Gula boken / RAM hemsida
1(7)
Pneumocystis jiroveci pneumonia (PCP)
Victor Fernandez, Smittskyddsinstitutet, 060403.
Smittämnet
Pneumocystis jiroveci (tidigare P. carinii) är en atypisk svamp som infekterar
lungorna hos människa [Wakefield, 2002]. Molekylära studier har visat att det finns
olika Pneumocystis arter var och en infekterande en specifik mammalievärdorganism
[Demanche et al, 2001]. Livscykeln hos Pneumocystis tillväxtstadier antas innehålla
en asexuell form och en sexuell övergångsform. Alla kända tillväxtstadier återfinns i
värdorganismens lungalveoler och inkluderar en amöboid mononuklerad trofozoit, en
precysta och en mogen cysta som innehåller intracystiska kroppar (sporer) som kan
utvecklas till trofozoiter. En systematisk analys av livscykeln har inte kunnat
genomföras eftersom det inte är möjligt att odla organismen in vitro.
Patogenes och patofysiologi
Patogenesmekanismerna för pneumocystos är inte kända. Förmodligen överförs
smitta genom inhalation av cystor från omgivningen. Intracystiska kroppar utsöndras
sedan i lungalveolerna där de utvecklas till trofozoiter som selektivt binder till typ I
pneumocyter. Denna kolonisation av alveolärt endotel leder till en reducerad halt av
protein med ytspänningsnedsättande egenskaper och till förändringar i den lokala cellpopulationen inklusive en reduktion av antalet alveolära makrofager, nekros av typ I
pneumocyter och tillväxt av typ II pneumocyter. Ytterligare konsekvenser av
framskriden infektion är skador på den alveokapillära barriären, pulmonärt ödem samt
grava störningar av gasutbytet i lungorna.
Symtom och klinisk bild (pneumoni)
P. jiroveci-infektioner, även kallade pneumocystoser, manifesterar sig i tre olika
kliniska varianter: 1) den infantila eller interstitiella plasmacellspneumonin som
återfinns främst hos prematurt födda eller undernärda barn. 2) pneumoni hos
individer med nedsatt immunförsvar som t.ex. aids-patienter, transplantations
patienter eller patienter som genomgår kemoterapi. 3) en sällan förekommande
extrapulmonell eller disseminerad form.
Subklinisk kolonisation av lungalveoler är vanligt förekommande.
Typiska symtom innefattar torrhosta, feber, viktminskning, frossa, bröstsmärta,
progressiv dyspne och cyanos. Även om sjukdomsförloppet kan vara snabbt utvecklas
symtomen normalt gradvis och kan förekomma flera månader innan diagnosen kan
fastställas. Radiologiskt karakteriseras Pneumocystis pneumoni (PCP) av bilaterala
diffusa eller interstitiella infiltrat som kan liknas vid “krossat glas”. Det är mycket
ovanligt att P. jiroveci-infektioner ger extrapulmonära manifestationer.
Epidemiologi och prevention
P. jiroveci är vanligt förekommande och i de flesta fall har barn exponerats vid tre till
fyra års ålder. Även om teorier som postulerar att sjukdomen orsakas av aktivering av
en latent infektion har förekommit sedan länge visar nya data att återinfektion är en
vanlig företeelse [Morris et al, 2002]. Studier med känslig PCR-baserad detektion ger
vid handen att exponering av immunkompetenta vuxna resulterar i en kortvarig
kolonisation eller subklinisk infektion [Sing et al, 1999]. Sjukdomen överförs troligen
som luftburen smitta [Olsson et al, 1998]. Samlade data tyder dels på att person till
Gula boken / RAM hemsida
2(7)
person smitta lär äga rum dels så att späd- och småbarn kan utgöra tillfälliga
reservoarer [Pifer et al, 1978; Lundgren et al, 1997]. Det är inte känd huruvida en
omgivningsreservoar existerar.
Profylax har reducerat incidensen av PCP. De vanligaste preparaten vid prevention är
trimethoprim-sulfamethoxazole (peroralt) som förstavalsalternativ och nebuliserad
pentamidine.
Provtagning och transport
Ett flertal provmaterial från bronksköljvätska till munsköljvätska kan användas för
Pneumocystis-diagnostik. Diagnostikens känslighet är avhänglig av hur representativt
provmaterialet är. Generellt gäller därför att ett så representativt provmaterial (med
förekomst av alveolärmakrofager) som möjligt bör eftersträvas.
