplasmiderna med FNR subtraherats bort för att ge det riktiga uttrycket.
Mätningarna gjordes för att ta reda på hur stort uttrycket var i cellerna, om det fanns en anaerob
induktion och om i.s.f. för vilket eller vilka fragment. Figur 30 ställer uttrycket i celler med
bakgrundsplasmiderna innehållande FNR-genen utan inligerade fragment mot celler med både
FNR-genen och 172 bp fragmentet under aeroba och anaeroba förhållanden. Det gjordes för att ta
reda på hur stort -galaktosidas uttryckt bakgrundsplasmiderna med FNR bidrog med, om det var
någon skillnad mellan det och uttrycket i celler som också innehöll 172 bp fragmentet och om det
fanns en anaerob induktion. De uppmätta resultaten i figurerna 28, 29, 30 som sammanfattas i tabell
VI och är bestämda med 95 % konfidensintervall.
61
Tabell VI: Visar de numeriska värdena av b-galaktosidas aktiviteten med 95 % konfidensintervall för mätningarna i figurerna 28, 29
och 30. Den grå kolumnen representerar mätningarna i figur 28, där det förmedlade uttrycket ifrån bakgrundsplasmiderna inte
subtraherats bort. Värden i kolumnen som representerar figur 29, har uttrycket ifrån bakgrundsplasmiden har avlägsnats.
Modell
Aktivitet [Miller units] Aktivitet [Miller units] Aktivitet [Miller units]
figur 28
figur 29
figur 30
pBBR1MCS2-LacZ 189 Aerobt: 31,6 +/- 3,1
bp insert, pBR322
pBBR1MCS2-LacZ 189 Aerobt: 39,0 +/- 2,2
bp insert,
pBR322_IdFNR
Aerobt: 30,7 +/- 2,2
Anaerobt: 86,3 +/- 11,6
pBBR1MCS2-LacZ 172 Aerobt: 10,9 +/- 1,1
bp insert, pBR322
pBBR1MCS2-LacZ 172 Aerobt: 11,3 +/- 1,1
bp insert,
pBR322_IdFNR
pBBR1MCS2-LacZ,
pBR322
Aerobt: 9,2 +/- 1,3
pBBR1MCS2-LacZ,
pBR322_IdFNR
Aerobt: 8,3 +/- 0,9
Aerobt: 3 +/- 1,1
Anaerobt: 5,6 +/- 2,3
Aerobt: 11,3 +/- 1,1
Anaerobt: 23,3 +/- 2,3
Aerobt: 8,3 +/- 0,9
Anaerobt: 17,7 +/- 2,7
62
Resultatet tyder på att på att det är liten skillnad mellan 189 bp fragmentet med och utan FNR. 172
bp fragmentet ligger lite högre än bakgrundsnivån men inte mycket.
Beta-galaktosidas [Miller units]
Beta - galaktosidas aktivitet i RM 101 celler med och utan FNR av 189 bp och
172 bp fragmenten mot bakgrundsplasmiderna under aeroba förhållanden
45
40
189 bp fragment utan FNR
35
189 bp fragment med FNR
30
25
172 bp fragment utan FNR
20
172 bp fragment med FNR
15
Bakgrundsplasmiderna utan FNR
10
5
Bakgrundsplasmiderna med FNR
0
Figur 28. Visar galaktosidas aktiviteten i RM 101 celler med och utan I. dechloratans FNR-gen innehållande fragmenten 189 bp
och 172 bp mot uttryck i likadana celler med bakgrundsplasmiderna utan fragment. Bakgrundsutrycked från plasmiderna utan insert
har inte subtraherats bort från uttryck förmedlade av 189 bp eller 172 bp fragmenten. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett 95
% konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena för aktiviteten under aeroba
förhållanden var 3 st.
63
Celler med 189 bp fragmentet där – 10 elementet är bevarat har för måga att utgöra ett basaluttryck
under aeroba förhållanden och induceras under anaeroba förhållanden. Uttrycken i celler med 172
bp fragmentet där – 10 elementet avlägsnats har nästan avskaffats helt.
Beta - galaktosidas [Miller Units]
Beta - galaktosidas aktivitet i RM 101 med FNR av 189 bp och 172 bp
fragmenten aerobt och anaerobt
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Aerob 189 bp fragment med
FNR utan bakgrund
Anaerob 189 bp fragment med
FNR utan bakgrund
Aerob 172 bp fragment med
FNR utan bakgrund
Anaerob 172 bp fragment med
FNR utan bakgrund
Figur 29: Visar Galaktosidas aktiviteten i RM 101 celler med I. dechloratans FNR innehållande fragmenten 189 bp och 172 bp
under aeroba och anaeroba förhållanden. Det bidragande uttrycket förmedlat i celler med bakgrundsplasmiderna innehållande FNR
har subtraherats bort ifrån alla mätningar. Felstaplarna som visas vid varje topp är ett 95 % konfidensintervallet för det uppmäta
medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 3 för alla aeroba prov och 4 st för de anaeroba.
64
Det här resultatet visar att det statistiskt sätt är en skillnad i uttryck från bakgrundsplasmiderna mot
172 bp fragmentet, både aerobt och anaerobt. Här syns också en tydlig anaerob induktion i båda
mätningarna.
Beta - galaktosidas [Miller Units]
Beta - galaktosidas aktivitet i celler med FNR: Bakgrundsplasmider
mot 172 bp fragmentet under aeroba och anaeroba förhållanden
35
30
25
20
15
10
5
Aerob bakgrundsplasmider med
FNR
Anaerob bakgrundsplasmider med
FNR
Aerob 172 bp fragment med FNR
Anaerob 172 bp fragment med FNR
0
Figur 30. Visar galaktosidas aktivitet i RM 101 celler med I. dechloratans FNR transformerade med bakrundsplasmiderna utan
fragment mot likadana celler med 172 bp fragmentet under aeroba och anaeroba förhållanden. Felstaplarna som visas vid varje topp
är ett 95 % konfidensintervallet för det uppmäta medelvärdet. Antal observationer för de uppmätta medelvärdena var 3 för alla
aeroba prov och 4 st för de anaeroba.
65
Celltillväxt RM 101
Figur 31 visar RM 101 celler med och utan tillgång till I. dechloratans FNR-gen. Cellerna är
transformerade med pBR322 och pBBR1MCS2-LacZ som inte har någon FNR-gen respektive
pBR322_IdFNR och pBBR1MCS2-LacZ där IdFNR betecknar att plasmiden bär på FNR-genen.
En jämförelse mellan kurvorna visar att närvarandet av I. dechloratans FNR påverkar
tillväxthastigheten.
Anaerob tillväxt kurva för RM 101
0,5
OD 600
0,4
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
0,3
0,2
0,1
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Tid [min]
Figur 31. Visar tillväxten som funktion av tiden för två typer av RM 101 celler odlade under anaeroba förhållanden. Celler
transformerade med plasmiderna pBBR1-MCS2-LacZ och pBR322 mot celler transformerade med pBBR1-MCS2-LacZ och
pBR322_IdFNR. IdFNR innebär att genen som kodar för I. dechloratans FNR-protein är inligerat i plasmiden. Antal försök var ett
och OD mätningen utfördes en vid respektive tid.
66
Diskussion
Val av plasmider
Två olika plasmider användes under del I och II av arbetet för att testa hypotsen om den FNRberoende promotorn under och om genen i I. dechloratans kodade för ett möjligt FNR-protein.
Plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ användes under del I som vektor för mina insert. Det var lämpligt
eftersom -galaktosidas mätningarna som gjordes skulle kunna relateras till tidigare mätningar på
andra fragment av den möjliga promotorn där samma vektor använts. Troligtvis hade användandet
av en annan plasmid, föredragande pBBR1-MCS2-LacZ inte spelat någon roll men för
jämförbarhetens skull valdes experimenten att utföras med samma vektor som tidigare. Av samma
anledning bytte jag bytte till plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ under del II. Den hade också använts i
tidigare arbeten under mätningar med RM 101 på andra konstruktioner av promotorn.
Det hade annars varit lämpligare att under både del I och II arbetat med plasmiden pBBR1-MCS2LacZ eftersom den uppfyllde alla kriterier för båda delarna av arbetet. Med det menas att eftersom
den hade kanamycin resistens, och bakterierna i den första delen av arbetet inte från början hade
någon egen antibiotikaresistens spelade det ingen roll vilken resistens plasmiden innehöll. Alla
bakterier som senare transformerades med plasmiden kunde växa på kanamycininnehållande plattor
medans alla som inte tagit upp plasmiden hade dött. I del II däremot kotranformerades
bakteriestammen RM 101 som då redan bar på plasmiden pBR322 innehållande ampicillin
resistens. Dessa bakterier besatt förmågan att växa på ampicillininnhållande plattor från början. För
att det skulle vara möjligt att avgöra om bakterierna hade tagit upp den nya plasmiden under
kotransformeringen måste den ha haft en annan antibiotika resistens än ampicillin. Då skulle en
kontroll utav upptaget kunna ske genom låta kotransformanterna växa i en miljö med ampicillin och
den korrespondernade antibiotikan som den nya plasmiden innehåller resistens mot. Det gjorde
plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ lämplig eftersom den innehåller kanamycin resistens. Därmed
kunde man avgöra om kotransformanterna som tidigare bara kunde växa i en ampicillininnehållande
miljö nu kunde växa i en ampicillin och kanamycininnehållande miljö. Hade istället bakterierna
kotransformerats med pBBR1-MCS4-LacZ som också besitter ampicillin resistens hade ingen
selektivitetsgaranti för att båda plasmiderna fanns i bakterierna kunnat ges eftersom det räcker med
en utav dem för att överleva i en ampicillin innehållande miljö. Därför var jag tvungen att byta till
pBBR1-MCS2-LacZ under del II.
67
Val av primrar för test om hypotes
Valet av primrar berodde på en del olika faktorer, framförallt nedströms primrarna. För uppströms
primern fanns det egentligen inget direkt att ta hänsyn till när den valdes.
Eftersom uppströms primern fanns tillgänglig sedan tidigare arbeten och var komplementär till en
DNA sekvens tillräckligt långt uppströmms cld för att bevara den möjliga promotorregionen som
undersöktes i det här arbetet behövde inget mer göras med den. Den fanns dock i två varianter som
skiljde sig i att den ena hade ett restriktionssäte för PstI och den andra för EcoRI. Båda sätena fans
plasmiden pBBR1-MCS4-LacZ och ett utav dem, EcoRI sätet, fanns i plasmiden PBR1MCS-2LAZ vilket gjorde dem lämpliga för arbetet.
Nedströms primrarna var mer kritiska i förhållande till test av hypotesen eftersom de bestämde den
undre gränsen för hur långa fragmenten skulle bli. För att ta reda på om sekvensen uppströms cld
innehöll en FNR-beroende promotor och för att undersöka om promotorn var klass II konstruerades
nedströms primer_189 som gav 189 bp fragmentet vars sista nukleotid nedströms var det
förutspådda TSS för en klass II promotor. Hade fragmentet varit 20 bp längre hade den innehållit ett
TSS för en FNR-beroende promotor av klass I också och man hade inte direkt kunnat avgöra om
den FNR promotorn var en klass I eller II promotor. Därför konstruerades 189 bp fragmentet så kort
som möjligt för att endast utgöra möjligheten för en klass II promotor att fungera. Den möjliga FNR
oberoende promotorn låg en bit uppströms den FNR-beroende promotorn och täcktes därför också
utav dessa primrar.
Nedströms primer_172 designades med syftet att konstruera ett 172 bp fragment utan det möjliga
-10 elementet tillhörande den möjliga FNR-beroende promotorn. Eftersom avlägsnadet av ett -10
elementet medför att en promotor förlorar sin identitet skulle detta kunna avgöra om 172 bp
sekvensen fortfarande gav fullt uttryck, bara aerobt uttryck eller inget uttryck. Man skulle då kunna
ta reda på huruvida systemet regleras utav en eller flera promotorer och därmed om sekvensen
innehöll en FNR-beroende klass II promotor.
Restriktionssätena som valdes till nedströms primrarna var för restriktionsenzymet SalI. Det
framförallt viktigt vid inligering av det 172 bp fragmentet att det inte fanns ett möjligt -10 element
strax nedströms detta restriktionssäte i plasmiderna. Det skulle innebära att när 172 bp fragmentet
ligerades in skulle detta element ersätta det som avlägsnats i fragmentet och därmed skulle det
troligtvis uppföra sig som om hela promotorn var bevarad vilket skulle förstöra syftet med hela
arbetet. Ett sådant område fanns inte i någon av plasmiderna efter SalI sätet och därför ansågs det
vara ett bra val.