Provtagning
Bronksköljvätska (BAL)
Bronksköljvätska är det mest representativa provmaterialet. Vid bronkoskopi erhålls
BAL genom sköljning med ca 200 mL kroppstempererad fysiologisk koksaltlösning i
portioner om ca 50 mL. BAL kan även erhållas från intuberade patienter utan
bronkoskopi. För Pneumocystis-analys erfordras 5-10 mL BAL.
Sputum
Inducerat sputum (inhalationsinducerat)
Ett alternativ till BAL är sputum som erhålles efter 10-20 min inandning av
nebuliserad 3 % koksaltlösning. Patienten bör undvika fast föda före provtagning.
Patienten bör borsta tänder (utan tandkräm), tunga och munhålans slemhinnor samt
gurgla och snyta sig före provtagningen.
Ej inducerat sputum
Vanligt sputumprov, helst taget med hjälp av sjukgymnast, kan användas för
Pneumocystis-diagnostik, men provmaterialet är vanligen mindre representativt än
inducerat sputum eller BAL.
Övrigt provmaterial från luftvägar
I de fall varken bronksköljvätska eller sputum kan erhållas, t.ex. från små barn,
patienter med blödningsbenägenhet och trakeostomerade patienter, kan trakealsekret,
nasofarynxsekret eller munsköljvätska användas. För tillräcklig analytisk känslighet
krävs PCR-analys för dessa material.
Lungvävnad
Pneumocystis kan också påvisas i vävnadsprov från lungorna. Biopsin läggs i
fysiologisk koksaltlösning.
Transport
Samtliga prov transporteras i tättslutande rör/burk med ytterhylsa. Kyl eller
frystransport erfordras ej.
Gula boken / RAM hemsida
3(7)
Laboratoriediagnostik
Allmänt
Som förstahandsmetod för påvisning av Pneumocystis rekommenderas BAL-prov
kombinerad med immunmorfologi. PCR är känsligare än immunmorfologi och kan
rekommenderas som förstahandsmetod när invasiv provtagningsteknik ej kan
användas.
Referensmetodik
Immunmorfologi – infärgning med monoklonal antikropp.
Ett flertal kommersiella kit för immunmorfologisk diagnostik finns på marknaden.
Meridian: MeriFluor® Pneumocystis artikelnr 250050
Biorad: Monofluo Pneumocystis carinii IFA Test kit art nr 32515
Båda dessa kit innehåller direktkonjugerade monoklonala antikroppar som färgar in
både trofozoit och cyststadium. Detaljerade instruktioner medföljer varje kit.
Känsligheten för cystpåvisning är god men vissa svårigheter att känna igen trofozoiter
föreligger och tillverkarna rekommenderar endast positivt svar vid cystpåvisning.
Vid SMI används en indirekt immunmorfologisk metod som innefattar flera olika steg
och är arbets- och tidskrävande [Elvin et al, 1988]. Den har visat hög specificitet och
sensitivitet jämfört med andra immunmorfologiska metoder. På grund av metodens
komplexitet rekommenderar vi den ej som rutinmetod på mikrobiologiska
laboratorier. Den rekommenderas dock som referensmetod för validering av andra
metoder.
Resistensbestämning och resistensutveckling
Sulfaderivat med antifolataktivitet har varit de viktigaste preparaten för terapi och
profylax av PCP under de senaste 30 åren. Utveckling av resistens mot sulfa hos P.
jiroveci har postulerats genom de specifika förändringar som har hittats i genen som
kodar för dihydropteroatsyntas (DHPS) som är det enzym i folsyracykeln som
inhiberas av sulfapreparat. Sulfaresistens som förorsakas av mutationer i dhps-genen
är vanligt förekommande hos både patogena bakterier och protozoer. Mutationer som
ger förändringar i kodon 55 och 57 i P. jiroveciis dhps-gen kan korreleras med
misslyckad profylax och behandling av PCP [Helweg-Larsen et al, 1999; Takahashi et
al, 2000]. Antibiotikaresistens kan inte fastställas på konventionellt sätt eftersom det
inte går att odla P. jiroveci in vitro.