När längden av primrarna bestämdes var det viktigt att den skulle innebära en inbindning med hög
specificitet till önskad sekvens. Vanligtvis blir detta någonstans mellan 18-25 nt men bestäms
generellt med formeln 4x där x längden på primern och ger efter hur många nt den teoretiska
kombinationen, dvs primer sekvensen uppkommer en gång. Det får man sedan förhålla till längden
av DNA:t i fråga och därifrån bestämma vad som är rimligt. I mitt fall gjordes ingen direkt
beräkning eftersom bakterie DNA är relativt kort jämfört med andra högre organismer och att de
tidigare experiment inom den här studien har fungerat bra med liknande primrar.
68
Fragmenten för test om hypotes
Transformeringarna gick i allmänhet bra, det som man kan nämna är att transformeringen utav
E.coli XL1-BLUE med plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ innehållande 189 bp och 172 bp
fragmenten hade egentligen inte behövts göras utan skulle kunnat transformerats in i E.coli RM 101
direkt. Anledningen till att jag inte gjorde det var att jag bara hade en begränsad uppsättning utav
plasmiden med inligerade fragment. RM 101 är inte superkompetenta celler och därmed svårare att
transformera, hade den transformeringen misslyckats hade jag kunnat förlora allt mitt material och
få börja om ifrån början med att klyva plasmid, tillverka insert ... igen. Därför transformerade jag
först superkompetenta XL1-BLUE vilket också gav mig fördelen att jag efteråt hade ett oändligt
förråd av växande celler innehållande mina fragment i.
Verifieringen gav ett korrekt resultat för både 189 bp och 172 bp fragmenten i plasmiden pBBR1MCS4-LacZ med undantaget att det fanns en punktmutation i båda resultaten. Det såg nästan
likadant ut för fragmenten i plasmiden pBBR1-MCS2-LacZ där 189 bp hade fått två
insertionsmutationer. Både punktmutationerna och insertionsmutationerna förekom inom ett område
strax uppströms promotorregionen som är ett inertionselement. Elementet kallas ISIde1 och
separerar generna clrA-D och cld (Figur 3 eller 5). Eftersom området inte tillhör promotor regionen
anses det inte ha någon effekt på promotoraktiviteten.
69
Den FNR-beroende promotorn
Den teoretiska analysen av sekvensen uppströms cld gav upphov till ett förslag om vart den FNRberoende promotorn skulle kunna finnas, med -10, -35 elementen och TSS (Figur 5, 6 och 7). Både
lokaliseringen av elementen i förhållande till varandra, till TSS, till FNR-sätet och matchandet till
konsensussekvenserna för s70 i E.coli gör detta till en teoretiskt sätt bättre promotor än den som
tidigare spekulerats ge upphov till basaluttrycket (Figur 3 och 5). Avstånden mellan – 10 elementet
och TSS i den möjliga FNR-beroende promotorn är 7 nt som är optimalt, till skillnad från den
möjliga promotorn för basaluttrycket där avståndet är 15 nt. Det är ett långt avstånd mellan en -10
region och ett TSS, 2-11 nt är vanligt [7]. Avståndet mellan -10 och -35 regionen är 17 nt i båda de
möjliga promotorerna som är optimalt och mest förekommande bland promotorer [12, 24]. Dock
finns det fler matchningar till konsensussekvenserna bland -10 och -35 elementen i den möjliga
FNR-beroende promotorn än vad som finns i den möjliga FNR oberoende promotorn (Figur 3 och
5). Den FNR-beroende promotorn har också TG determinanten som utgör ett extended – 10 område
som ytterligare kan stärka promotoraktiviteten. Den besitter också två av de viktigaste
nukleotiderna inom – 10 elementet, -7T och -11A, varav den FNR oberoende promotorn bara har
-7T. Eftersom den möjliga FNR-beroende promotorn passar bra in på beskrivningen för vad som är
karakteristiskt för en klass II promotor styrker det hypotesen om att det finns en sådan promotor i
sekvensen uppströms cld. Den stämmer också teoretiskt sätt väl överens med strukturen av väl
fungerande promotorer i E. coli. Hur promotorstrukturen ser ut i I. dechloratans finns det ingen
direkt kunskap om just nu. Men eftersom 189 bp sekvensen gav upphov till uttryck i E.coli betyder
det att den innehåller en promotor region och att den fungerar i E.coli som medför att det kan finnas
en likhet mellan promotor regioner i dessa två arter. Dessutom mättes den anaeeroba induktionen i
E.coli upp till 3.3 ggr basaluttrycket, nära ungefär 4 ggr basaluttrycket som tidigare observerats i I.
dechloratans [4] vilket indikerar att likheten troligtvis är stor. Under assayen på XL1-BLUE gjordes
två mätningar som visas i figurerna 17 och 18. Den första mätningen i figur 17 visar tydligt att
celler med 189 bp fragmentet ger ett uttryck under aeroba förhållanden och induceras under
anaeroba förhållanden. Resultatet för 172 bp fragmentet visar att uttrycket är helt avskaffat. I figur
18 ställdes 172 bp fragmentet mot bakgrundsplasmiden utan fragment under aeroba och anaeroba
förhållanden för att ta reda på om det var någon skillnad i uttryck mellan dem. Det gjordes för att ta
reda på om den del, dvs – 10 elementet som fanns med i 189 bp fragmentet men som avlägsnats i
172 bp har betydelse för den möjliga FNR-beroende promotorns funktion. Resultatet visar att det
inte finns någon skillnad i uttryck mellan bakgrundsplasmiden och 172 bp fragmentet, varken under
aeroba eller anaeroba förhållanden. Tillsammans med resultatet i figur 17 indikerar det att -10
elementet har betydelse för uttrycket, både aerobt och anaerobt, och styrker hypotesen om att det
finns en möjlig FNR-beroende promotor och att den är av klass II, men samtidigt att den också
används för basaluttrycket utav Cld. Tidigare forskning visar att klass II FNR-beroende promotorer
är kapabla till att utgöra ett basaluttryck under aeroba förhållanden då FNR är inaktivt utav den gen
som också induceras utav FNR under anaeroba förhållanden då det är aktivt [32]. Detta tillsammans
med resultaten från det här arbetet talar emot hypotesen om att det skulle finnas två promotorer, en
FNR oberoende, aktiv under aeroba förhållanden och en FNR-beroende som tog över under
anaeroba förhållanden. Den hypotesen kom först upp under ett tidigare arbete med ett 200 bp
fragment av sekvensen uppströms cld där mutationer utav den möjliga FNR-boxen gjorts som
resulterat i att uttrycket avskaffats helt, både under aeroba och anaeroba förhållanden [15].
Samtidigt som samma sekvens med bevarad FNR-box var kapabel till att utgöra ett basaluttryck i
den FNR-negativa stammen RM 101 [15]. Detta gav en indikation på att FNR-boxen kanske
överlappade med ett potentiellt -10 element som kanske korresponderade till det tidigare bestämda
TSS, 85 nukleotider uppströms den första nukleotiden i translation initieringskodonet [21] (Figur
3). Att det finns flera promotorer inom en sekvens framför en gen är något som ibland förekommer.
I sådana fall kan en utav promotorerna t. ex. vara beroende utav någon transkriptionsfaktor eller att
70
den identifieras utav en annan s-faktor. Väldigt ofta associeras sekvenser som innehåller många
promotorer med gener som överförts horisontellt till och från olika arter [7]. Det hade istället styrkt
hypotesen om att det hade funnits fler promotorer inom sekvensen uppströms cld eftersom det
kloratmetaboliserande klustret anses ha tilldelats I. dechloratans via horisontell genöverföring [1]
[4].
71
FNR´s roll i I. dechloratans
Figur 29-30 visar att den möjliga FNR-genen kodar för ett protein som inducerar uttrycket från 189
bp sekvensen till 2.8 ggr basaluttrycket under anaeroba förhållanden, och att -10 elementet behövs
fullt uttryck som ytterligare styrker att det endast finns en promotor för hela systemet. Figur 31
visar att den proteinet ifrån I. dechloratans kunde ta över E.coil's FNR's roll under anaerob
respiration med NaNO3. Resultatet visar tydligt att cellerna med den möjliga FNR-genen överlever
under anaeroba förhållanden medans de som saknar FNR dör. Detta visar att I. dechloratans FNR
mycket möjligt kan ta över E.coli's FNR's roll under dessa förhållanden. Vilket är resonligt eftersom
genen genen tidigare identifierats vara en FNR homolog ifrån E.coli [15].
Inom kloratklustret finns inte någon FNR-gen. Ändå behövs det ett FNR för uppreglering utav cld
och överlevnad under anaeroba förhållanden. Den möjliga FNR-genen i I. dechloratans antas nu,
med dessa resultat som grund, ta rollen som anaerob inducerare utav cld och potentiellt andra gener
också som är involverade i anaerob metabolism.
72
Celltillväxt
Resultatet i figur 15 och 16 visar att det inte är någon skillnad i tillväxt för XL1-BLUE celler med
endast bakgrundsplasmiden mot celler med inligerat 189 bp under anaeroba förhållanden. Cellerna
når en stationär fas vid OD 0.43 vilket är något som skiljer sig ifrån likadana aerobt odlade celler
som når stationär fas vid OD 1.2. Någon aerob tillväxtkurva gjordes inte utav den anledningen att
det redan fanns en för XL1-BLUE celler. Den kurvan tyckte jag stämde ganska bra överens med hur
mina XL1-BLUE celler växte när jag odlade upp dem aerobt. Det fanns också en anaerob
tillväxtkurva, men den stämde betydligt sämre överens mot resultaten jag observerade för cellernas
tillväxt anaerobt. Därför gjorde jag en ny. Cellerna växte både snabbare och till ett större antal enligt
den gamla anaeroba tillväxtkurvan emot vad jag observerade för mina celler. Detta tror jag beror på
att cellerna som jag använde under arbetet, även fast de var av samma variant XL1-BLUE, och kom
från samma leverantör, så var det ett oöppnat paket med helt nylevererade celler som jag använde.
Det kan ha varit så att en förändring gjorts i de nya cellerna som skiljer dem ifrån de tidigare
beställda celler. Ibland görs mindre förändringar i varor över tid som inte nämns för konsumenten.
73
Klyvning av plasmid
Både klyvningen av plasmid pBBR1-MCS4-LacZ i del I och pBBR1-MCS2-LacZ i del II såg ut att
ha fungerat bra. Tittar man på figurerna 10 och 20 ser man tydligt en skillnad i vandringslängd
mellan kluven och okluven plasmid. Anledningen till att man ser två band för okluven plasmid i
figur 20 beror på att cirkulärt DNA kan befinna sig i relaxerat eller tvinnad form. Dessa former rör
sig olika fort i gelen beroende på att rörelsemotståndet är olika för varje form. Det viktiga är att den
linjära plasmiden inte innehåller någon av formerna i det okluvna materialet. Därför indikerar figur
20 att klyvningen är fullständig när man ser att den kluvna plasmiden inte innehåller någon av
formerna som den okluvna plasmiden gör. I figur 10 syns också att klyvningen är fullständig.
Stegen som använts består av linjära DNA-fragment av olika längder och kan jämföras direkt med
en kluven, linjär plasmid. Man ser i båda figurerna att den kluvna plasmiden ligger mitt emellan
11501 bp och 5077 bp fragmenten i stegen vilket inte här konstigt eftersom större fragment rör sig
långsammare än korta. Plasmiderna pBBR1-MCS4-LacZ i figur 10 och pBBR1-MCS2-LacZ i figur
20 är av storleken 8040 bp respektive 8234 bp och bör därför vandra snabbare än 11501 bp men
långsammare än 5077 bp i stegen, vilket de gör samtidigt som de alltid vandrat lika långt i kluven
form. Anledningen till att mycket av plasmiden släpade efter i figur 20 beror troligtvis på att
brunnarna var överladdade med med material.
PCR
PCR-reaktionerna utfördes totalt tre gånger under del I och II. Två gånger i del I för att få gott om
material och en gång i större mängd under del II eftersom jag bättre visste hur mycket jag behövde
då. I figur 11 syns den första reaktionen en liten skillnad i vandringslängd mellan 189 bp och 172 bp
fragmentet under brunn 1 och 3 kan observeras. Båda ligger mellan 150 bp och 200 bp banden i
stegen samtidigt som 172 bp bandet ligger lite lägre än 189 bp fragmentet vilket är en indikation på
att produkter av förväntad längd bildats och att primrarna bundit till de avsedda sekvenserna. I figur
12 syns inte detta lika tydligt, produkterna har vandrat ungefär lika långt. Men banden ligger mellan
150 bp och 200 bp i stegen vilket ger en liten indikation på att produkterna konstruerats som
önskats. Ingen kontaminering av negativa kontroller syns, varken under brunn 6 och 7 i figur 11
eller under brunn 8 och 9 i figur 12. Den tredje PCR reaktionen som gjordes i del II och syns i figur
21 ger liknande resultat som tidigare. Alla band ligger mellan 150 bp och 200 bp banden på stegen.