Epidemiologisk typning
Konventionella metoder som t.ex. serotypning har inte kunnat användas för att
differentiera isolat av P. jirovecii. All nuvarande typning är baserad på
genetiskapolymorfismer i ett flertal loci inkluderande mitokondriella rRNA-gener
(mtSSU och mtLSU), ITS1 och ITS2 i det nukleära rDNA och, bland andra, aromlokuset. För närvarande tycks analys av ITS1- och ITS2-regionerna med fler än 70
olika identifierade genotyper vara mest informativt för att påvisa biovariation hos P.
jiroveci [Lee et al, 1998].
Gula boken / RAM hemsida
4(7)
Alternativ diagnostik
PCR
Användning av PCR för påvisning av Pneumocystis DNA är ett område under
ständigt utveckling men metoden rekommenderas endast som ett andrahandsalternativ
för detektion av Pneumocystis i BAL och inducerat sputum (immunomorfologi är
förstahandsval). Däremot är PCR att föredra i kliniska prover med lägre diagnostiskt
utbyte, t.ex. icke-inducerat sputum, trakealsekret, nasofarynxsekret eller
munsköljvätska.
Ett antal PCR-baserade metoder för detektion av Pneumocystis har beskrivits som
använder olika DNA sekvenser för amplifiering, t.ex. mitokondriellt DNA som kodar
för ribosomalt RNA (rRNA) eller MSG (Major Surface Glycoprotein) DNA
[Wakefield et al, 1991; Huang et al, 1999]. Studier av dessa metoder har påvisat en
högre känslighet för detektion av P. jiroveci jämfört med histokemisk färgning och
immunomorfologi i BAL och även i icke-invasivt provmaterial. Den högre
känsligheten hos PCR har inte bara medfört att P. jiroveci kan påvisas tidigt i kliniska
infektioner utan också hos patienter som aldrig utvecklar PCP (upp till 20% av
fallen). Det senare tyder på en asymptomatisk kolonisering av vissa individer som kan
agera som bärare av smittämnet/sjukdomen. Behandling av dessa patienter med en
positiv PCR-reaktion i BAL eller inducerat sputum men med negativ
immunomorfologi är en kontroversiell fråga men en uppföljning av dessa individer
rekommenderas.
Vid SMI används för närvarande för diagnostik en s k nested PCR-metod i två steg,
baserad på amplifiering av den mitokondriella genen för den stora subenheten av
rRNA. Alla prov oavsett begäran om PCR, analyseras på SMI först med
immunmorfologi. PCR-metoden används sedan som ett känsligare komplement. På
provsvaret anges alltid att påvisning av P. jiroveci DNA med negativ
immunomorfologi kan tyda på en begynnande klinisk PCP eller en temporärt
subklinisk kolonisation.
Utvecklingen av realtids-PCR under senare år har öppnat möjligheten att direkt
kvantifiera P. jiroveci i kliniskt provmaterial. Detta gör det möjligt att mer objektivt
skilja på asymptomatisk kolonisation och PCP.
Histokemiska metoder
Traditionellt har histokemiska färgningsmetoder använts för påvisning av
Pneumocystis. Dessa färgmetoder är relativt enkla och kräver ingen avancerad
utrustning. De har dock låg känslighet jämfört med infärgning med monoklonal
antikropp eller PCR.
Giemsafärgning
Enkel och snabb metod med låg känslighet då endast trofozoiter och sporozoiterna
inuti cystorna färgas. Kräver BAL av hög kvalitet och mycket erfaren avläsare.
Toluidine blue O färgning
Metod som endast färgar cystor. Problematisk eftersom andra svampar (främst
Candida) också färgas in och kan vara svåra att differentiera från Pneumocystis
[Gosey et al, 1985].
Gula boken / RAM hemsida
5(7)
Silverfärgning - Grocottfärgning
Svampfärgningsmetod som används på patologilaboratorier [Grocott, 1955].
Begränsningar som vid Toluidine blue O färgning.
Calcofluor white (Fungiflour, Polysciences Inc., Warrington, Pa)
Färgar kitin i cystväggen [Stratton et al, 1991]. Kräver UV mikroskop.
Kvalitetskontroll
Internkontroll - Immunmorfologi
Positiv kontroll från humanmaterial innehållande Pneumocystis färgas vid varje
analystillfälle. För prepareringen av positiv kontroll vid immunmorfologi se kitbeskrivning.
Internkontroll - PCR
Pneumocystis DNA från humanmaterial ingår vid varje analystillfälle.
Externkontroll
Inga externa kvalitetsprogram för Pneumocystis immunmorfologi eller PCR finns
tillgängliga. Nationella eller internationella provningsjämförelser rekommenderas.