Banden under brunnarna 1-4 till vänster om stegen är 189 bp fragmentet och brunnarna 6-9 till
höger om den är 172 bp fragmenten. Det är lite variation i vandringssträckan för banden som är
ungefär samma för alla och ger därför inte ett övertygande resultat på att rätt produkter konstruerats.
Däremot har det negativa kontrollerna kontaminerats där kontamineringen troligtvis kommer från
antingen genomiskt Ideonella DNA eller från plasmiden pBBR1MCS-4-lacZ_cldprom. I det här fallet
hade inte en kontaminering med genomiskt DNA från I. dechloratans eller plasmiden pBBR1MCS4-lacZ_cldprom inte någon betydelse eftersom syftet med PCR-körningen var att amplifiera sekvenser
från just detta DNA.
74
Felsökning assayer
Figur 18 och 30 visar också att det möjligen finns en anaerob induktion av både
bakgrundsplasmiden och 172 bp fragmentet. Det fenomen är lite svårt att förklara direkt. En orsak
kan vara att cellernas form ändras under anaeroba förhållanden som påverkar OD mätningen. Den
mäter ljusspridningen som medförs när ljuset träffar cellernas yta och ger mått på celltätheten i ett
prov. Därför spelar cellformen roll under denna mätning. Induktionen tror jag beror på att formen
ändrat sig sådant att en lägre celltäthet mäts upp än vad som egentligen fanns i proven.
galaktsidas mätningen ger därför ett intryck av en induktion som istället beror på en större
celltäthet som medför att en större mängd substrat bildas beroende på att det nu finns fler celler och
inte att uttryck har ökat i varje cell. Figur 30 visar till skillnad ifrån figur 18 att det finns en skillnad
i uttryck mellan bakgrundsplasmiderna och 172 bp fragmentet. Det beror troligtvis på att resultatet
endast baseras på tre och fyra mätningar medans resultaten i figur 18 baseras på ett 20:tal
mätningar. Antalet mätningar kan nog också förklara varför induktionen för 189 bp fragmentet i
RM 101 bestämdes till 2.8 ggr som är lite mindre än 3.3 i XL1-BLUE. Det kan också bero på två
olika celler och FNR-protein.
75
Slutsats
Resultaten visar tydligt att 189 bp fragmentet stödjer uttryck på basal och inducerad nivå under
aeroba respektive anaeroba förhållanden. 172 bp fragmentet ger inte upphov till något uttryck vilket
leder till slutsatsen att den sekvens som avlägsnats i 172 bp fragmentet troligen är ett -10 elementet
och att en komplett promotor region finns i 189 bp fragmentet. Detta motbevisar hypotesen om att
en ytterligare promotor uppströms den FNR-beroende promotorn skulle stå för ett basaluttryck och
att den FNR-beroende endast skulle aktiveras för att anordna en uppreglering utav uttrycket. Att
FNR uppreglerar uttrycket kan konstateras då ingen uppreglering observeras i den FNR-negativa
stammen RM 101 men gör det i XL1-BLUE som har FNR. Möjligheten till en anaerob uppreglering
inom 189 bp fragmentet i närvaro utav FNR hävdar att promotorn är FNR-beroende och är en klass
II promotor. Den möjliga FNR-genen i I. dechloratans har visat sig koda för ett protein som kan
inducera uttrycket under anaeroba förhållanden. Proteinet har också förmågan att ersätta E.coli's
FNR proteins i roll under NaNO3 respiration vilket konstaterar att proteinet troligtvis är ett
funktionellt FNR.
76
Tackord
Tack till Maria Rova som har varit en utmärkt handledare med väglett mig genom det här arbetet.
Thomas Nilsson tackar jag för upplägget av kursen Bioteknik: Praktisk nukleinsyra och
proteinbiokemi som passade mig väldigt bra. Jag lärde mig väldigt mycket som jag fick användning
för i det här arbetet.
Tack Miriam Hellberg för alla tips och för allt materiel som jag fick innan du slutade, det hjälpte
mig mycket på vägen.
77
Referenser
1.
Nilsson T, Rova M, Smedja Bäcklund A. Microbial metabolism
of oxochlorates: a bioenergetic perspective. BBA-Bioenergetics
2013; 1827: 189–97
2.
M. Zimmermann and P.R. Trumbo. Iodine
American Society for Nutrition. Adv. Nutr 2013; 4: 262–64,
3.
Impact of Chlorine Dioxide on Transmission, Treatment, and Distribution System
Performance. Zamir Alam, Ron Hofmann, Lisa Lachuta, Ray Cantwell. American
Water Works Association, 2005. sid 105.
4.
Hellberg Lindqvist M, Johansson N, Nilsson T, et al. Expression of chlorite
dismutase and chlorate reductase in the presence of oxygen and/or chlorate as the
terminal electron acceptor in I. dechloratans. Appl Environ Microb 2012; 78:
4380–5
5.
Samuel P. Kounaves, Shannon T. Stroble, Rachel M. Anderson, et al. Discovery of
Natural Perchlorate in the Antarctic Dry Valleys and Its Global Implications
environmental science & technology 2010; 44: 2360–64
6.
Myers KS, Yan H, Ong IM, Chung D, et al. Genome-scale Analysis of
Escherichia coli FNR Reveals Complex Features of Transcription Factor Binding.
PLoS Genet 2013; 9
7.
Panyukov VV, Ozoline ON Promoters of Escherichia coli versus Promoter Islands:
Function and Structure Comparison. PLoS ONE 2013; 8
8.
Mendoza-Vargas A, Olvera L, Olvera M, Grande R, Vega-Alvarado L, et al.
Genome-Wide Identification of Transcription Start Sites, Promoters and
Transcription Factor Binding Sites in E. coli. PLoS ONE 2009; 4
78
9.
Jennie E. Mitchell, Dongling Zheng, Stephen J. W. Busby and Stephen D. Minchin
Identifcation and analysis of `extended -10' promoters in Escherichia coli
Nucleic Acids Research, 2003; 31, 4689-95
10.
John D. Coates and Laurie A. Achenbach Microbial perchlorate reduction: Rocketfuelled
metabolism. Nature Reviews Microbiology 2004; 2: 569-80
11.
Miriam Hellberg Lindqvist, Thomas Nilsson, Pontus Sundin and Maria Rova
Chlorate reductase is cotranscribed with cytochrome c and other downstream genes
in the gene cluster for chlorate respiration of I. dechloratans.
FEMS Microbiology Letters 2015; 362
12.
Vladimir Mekler, Konstantin Severinov, RNA polymerase molecular beacon as tool
for studies of RNA polymerase–promoter interactions
Methods 2015; 86: 19–26
13.
Virgil A. Rhodius1, Vivek K. Mutalik and Carol A. Gross. Predicting the strength of
UP-elements and full-length E. coli sE promoters. Nucleic Acids Research, 2012; 40:
2907–24
14.
Helen J. Wing, Jeff Green, John R. Guest, and Stephen J. W. Busby. Role of
Activating Region 1 of Escherichia coli FNR-protein in Transcription Activation at
Class II Promoters.
The Journal Of Biological Chemistry 2000; 275: 29061–65
15.
Miriam Hellberg Lindqvist. 2016. Oxygen-dependent regulation of key components
in microbial chlorate respiration, Doctorial thesis. Karlstad University studies,
Karlstad, Sweden.
16.
Robert Nerenberg, Breathing Perchlorate, Science 2013; 340: 38
79
17.
Alex O. Schwarz, Homero Urrutia, Jose´ Miguel Vidal, Norma Pe´rez, Chlorate
reduction capacity and characterisation of chlorate reducing bacteria communities in
sediments of the rio Cruces wetland in southern Chile, water research 2012; 46: 3283
– 92
18.
Hongzhi He & Haishuo Gao & Guikui Chen & Huashou Li & Hai Lin & Zhenzhen
Shu, Effects of perchlorate on growth of four wetland plants and its accumulation in
plant tissues, Environ Sci Pollut Res 2013; 20: 7301–08,
19.
Pawel Jajesniak and Tuck Seng Wong, From genetic circuits to industrial-scale
biomanufacturing: bacterial promoters as a cornerstone of biotechnology.
Bioengineering 2015; 2: 277-96
20.
Danielsson Thorell H. 2004. Enzymes and Genes for Microbial Metabolism of
Oxochlorates. Ph.D. thesis. Karlstad University, Karlstad, Sweden.
21.
Helena Danielsson Thorell, Jan Karlsson, Erik Portelius, Thomas Nilsson. Cloning,
characterisation, and expression of a novel gene encoding chlorite dismutase from
Ideonella. dechloratans. Biochimica et Biophysica Acta 2002; 1577: 445– 51.
22.
Miller JH: Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, 1972.
23.
G. Unden, S. Achebach, G. Holighaus, H.-Q. Tran, B. Wackwitz and Y. Zeuner.
Control of FNR Function of Escherichia coli by O2 and Reducing Conditions. J.
Mol. Microbiol. Biotechnol. 2002; 4: 263–68.
24.
Next Generation Sequencing-based Parallel Analysis of Melting Kinetics of 4096
Variants of a Bacterial Promoter. Ewa Heyduk and Tomasz Heyduk.
Biochemistry. 2014; 53: 282–92.
25.
Meysman P, Collado-Vides J, Morett E, Viola R, Engelen K, et al. Structural
Properties of Prokaryotic Promoter Regions Correlate with Functional
Features. PLoS ONE 2014; 9
80
26.
www.softberry.com 2016-02-05 kl 1233
27.
www.fruitfly.org 2016-02-05 kl 1234
28.
www.cbs.dtu.dk 2016-02-05 kl 1235
29.
www.biophp.org 2016-02-09 kl 1156
30.
www.idtdna.com 2016-02-10 kl 1300
31.
Luitpold Fried, Jürgen Lassak 1, Kirsten J. A comprehensive toolbox for the rapid
construction of lacZ fusion reporters. Journal of Microbiological Methods 2012; 91:
537–43
32.
Fiona A. Marshall, Sarah L. Messenger, Neil R. Wyborn, et al.
A novel promoter architecture for microaerobic activation by the anaerobic
transcription factor FNR. Molecular Microbiology 2001; 39: 747-53
81
Appendix
Tabell AI: Visar b-Galaktosidas aktiviteten utryckt i Miller units under aeroba förhållanden för E.coli XL1-BLUE och RM 101
tillsammans med reaktionsparametrarna för: andel volym celler, reaktionstid, ursprunglig celldensitet, absorbansvärden vid 420 nm,
absorbansvärden som korrektionsfaktor vid 550 nm.