Svarsrutiner
Immunmorfologi
Cystor/trofozoiter av Pneumocystis jiroveci påvisade/ej påvisade
PCR
Pneumocystis jiroveci DNA påvisade/ej påvisade.
Laboratorierapportering
Pneumocystis är ej anmälnigspliktig enligt smittskyddslagen.
Gula boken / RAM hemsida
6(7)
References
Demanche C, Berthelemy M, Petit T, Polack B, Wakefield AE, Dei-Cas E, Guillot J.
Phylogeny of Pneumocystis carinii from 18 primate species confirms host specificity
and suggests coevolution. J Clin Microbiol 39:2126-2133 (2001).
Elvin KM, Bjorkman A, Linder E, Heurlin N, Hjerpe A. Pneumocystis carinii
pneumonia: detection of parasites in sputum and bronchoalveolar lavage fluid by
monoclonal antibodies. British Med J 297:381-384 (1988).
Gosey LL, Howard RM, Witebsky FG, Ognibene FP, Wu TC, Gill VJ, MacLowry
JD. Advantages of a modified toluidine blue O stain and bronchoalveolar lavage for
the diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. J Clin Microbiol 22:803-807
(1985).
Grocott RG. A stain for fungi in tissue sections and smears using Gomori's
methenamine-silver nitrate technic. Am J Clin Pathol 25:975-979 (1955).
Helweg-Larsen J, Benfield TL, Eugen-Olsen J, Lundgren JD, Lundgren B. Effects of
mutations in Pneumocystis carinii dihydropteroate synthase gene on outcome of
AIDS-associated P. carinii pneumonia. Lancet 354:1347-1351 (1999).
Huang SN, Fischer SH, O'Shaughnessy E, Gill VJ, Masur H, Kovacs JA.
Development of a PCR assay for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia based
on amplification of the multicopy major surface glycoprotein gene family. Diagn
Microbiol Infect Dis 35:27-32 (1999).
Lee CH, Helweg-Larsen J, Tang X, Jin S, Li B, Bartlett MS, Lu JJ, Lundgren B,
Lundgren JD, Olsson M, Lucas SB, Roux P, Cargnel A, Atzori C, Matos O, Smith
JW. Update on Pneumocystis carinii f. sp. hominis typing based on nucleotide
sequence variations in internal transcribed spacer regions of rRNA genes. J Clin
Microbiol 36:734-741 (1998).
Lundgren B, Elvin K, Rothman LP, Ljungstrom I, Lidman C, Lundgren JD.
Transmission of Pneumocystis carinii from patients to hospital staff. Thorax 52:422424 (1997).
Morris A, Beard CB, Huang L. Update on the epidemiology and transmission of
Pneumocystis carinii. Microbes Infect 4:95-103 (2002).
Olsson M, Lidman C, Latouche S, Bjorkman A, Roux P, Linder E, Wahlgren M.
Identification of Pneumocystis carinii f. sp. hominis gene sequences in filtered air in
hospital environments. J Clin Microbiol 36:1737-1740 (1998).
Pifer LL, Hughes WT, Stagno S, Woods D. Pneumocystis carinii infection: evidence
for high prevalence in normal and immunosuppressed children. Pediatrics 61:35-41
(1978).
Gula boken / RAM hemsida
7(7)
Sing A, Roggenkamp A, Autenrieth IB, Heesemann J. Pneumocystis carinii carriage
in immunocompetent patients with primary pulmonary disorders as detected by single
or nested PCR. J Clin Microbiol 37:3409-3410 (1999).
Stratton N, Hryniewicki J, Aarnaes SL, Tan G, de la Maza LM, Peterson EM.
Comparison of monoclonal antibody and calcofluor white stains for the detection of
Pneumocystis carinii from respiratory specimens. J Clin Microbiol 29:645-647
(1991).
Takahashi T, Hosoya N, Endo T, Nakamura T, Sakashita H, Kimura K, Ohnishi K,
Nakamura Y, Iwamoto A. Relationship between mutations in dihydropteroate
synthase of Pneumocystis carinii f. sp. hominis isolates in Japan and resistance to
sulfonamide therapy. J Clin Microbiol 38:3161-3164 (2000).
Wakefield AE, Guiver L, Miller RF, Hopkin JM. DNA amplification on induced
sputum samples for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. Lancet 337:13781379 (1991).
Wakefield AE. Pneumocystis carinii. Br Med Bull 61:175-188 (2002).