Beta galaktosidas mätning: Aerobt förhållande
Cell prov
E.coli XL1-BLUE
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
Plasmid
pBBR1-MCS4-LacZ
-
Volym [ml]
Tid [min]
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
OD
15
15
15
15
15
15
15
15
15
5,5
5,5
5,5
7,23
7,258
7,341
6
6
6
5
5
5
5
5
5
7
7
7
7
7
7
15
15
15
10
10
10
10
10
10
5
5
5
5
5
5
5
A420
0,73
0,73
0,73
0,69
0,69
0,69
0,58
0,58
0,58
0,67
0,67
0,67
0,56
0,56
0,56
0,72
0,72
0,72
0,82
0,82
0,82
0,72
0,72
0,72
0,53
0,53
0,53
0,58
0,58
0,58
0,64
0,64
0,64
0,62
0,62
0,62
0,71
0,71
0,71
0,66
0,66
0,66
0,46
0,46
0,46
0,67
A550
0,81
1,256
1,061
1,172
1,13
1,105
0,99
1,1
0,915
0,989
0,957
0,924
0,831
0,971
0,878
0,893
0,921
0,901
1,338
1,291
1,152
1,013
1,143
1,01
0,681
0,639
0,639
0,75
0,717
0,624
0,753
0,84
0,72
0,791
0,735
0,765
0,832
0,843
0,867
0,889
1,086
0,971
0,438
0,519
0,5
0,818
Uttryck [Miller units]
0,403
0,398
0,372
0,41
0,411
0,42
0,354
0,377
0,325
0,449
0,453
0,425
0,33
0,356
0,348
0,35
0,359
0,341
0,634
0,637
0,527
0,467
0,554
0,462
0,337
0,332
0,34
0,385
0,443
0,378
0,401
0,451
0,384
0,423
0,393
0,418
0,434
0,449
0,46
0,462
0,585
0,531
0,22
0,259
0,25
0,446
19,1
102,2
74,9
87,8
79,4
71,5
85,2
101,2
79,6
110,3
89,1
97,8
125,2
171,2
130,9
129,9
135,5
140,9
111,5
86,0
112,1
108,8
96,4
111,9
49,2
31,3
23,7
37,6
-28,7
-18,5
10,7
10,6
10,0
16,4
15,2
10,8
20,4
16,1
17,5
48,8
37,7
25,3
46,1
57,2
54,3
22,4
82
172 bp insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
-
0,5
5
0,67
0,671
0,342
43,3
-
0,5
7
0,67
0,71
0,388
13,2
-
0,5
7
0,67
0,69
0,384
7,7
-
0,5
7
0,67
0,732
0,4
13,6
-
0,5
7
0,54
0,742
0,407
15,7
-
0,5
7
0,54
0,763
0,402
31,5
-
0,5
7
0,54
0,703
0,374
25,7
-
0,5
15
0,68
0,889
0,499
3,1
-
0,5
15
0,68
0,783
0,424
8,0
-
0,5
15
0,68
0,82
0,46
2,9
-
0,5
10
0,74
0,989
0,538
12,8
-
0,5
10
0,74
0,896
0,482
14,2
-
0,5
10
0,74
1,042
0,577
8,7
-
0,6
5
0,51
0,881
0,432
81,7
-
0,6
5
0,51
0,831
0,44
39,9
-
0,6
5
0,51
0,78
0,413
37,4
-
0,6
5,25
0,53
0,836
0,432
47,9
-
0,6
5,2167
0,53
0,64
0,326
41,9
-
0,6
5,3333333
0,53
0,713
0,357
52,0
-
0,6
5
0,67
0,827
0,44
28,4
-
0,6
5
0,67
0,881
0,468
30,8
-
0,6
5
0,67
0,745
0,38
39,8
-
0,6
5
0,69
0,999
0,544
22,7
-
0,6
5
0,69
0,895
0,48
26,6
-
0,6
5
0,69
0,94
0,505
27,2
-
0,6
4
0,76
1,067
0,588
20,8
-
0,6
4
0,76
1,233 -
-
0,6
4
0,76
1,022
#VÄRDE!
0,551
31,7
83
E.coli RM 101
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
189 bp insert
utan FNR
189 bp insert
utan FNR
189 bp insert
utan FNR
189 bp insert
utan FNR
189 bp insert
utan FNR
189 bp insert
utan FNR
189 bp insert
utan FNR
189 bp insert
utan FNR
189 bp insert
utan FNR
172 bp insert
utan FNR
172 bp insert
utan FNR
172 bp insert
utan FNR
172 bp insert
utan FNR
172 bp insert
utan FNR
172 bp insert
utan FNR
172 bp insert
utan FNR
172 bp insert
utan FNR
pBBR1-MCS4-LacZ
pBR322
-
0,5
20
0,92
0,469
0,053
40,9
-
0,5
20
0,92
0,507
0,067
42,4
-
0,5
20
0,92
0,498
0,057
43,3
-
0,5
32
0,56
0,383
0,035
35,9
-
0,5
32
0,56
0,439
0,051
39,0
-
0,5
32
0,56
0,435
0,044
40,0
-
0,5
36
0,46
0,35
0,033
35,3
-
0,5
36
0,46
0,395
0,048
37,6
-
0,5
36
0,46
0,369
0,036
37,0
-
0,5
28
0,91
0,17
0,022
10,3
-
0,5
28
0,91
0,198
0,044
9,5
-
0,5
28
0,91
0,173
0,019
11,0
-
0,5
32
0,65
0,207
0,053
11,0
-
0,5
32
0,65
0,229
0,067
10,7
-
0,5
32
0,65
0,227
0,066
10,7
-
0,5
36
0,47
0,18
0,035
14,0
-
0,5
36
0,47
0,14
0,025
11,4
-
0,5
36
0,47
0,171
0,033
13,4
-
0,5
23,33
0,78
0,331
0,026
31,4
-
0,5
23,33
0,78
0,357
0,034
32,7
-
0,5
23,33
0,78
0,377
0,043
33,2
-
0,5
32
0,44
0,302
0,054
29,5
-
0,5
32
0,44
0,325
0,061
31,0
-
0,5
32
0,44
0,315
0,015
41,0
-
0,5
37
0,47
0,304
0,039
27,1
-
0,5
36
0,47
0,326
0,044
29,4
-
0,5
36
0,47
0,331
0,048
29,2
-
0,5
29
0,85
0,175
0,035
9,2
-
0,5
29
0,85
0,178
0,033
9,8
-
0,5
29
0,85
0,177
0,031
10,0
-
0,5
40
0,51
0,23
0,074
9,9
-
0,5
40
0,51
0,24
0,077
10,3
-
0,5
40
0,51
0,219
0,063
10,7
-
0,5
41
0,42
0,173
0,035
13,0
-
0,5
41
0,42
0,236
0,072
12,8
84
172 bp insert
utan FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
-
0,5
41
0,42
0,186
0,046
12,3
-
0,6
29
0,8
0,198
0,054
7,4
-
0,6
29
0,8
0,208
0,056
7,9
-
0,6
29
0,8
0,201
0,053
7,8
-
0,6
40
0,61
0,258
0,087
7,2
-
0,6
40
0,61
0,196
0,05
7,4
-
0,6
40
0,61
0,215
0,06
7,5
-
0,6
41
0,49
0,176
0,034
9,7
-
0,6
41
0,49
0,214
0,054
9,9
-
0,6
41
0,49
0,198
0,045
9,9
-
0,6
29
0,86
0,187
0,047
7,0
-
0,6
29
0,86
0,178
0,038
7,5
-
0,6
29
0,86
0,175
0,036
7,5
-
0,6
40
0,5
0,209
0,053
9,7
-
0,6
40
0,5
0,216
0,058
9,5
-
0,6
40
0,5
0,222
0,067
8,7
-
0,6
41
0,43
0,206
0,051
11,0
-
0,6
41
0,43
0,199
0,045
11,4
-
0,6
41
0,43
0,199
0,049
10,7
85
Tabell AII: Visar b-Galaktosidas aktiviteten utryckt i Miller units under anaeroba förhållanden för E.coli XL1-BLUE och RM 101
tillsammans med reaktionsparametrarna för: andel volym celler, reaktionstid, ursprunglig celldensitet, absorbansvärden vid 420 nm,
absorbansvärden som korrektionsfaktor vid 550 nm.
Beta galaktosidas mätning: Anaerobt förhållande
Cell prov
E.coli XL1-BLUE
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
189 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
172 bp insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Plasmid
pBBR1-MCS4-LacZ
-
Volym [ml]
Tid [min]
OD
A420
A550
Uttryck [Miller units]
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
6
6
6
4
4
4
5,9167
5,9167
5,9167
4
4
4
5,25
5,25
5,25
5
5
5
14
14
14
9
9
9
8,5
8,5
8,5
5
5
5
5
5
5
4
4
4
0,4
0,4
0,4
0,33
0,33
0,33
0,35
0,35
0,35
0,35
0,35
0,35
0,38
0,38
0,38
0,36
0,36
0,36
0,35
0,35
0,35
0,33
0,33
0,33
0,35
0,35
0,35
0,34
0,34
0,34
0,35
0,35
0,35
0,38
0,38
0,38
1,012
1,041
0,908
0,958
0,87
0,741
0,885
0,741
0,744
0,66
0,649
0,603
0,878
0,895
0,917
0,757
0,85
1,085
0,542
0,575
0,583
0,579
0,566
0,616
0,564
0,549
0,567
0,722
0,721
0,751
0,551
0,54
0,533
0,634
0,572
0,552
0,415
0,424
0,442
0,271
0,29
0,297
0,281
0,281
0,252
0,243
0,248
0,215
0,341
0,334
0,345
0,299
0,324
0,305
0,296
0,318
0,345
0,306
0,301
0,328
0,285
0,279
0,288
0,375
0,375
0,39
0,279
0,274
0,271
0,337
0,295
0,287
238,1
249,2
112,1
733,0
549,2
335,2
379,8
240,7
292,6
335,4
307,1
323,9
282,0
311,3
314,0
259,7
314,4
612,5
9,8
7,6
-8,5
29,3
26,4
28,3
43,9
40,8
42,4
77,4
76,2
80,6
71,7
69,1
67,1
58,2
73,4
65,5
-
0,5
14
0,33
0,636
0,372
-6,5
-
0,5
14
0,33
0,548
0,281
24,4
-
0,5
14
0,33
0,557
0,287
23,7
-
0,5
8,5
0,35
0,566
0,281
49,9
-
0,5
8,5
0,35
0,547
0,281
37,1
-
0,5
8,5
0,35
0,589
0,305
37,1
86
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
Bakgrundsplasmid
utan insert
E.coli RM 101
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
-
0,6
5
0,39
0,726
0,377
56,6
-
0,6
5
0,39
0,722
0,389
35,3
-
0,6
5
0,39
0,744
0,387
57,1
-
0,6
4,9167
0,35
0,697
0,36
64,9
-
0,6
4,9167
0,35
0,654
0,332
70,7
-
0,6
4,9167
0,35
0,685
0,357
58,4
-
0,6 -
0,38 -
-
#VÄRDE!
-
0,6 -
0,38 -
-
#VÄRDE!
-
0,6 -
0,38 -
-
#VÄRDE!
-
0,6
5
0,31
0,609
0,319
54,6
-
0,6
5
0,31
0,559
0,289
57,3
-
0,6
5
0,31
0,55
0,284
57,0
-
0,6
5
0,33
0,651
0,345
47,7
-
0,6
5
0,33
0,58
0,3
55,6
pBBR1-MCS4-LacZ
pBR322
0,6
5
0,33
0,603
0,316
50,5
-
0,5
29
0,31
0,56
0,028
113,7
-
0,5
29
0,31
0,671
0,027
138,8
-
0,5
29
0,31
0,597
0,02
125,0
-
0,5
34
0,3
0,555
0,022
101,3
-
0,5
34
0,3
0,53
0,025
95,3
-
0,5
34
0,3
0,531
0,02
97,3
-
0,5
33
0,31
0,522
0,02
95,2
-
0,5
33
0,31
0,504
0,021
91,3
-
0,5
33
0,31
0,483
0,019
87,9
-
0,5
22
0,33
0,292
0,017
72,2
87
189 bp insert
med FNR
189 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
172 bp insert
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
med FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
Bakgrundsplasmider
utan FNR
-
0,5
22
0,33
0,432
0,019
109,8
-
0,5
22
0,33
0,474
0,021
120,5
-
0,5
41
0,34
0,189
0,02
22,1
-
0,5
41
0,34
0,17
0,025
18,1
-
0,5
41
0,34
0,18
0,03
18,3
-
0,5
34
0,31
0,165
0,019
25,0
-
0,5
34
0,31
0,151
0,018
22,7
-
0,5
34
0,31
0,148
0,023
20,4
-
0,5
33
0,3
0,166
0,032
22,2
-
0,5
33
0,3
0,158
0,021
24,5
-
0,5
33
0,3
0,152
0,017
24,7
-
0,5
22
0,31
0,163
0,04
27,3
-
0,5
22
0,31
0,135
0,017
30,9
-
0,5
22
0,31
0,163
0,048
23,2
-
0,6
47
0,32
0,17
0,028
13,4
-
0,6
47
0,32
0,163
0,025
13,2
-
0,6
47
0,32
0,165
0,029
12,7
-
0,6
34
0,35
0,158
0,023
16,5
-
0,6
34
0,35
0,166
0,028
16,4
-
0,6
34
0,35
0,171
0,017
19,8
-
0,6
33
0,36
0,2
0,053
15,0
-
0,6
33
0,36
0,188
0,038
17,0
-
0,6
33
0,36
0,198
0,046
16,5
-
0,6
22
0,36
0,158
0,025
24,0
-
0,6
22
0,36
0,158
0,024
24,4
-
0,6
22
0,36
0,156
0,025
23,6
-
0,6
47
0,18
0,178
0,031
24,4
-
0,6
47
0,18
0,148
0,018
23,0
-
0,6
47
0,18
0,147
0,018
22,8
-
0,6
34
0,21
0,15
0,02
26,8
-
0,6
34
0,21
0,152
0,019
27,7
-
0,6
34
0,21
0,161
0,024
27,8
0,6
33
0,19
0,161
0,018
34,4
0,6
33
0,19
0,149
0,017
31,7
0,6
33
0,19
0,151
0,018
31,8
0,6
22
0,21
0,177
0,043
36,7
0,6
22
0,21
0,153
0,018
43,8
0,6
22
0,21
0,15
0,018
42,7
88